Name: Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin fare embriyonik kök hücre bakımı ve kendini yenileme süreçlerini düzenleyen genleri Oct4GiP raporlayıcı analiziyle belirlemeyi. Bu hassas yöntem gen fonksiyonlarını hızlıca değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz okuma ve yazma düzenleme için Brad Lackford teşekkür ederim. Bu araştırma, Çevre Sağlığı Bilimleri, Sağlık İntramural Araştırma Programı Z01ES102745 National Institutes (GH) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. Oct4GiP Fare ES Hücre Bakım Oct4GiP hücreleri nazikçe Dr Austin Smith tarafından sağlandı. Onlar bir Oct4-GFPiresPac transgen 4,5 taşıyan 129/Ola farelerden elde edilmiştir. Bunlar ESGRO tam artı klonal dereceli orta (Millipore), ya da M15 ortamda jelatin kaplı doku kültür plakaları içinde muhafaza edilir: DMEM (Invitrogen)% 15 FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x olmayan ile desteklenmiş temel amino asitler (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), ve 10 uM β-merkaptoetanol. <ol><li> 30 dakika için oda sıcaklığında% 0.1 jelatin (Sigma) (0.1 ml jelatin çözeltisi / cm 2) ile kaplamak plakaları. </li><li> Plaka Oct4GiP ~ 2 jelatin kaplı plakalar hücreler x 10 4 / cm 2. </li><li> % 0.05 tripsin ile her iki günde bir hücre bölün. </li></ol> 2. Oct4GiP Hücrelerinde siRNA Transfeksiyon Oct4GiP reporter assay en convenien olduğunuM15 orta veya levha 384-iyi (Corning veya BD) - tly jelatin kaplı düz dipli 96 yürütülmektedir. Genel prosedürü Şekil 1&#39;de belirtilmiştir. <ol><li> siRNA-lipid kompleksleri montaj: <ol><li> 96-kuyucuklu plaklar içinde transfeksiyon için, U-alt siRNA-lipid kompleksler 96-kuyucuklu plaklar araya. </li><li> Her bir yanı içerisinde, 10 ul OptiMem (Invitrogen) ve 0.3 ul lipofektamin 2000 (Invitrogen) karıştırmak ve 5 dk için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Lipid-OptiMem karışımına 5 pmol siRNA ekleyin ve bir 15 dakika daha inkübe edilir. SiRNA: 6ul: yağ oranı 100 pmol olduğunu. </li><li> Bir çok kanallı pipet yardımıyla jelatin kaplı düz alt plaka U-alt plaka OptiMem yılında siRNA-lipid kompleksleri aktarın. </li><li> 384 kuyucuklu plaklar içinde transfeksiyon için, 0.1 ul lipofektamin 2000 ve 10 ul OptiMem içinde 2 pmol siRNA kullanılarak siRNA-lipid kompleksleri hazırlanır. </li></ol></li></ol> Not: nihai konsantrasyon siRNATransfeksiyonlar 50 nm&#39;dir. 3-4 biyolojik yürütmek her siRNA transfeksiyon için çoğaltır. Düz alt jelatin kaplı plaka içine U-alt plaka ve tablet olarak siRNA-lipid kompleksleri ana karışımları ayarlayın. <ol start="2"><li> Oct4GiP hücre kaplama ve transfeksiyon: <ol><li> 96-kuyucuklu plaklar içinde transfeksiyon için, Oct4GiP hücreleri toplamak ve 9 x 10 4 hücre / ml taze M15 ortam içinde yeniden süspanse bunların. </li><li> Ayrıca, bir çok-kanallı pipet kullanılarak her biri için hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin. </li><li> 3-5 kez aşağı yukarı pipeting tarafından iyi öncesi bölünüp siRNA-lipidler kompleksleri ile hücre süspansiyonu karıştırın. Farklı siRNA Transfeksiyonlar için ipuçları değiştirin. </li><li> 384 kuyucuklu plaklar, Pastör pipetiyle Oct4GiP hücrelerinde Transfeksiyon için 6 ila 10 x 4 hücre / ml her oyuğa ve tablet 30 ul hücre süspansiyonu. </li></ol></li></ol> Not: optimum hücre yoğunluğu, genellikle kaplama 3 x 10 5 hücre / cm 2, ancak may dramatik bir hücre büyüme veya canlılığını etkileyen siRNA&#39;lar için daha fazla optimizasyon gerektirir. Düşük yoğunluklu kaplama transfeksiyon sırasında kötü hücre sağkalım yol açacaktır. Yüksek kaplama yoğunluğu yüksek hücre izdiham bağlı farklılaşması nedeniyle yüksek arka yol açacaktır. Eğer 2-4 x 10 5 hücre / cm 2 arasında gerekli test kaplama yoğunluğu. <ol start="3"><li> Orta değişikliği: <ol><li> Çok kanallı aspiratör (Corning) veya vakum değnek (VP-Scientific) kullanılarak eski orta çıkarın. Plakalar altındaki hücreleri çizmemeye dikkatli olun. </li><li> Her gün çok kanallı pipet kullanarak taze ES hücre orta (384-de plaka için 96-plaka ve 30 ul 100 ul) ile hücrelerin besleyin. </li></ol></li></ol> 3. FACS analizi <ol><li> Hücre ayrışma: <ol><li> Dört gün transfeksiyondan sonra, çok kanallı aspiratör (Corning) veya vakum değnek (VP-Bilimsel) kullanarak, orta kaldırın. </li><li> 96 oyuklu plakalar için, 100μ ile bir kez hücreleri durulamal PBS. </li><li> Iyi çok kanallı pipet kullanarak her 25 ul% 0.25 tripsin ekleyin. </li><li> Ara sıra ajitasyon ile 5minutes için oda sıcaklığında inkübe edilir, ve görsel hücrelerin tam dekolmanı sağlamak için kontrol. </li><li> Tripsin inaktive ve tekrarlanan pipetleme tek bir hücre süspansiyonu olarak hücreleri ayırmak için% 10 FCS ile 90 ul PBS ekleyin. </li><li> 384-iyi plakalar için,% 10 FBS ile 30 ul PBS ile 10 ul tripsin ve soğutmadan hücreleri kesmek. </li></ol></li><li> FACS analizi: <ol><li> HTS ünitesi veya diğer benzer donanımlı FACS analizörü (örneğin Accuri veya Intellicyt gibi) ile donatılmış BD LSRII FACS analizörde GFP floresans analiz edin. </li><li> HTS üzerinde yüksek verimlilik modu kullanın ve hücre süspansiyonu 10 ul analiz. 