Midgestation Fare Embryolarının Alt Rombik Dudak in vitro Elektroporasyon yılında

Bu prosedürün genel amacı, daha erken gestasyonel zaman noktalarında elektroporasyon yoluyla plazmit DNA girişi sağlayarak embriyonik arka beyin progenitörlerinde gen ekspresyonunu manipüle etmektir. Bu işlem, öncelikle gestasyonun 11,5. günündeki embriyoların izole edilmesi ve steril fosfat tamponlu saline içinde dorsal tarafları yukarı gelecek şekilde yönlendirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, 0,01% fast green içerisindeki ekspresyon plazmitinden yaklaşık 50 µL enjekte etmektir.

Başarılı bir enjeksiyonda, ventriküler sistemin tamamı DNA fast green karışımı ile dolacaktır. Ardından, embriyo bir elektrik pulsuna tabi tutulur. Embriyonun pozitif yüklü elektroda en yakın olan tarafı plazmid DNA'yı alacaktır.

Diğer taraf internal negatif kontrol olarak hizmet edecektir. Son adım, embriyoların en az 24 saat boyunca doku kültürüne yerleştirilmesidir. Nihayetinde, elektropore edilmiş gen 24 saatlik kültürden sonra eksprese olacak ve immünohistokimya ile değerlendirilebilecektir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre avantajı, embriyonik arka beyin progenitörlerinin daha erken gestasyonel zaman noktalarında manipülasyonunun mümkün olmasıdır. Bu yöntem, farklı nöral genlerin embriyonik progenitörlerin kaderini nasıl etkileyebileceği gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre, diseksiyon araçlarını ve laminer akışlı kabini beraberindeki makaleye uygun olarak sterilize ederek başlayın.

Embriyoları toplamak için, gestasyonel gün E 11.5'te olan ve yavrular taşıyan ötanize edilmiş dişi bir fareyi çeker ocak içerisindeki diseksiyon tepsisine yerleştirin. Ardından, farenin abdomenini %70 etanol ile püskürterek sterilize edin. Peritonal boşluğu açın ve duvarları diseksiyon tepsisine iğneleyin.

Ardından, periton boşluğuna yerleşecek şekilde uterus boynuzlarını dışarı çekin. Cımbız kullanarak uterus boynuzu duvarını dikkatlice açın. Vitellin kesedeki embriyoları plasentadan nazikçe çıkarmak için 20 milimetrelik bir kaşık kullanın.

Ardından, embriyoları 10 mL önceden ısıtılmış steril 1x PBS ile önceden doldurulmuş 100 mm'lik bir doku kültürü kabına yerleştirin. Bu adımda, ilk embriyoyu 37 °C'ye önceden ısıtılmış 10 mL steril 1x PBS ile önceden doldurulmuş yeni bir 100 mm'lik kaba aktarın.

Ardından, vitellus kesesini dikkatlice çıkarıp atın. Sonra embriyoyu, dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Embriyoyu bir diseksiyon mikroskobu altında yedi milimetrelik elektrot pedleri ile nazikçe tutun.

Elektrotları, arka beyin dördüncü ventrikül seviyesinde nöral tüpün her iki yanına yerleştirin. Ardından, plazmid DNA ve %0,01 Fast screen karışımını çekmek için bir cc'lik şırınga kullanın; genel olarak, karışımın 500 microliters'ı en az sekiz ila 10 embriyonun elektroporasyonu için yeterli olmalıdır. Daha sonra, bir cc'lik şırıngaya takılı 25 gauge beş sekizlik bir tuberkulin iğnesi ile dördüncü ventrikülün üzerinde yer alan tavan plağını nazikçe delin.

Ardından, ventriküle yaklaşık 50 microliters DNA DI karışımı enjekte edin. Başarılı enjeksiyonlar, DNA DI karışımının tüm ventriküler sistemi doldurmasıyla karakterize edilir. DNA DI karışımını iletmenin alternatif bir yolu, orta beynin üzerindeki vellum'u delerek ventriküler sisteme erişmek, ardından puls jeneratörünü açmak ve bir elektrot puls jeneratörü ile yedi millimeter elektrot pedlerini kullanarak, pozitif yüklü elektroda en yakın dokuya beş kare puls iletmek olacaktır.

Plazmid alınırken bir laminar akış kabininde, 12 kuyucuklu bir kültür kabının kuyucuklarını %10 fetal bovine serum, %5 equine serum, %1 glutamine ve %1 penicillin streptomycin ile takviye edilmiş ve 37 °C'ye önceden ısıtılmış iki mililitre DME MF 12 besiyeri ile doldurun. Ardından embriyoyu orta kısmından bir pensle sıkıştırın. Embriyonun posterior kısmını çıkardıktan sonra, anterior kısmını kültür kabının dolu kuyucuklarından birine yerleştirin.

İşlemi tüm embriyolar için tekrarlayın ve 12 kuyucuklu plakanın sadece dış kuyucuklarını doldurun. Kültürlerin kontaminasyonunu önlemek için, elektropore edilen plazmidin eksprese olması amacıyla embriyoları %5 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde 24 saat boyunca kültüre edin. Daha uzun bir kültür süresi istenirse, yeni bir 12 kuyucuklu plakanın kuyucuklarını 2 mL D-M-E-M-F 12 medyum ile doldurun.

Embriyoları steril bir kaşıkla yeni bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Ardından, embriyoları analiz için sabitlemek amacıyla tekrar 37 °C'lik inkübatöre yerleştirin ve 48 saate kadar kültüre edin. 12 kuyucuklu bir plakayı 1x PBS ile doldurun, ardından embriyoları aktarın ve 4 °C'de beş dakika boyunca durulayın.

Ardından, embriyoları 1x PBS içinde %2 paraformaldehit ile dört santigrat derecede iki saat boyunca sabitleyin. Daha sonra embriyoları, dört santigrat derecede 1x PBS ile beşer dakikadan üç kez durulayın. Tekrar, yeni bir 12 kuyucuklu plakayı 1x PBS içinde %30 sükroz ile doldurduktan sonra.

Embriyoları bu kuyucuklara aktarın ve dört derece Celsius'ta gece boyunca dengeye bırakın. Ardından embriyoları, kuru buz etanol banyosu kullanarak optimal kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömün veya eksi 20 derece Celsius'ta saklayın. Son aşamada, embriyoları bir kriyostat ile 30 mikron kalınlığında kesitlere ayırın.

Bunları lamlara monte edin ve uni Histochemical'den gelen -20 °C'de saklayın. Burada gösterilen sonraki çalışma, 24 saatlik kültürden sonra elektropore edilmiş E 11.5 embriyosunun transvers kesitlerinde GFP için yapılan immünohistokimyasal çalışmanın temsili sonuçlarıdır. Burada gösterilen oklar, sekonder antikoru tutan tavan plağını (roof plate) belirtmektedir.

Sonuçlar, alt ROIC dudağının elektropore edilen bölgesinin kısıtlı olduğunu ve nöral tüpün tüm anterior posterior aksına yayılmadığını göstermektedir. Burada, analiz edilen proteinlerden ikisi olan MASH one ve math one'a ait sonuçlar gösterilmektedir. Elektroporasyon ve kültür sonrası embriyoların çoğunluğunun, 11.5'teki kontrol embriyolarla karşılaştırıldığında normal ekspresyon seviyelerini koruduğunu gözlemledik. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde bir ila iki saat içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, fare embriyonik membranının progenitörlerinde gen ekspresyonunu manipüle etmek için in vitro elektroporasyon analizinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.