1.0 x 10 4 hücrelere sayısı eşiği ayarlayın. </li><li> Ileri vs yan scatter plot hücreleri yakalamak için PMT voltaj ve eşik ayarlayın. Forw canlı hücre popülasyonu için Kapısıard vs yan scatter plot. </li><li> GFP kanal için bir histogram grafiği oluşturun. Hücrelerinin ~% 10 sahte veya kontrol siRNA-transfekte edilmiş hücrelerde GFP-negatif olarak görünür şekilde GFP kanalda kapısı ayarlanır. </li><li> % Farklılaştırılmış hücreler =% GFP-negatif: Her tedaviden% GFP-negatif hücreleri belirleyin. 2 kuyruklu t-testi kullanılarak deney-kontrol-siRNA transfeksiyonlar arasında% Farklılaştırılmış hücreleri karşılaştırın ve p değerleri &lt;0.01 ile pozitif hit puan. </li></ol></li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Oct4, Nanog ve Sox2 ES hücre kendini yenileme 6,7,9-11 bakımında kritik bir rol oynayan üç gen vardır. Şekil Oct4GiP reporter assay kolaylıkla bu faktörlerin susturmak kaynaklanan farklılaşma tespit edebilen 2 gösteri Oct4GiP ES hücreleri. Şekil 2A ES olarak bakımı yapıldığında Oct4GiP ES hücrelerinin GFP pozitif olduğunu göstermektedir<html> . Şekil 2B hücreleri ileri vs yan dağılım çizim ve kontrolü-ya da-Oct4 siRNA&#39;lar ile transfekte edilmiş hücrelerin Oct4GiP GFP kanalının histogram gösterir. Ölü hücreleri ve enkaz GFP-negatif ve arka plan artacak gibi, ileri vs yan scatter plot canlı hücreler için kapısı gereklidir. Diğer taraftan, mümkün hücre kümeleri dışlamak için ayrımcılık eş her zaman gerekli değildir. Kontrol-siRNA transfekte hücrelerinde, hücrelerin büyük çoğunluğu GFP-pozitif olmalıdır. Bariz GFP-negatif popülasyonları kontrol siRNA transfekte kuyularda varsa, başlangıç ​​Oct4GiP hücreleri veya transfeksiyon prosedürü tehlikeye olabilir ve sonuç yorumlanabilir olmayabilir. Şekil 2C den% Farklılaştırılmış hücreleri (% Farklılaştırılmış hücreleri =% GFP-negatif hücreler) grafik gösterir kontrol, Oct4-, Nanog-ve Sox2-siRNA transfekte hücreler. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1.. Oct4GiP reporter assay Taslağı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> Şekil 2. Oct4GiP reporter assay Nanog, Oct4 veya Sox2 suskunluğu neden ES hücre farklılaşması algılayabilir. A) E14Tg2a (yabani tip, siyah çizgi) ve Oct4GiP (yeşil hat) hücreler FACS analiz edildi. GFP-kanalının histogram Oct4GiP hücreleri GFP-pozitif olduğu. B) Oct4GiP hücreleri Kontrol-ya da-Oct4 siRNA ile 96-kuyucuklu plaklar içinde transfekte edilmiş ve transfeksiyondan FACS 4 gün sonra incelendi gösterir. İleri Transfekte edilmiş hücrelerin GFP-kanalının yan saçılım histogram vs gösterilmiştir. C) Oct4GiP hücreleri ile transfekte edildi Kontrol-,-Nanog, Oct4-, veya-Sox2 siRNA. % Farklılaştırılmış Hücreler% 4 gün transfeksiyondan sonra hücreler GFP-negatif tespit edildi ve + / ortalama olarak çizilmiştir - ortalama standart hata (n = 4).f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+cloning+of+Nanog%2C+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li>
<li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3%2F4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li>
<li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li>
<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yukarıda tarif Oct4GiP reporter assay kantitatif kendini yenileme vs farklılaşma derecesini ölçebilirsiniz. Böyle morfolojisi tabanlı 12 ve proliferasyonu / deneyleri yaşayabilirliği bazlı gibi diğer yöntemler kullanılabilir, ile karşılaştırıldığında, daha yüksek verim ve hassasiyet yanı sıra ES hücresi durumunu daha doğrudan bir ölçüm sunmaktadır. Bu yüzden de, büyük ölçekli ekranlar ve genetik epistasi analizi için son derece uygundur. Nitekim, biz ve diğerleri başarıyla genom RNAi ekranlar 3,8 i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> ESGRO tam artı klonal notu orta </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (Yüksek glukoz 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofektamin 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (serum orta azaltmak) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 units/1ml 7) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (Non-Essential Amino Asitler) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> ES hücre için 100x nükleosidlerin </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-nitelikli fetal sığır serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> Kontrol siRNA: Dharamcon tarafından sentezlenen ateşböceği lusiferaz (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) hedef siRNA dubleks.

fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme regulate genler okumak oct4gip reporter assay

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency ve kendini yenileme embriyonik kök hücreleri iki belirleyici özellikleri (ES hücreleri) vardır. Altta yatan moleküler mekanizmayı anlamak oldukça gelişimsel biyoloji çalışmaları, hastalık modelleme, ilaç keşfi ve rejeneratif tıbbın (1,2 gözden) ES hücrelerin kullanımı kolaylaştıracaktır. ES hücre bakım ve kendini yenileme romanı düzenleyicilerinin belirlenmesi ve tanımlanması hızlandırmak için, kantitatif Oct4GiP hücreleri kullanarak fare 3 ES hücrelerinin kendini yenileme durumunu ölçmek için floresans muhabiri bazlı analiz geliştirdi. Oct4GiP hücreleri 4,5 Oct4 geninin promotor bölgesinin kontrolü altında yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eder. Oct4 farklılaşma 6,7 sırasında ES hücre kendini yenileme için gereklidir ve son derece ES hücreleri ile ifade edilir ve hızlı bir şekilde aşağı düzenlenir. Bunun sonucu olarak, raportör hücrelerinde GFP tanımı ve floresans aslına ilişkilendirenES hücresi kimlik 5 ve floresans-aktive hücre ayırma ile (FACS) analizi yakından tek hücre seviyesinde 3,8 azından hücrelerinin kendini yenileme durumunu kontrol etmek için kullanılabilir. RNAi ile birleştiğinde, Oct4GiP reporter assay hızlı ES hücre bakım ve kendini yenileme 3,8 regülatörleri belirlemek ve incelemek için kullanılabilir. Kendini yenileme içlin diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, daha fazla, uygun duyarlı, kantitatif, ve daha düşük maliyetli taşımaktadır. Bu tür yüksek verimli ekranlar veya genetik epistasi analiz gibi büyük ölçekli çalışmalar için veya plakaları 384-iyi - 96 yapılabilir. Son olarak, diğer soy özel muhabiri ES hücre hatları kullanılarak, biz burada açıklamak tahlil de ES hücre farklılaşması sırasında kaderi özellikleri incelemek için modifiye edilebilir.

Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Pluripotens ve kendini yenileme, embriyonik kök hücrelerin (EK hücreleri) iki temel özelliğidir. Altta yatan moleküler mekanizmanın anlaşılması...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, incelenen genin fare embriyonik kök hücresi veya ES hücresi kendi kendini yenileme kapasitesinin sürdürülmesindeki rolünü hızlı bir şekilde belirlemektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen genleri susturmak için kullanılacak transfeksiyon ana karışımının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak.Transfeksiyon ana karışımı jelatin kaplı bir plakaya aktarılır ve T 4G IP hücreleri eklenir. Hücreler daha sonra, gen susturma etkisinin ortaya çıkmasına izin verecek şekilde normal ES hücre kültürü koşullarında kültüre edilir. Dört günlük kültürden sonra, hücreler plaktan ayrılır ve kendi kendini yenileme durumları akış sitometrisi ile belirlenir. Nihayetinde, kontrol ve deneysel siRNA transfekte edilmiş T 4G IP hücreleri arasındaki GFP negatif hücre yüzdesi farkları FACS ile değerlendirilebilir.Bu tekniğin, hücre morfolojisi veya soy hattı belirteci analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha yüksek hassasiyet ve verim sağlamasıdır; bu nedenle orta ile büyük ölçekli genetik taramalar veya genetik epistaz analizleri için daha uygundur. Bu yöntem, ESL bakımı ve kendini yenileme için önemli olan genlerin çalışılmasını büyük ölçüde kolaylaştırabilir. Ayrıca, ESL diferansiyasyonu sırasında meydana gelen öz spesifikasyon olaylarına da uyarlanabilir.T 4G IP hücreleri, jelatin kaplı plaklarda kültüre edilir. Hücreler, santimetrekare başına yaklaşık iki çarpı 10⁴ yoğunlukta ekilir ve transfeksiyon için her iki ila üç günde bir pasajlanır. 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalarda, önce plak 0.1% jelatin ile kaplanır, ardından Optum ve Lipectomy 2000'den oluşan master mix hazırlanır ve 96 kuyucuklu U tabanlı bir plakaya paylaştırılır.Plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin, ardından lipid optimum karışımına beş pikomol I a ekleyin ve 15 dakika daha inkübe edin. Sonrasında, 96 kuyucuklu düz tabanlı plaktaki jelatini uzaklaştırın ve optimum içindeki i a lipid komplekslerini U tabanlı plaktan düz tabanlı plakalara aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Şimdi OC 4G IP hücrelerini toplayın ve bunları taze M 15 besiyeri içinde mililitre başına dokuz çarpı 10⁴ hücre olacak şekilde yeniden süspande edin.Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakadaki her bir kuyucuğa 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücre süspansiyonunu önceden hazırlanan serlipid kompleksleri ile karıştırmak için pipetle üç ila beş kez yukarı aşağı çekin; farklı serlipid transfeksiyonları için uçları değiştirin. Daha sonra plakaları 37 °C, %5 CO2 içeren bir inkübatöre yerleştirin ve hücreleri dört gün boyunca kültüre edin. Kültürün her gününde, plakaların tabanındaki hücreleri çizmemeye dikkat ederek eski medyumu uzaklaştırmak için çok kanallı bir aspiratör kullanın.Ardından, transfeksiyondan dört gün sonra hücreleri beslemek için çok kanallı bir pipet kullanarak 100 µL taze ES hücresi besiyeri ekleyin. Besiyerini çok kanallı bir aspiratör yardımıyla uzaklaştırın ve hücreleri bir kez 100 µL PBS ile yıkayın. Daha sonra, her birine 25 µL %0.25 tripsin eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.Hücreleri oda sıcaklığında, ara ara çalkalayarak beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücrelerin tamamen ayrıldığından emin olmak için plağı görsel olarak kontrol edin. Tripsini inaktive etmek için 90 µL %10 FBS içeren PBS ekleyin; hücreleri tek hücre süspansiyonu haline getirmek için hücre solüsyonunu pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı çekin.Son olarak, hücre süspansiyonunun 10 µL'sini analiz etmek için bir FACS analizörünün HTS ünitesindeki yüksek verimli modu kullanın. Sayım eşiğini 1,0 × 10⁴ hücre olarak ayarlayın ve hücreleri ileri saçılma (forward scatter) ile yan saçılma (side scatter) grafiğinde yakalamak için PMT voltajını ayarlayın. İleri saçılma ile yan saçılma grafiğinde canlı hücre popülasyonu için analiz kapısını (gate) başlatın ve ardından GFP kanalı için bir histogram grafiği oluşturun.Mock veya kontrol siRNA transfekte edilmiş hücrelerde hücrelerin yaklaşık %10'u GFP negatif görünecek şekilde GFP kanalındaki kapı (gate) ayarlanır; farklılaşmış hücrelerin yüzdesi, GFP negatif hücrelerin yüzdesine göre belirlenir. Her bir işlem için, deneysel ve kontrol siRNA transfektleri arasındaki farklılaşmış hücre yüzdelerini karşılaştırın.Bu ilk şekil, siyah histogramla temsil edilen vahşi tip E 14 TG two A hücrelerinin GFP için negatif olduğunu, yeşil histogramla temsil edilen T 4G IP hücrelerinin ise sonraki iki şekilde ES hücreleri olarak tutulduklarında GFP pozitif olduğunu göstermektedir. Kontrol veya T four siRNA'lar ile transfeksiyondan dört gün sonra T 4G IP hücrelerinin ileriye saçılma (forward scatter) ile yana saçılma (side scatter) grafikleri ve GFP kanalına ait histogramları saçılma grafiklerinde gösterilmiştir. Ölü hücreler ve döküntüler GFP negatif olduğu ve kontrol siRNA transfekte edilmiş hücrelerdeki histogram verilerinde görüldüğü üzere arka plan gürültüsünü artırdığı için, canlı hücreler önce ileriye saçılma ve yana saçılma grafiğinde kapılanmıştır; hücrelerin büyük çoğunluğu GFP pozitiftir.Bu sütun grafikleri; kontrol, nano OCT 4 ve SOX 2 siRNA transfekte edilmiş OCT 4G IP hücrelerinin, transfeksiyondan dört gün sonraki diferansiye olmuş hücre yüzdelerini göstermektedir. Beklendiği üzere tüm durumlarda, siRNA transfekte edilmiş hücrelerin kontrollere göre daha yüksek diferansiyasyon seviyeleri sergilediği belirlenmiştir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, her bir 96 kuyucuklu plaka için bir saatlik uygulama süresi yeterli olmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, ilgi alanınızdaki genin fare ESL bakımındaki rolünü hızlı bir şekilde belirlemek için Oxford GIP raporlayıcı analizinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

oct4gip-reporter-assay-to-study-genes-that-regulate-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları. Biz LIF yokluğunda fare ES hücre kendini yenileme destekleyen SC1 fonksiyonu test edilmiş ve SC1 fare ES hücre kültürleri kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermiştir.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Bu video, fare embriyolarında retinoik asit aktivitesini değerlendirmek için bir teknik göstermektedir. Fare embriyolarından hücreler izole edildikten sonra, hücreler retinoik asit (RA) raportör hücreleri ile birlikte kültürlenir. Embriyonik hücreler, raportör hücrelerde beta-galaktosidaz ekspresyonunu indükleyen ve embriyonik hücrelerde RA aktivitesini gösteren RA üretir.

Fare embriyonik hücreleri tarafından retinoik asit üretimini incelemek için bir ko-kültürde raportör hücrelerin kullanılması

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Bu çalışmada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretiyoruz.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Burada, saf ön hazırlıklı pluripotent geçiş kinaz regülatörleri için hedeflenmiş küçük molekül ekranları gerçekleştirmek için nicel ve ölçeklenebilir bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinde intergenik ve intragenik güçlendirici RNA'ların kararlılığını ve yarı ömrünü Aktinomisin D tedavisi, RT-qPCR ve doğrusal olmayan regresyon analiziyle nicel olarak ölçer. Konuma özgü normalleştirme stratejileri, eRNA bozunma dinamiklerini bağlama bağlı olarak doğru şekilde modellemek için dahil edilir.

Fare embriyonik kök hücrelerinde Enhancer RNA Stabilitesinin Optimize Edilebilir Nicel Değerlendirmesi

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

Öğrenin fare embriyonik kök hücre bakımı ve kendini yenileme süreçlerini düzenleyen genleri Oct4GiP raporlayıcı analiziyle belirlemeyi. Bu hassas yöntem gen fonksiyonlarını hızlıca değerlendirir.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Daha fazla video keşfet