Akut Hepatit Model Uygulama: Görselleştirme ve Hepatik Mikrosirkülasyon Kan Akış ve Oksijen Tüketimi Analizi

Floresan işaretli eritrositler ile karaciğer mikrosirkülasyonunu görselleştirmek ve lazer destekli fosfo görüntüleme ile mikro damarlardaki oksijenin kısmi basıncını ölçmek için optik bir sistem geliştirilmiştir. Bu yöntem, mikrovasküler yapıyı, çapı, kan akış hızını ve oksijen gerilimini analiz ederek fizyolojik ve patolojik mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir. Hepatik mikrosirkülasyonda kan, portal ES'den merkezi ES'ye akar ve ikisi arasında bir oksijen gradyanı oluşturur.

Karaciğerdeki oksijen konsantrasyonu hem enzim ekspresyonunu hem de kan akım analizi ve oksijen ölçümü yaparak patolojiyi etkiler. Önemli araştırma konuları. Deneysel yöntemimiz, floresan ile etiketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin intravenöz olarak uygulanmasını içerir.

Oksijen kısmi basınç ölçümü için floresan kullanarak mikrosirkülasyonu görselleştirmek için, çevredeki oksijen konsantrasyonuna bağlı bir dereceye kadar bir lazer tarafından uyarıldığında kan dolaşımında fosforesan yayan paladyum porfirini intravenöz olarak uyguluyoruz. Bu işlem, oksijenin kantitatif analizine izin verir, kısmi basınç ölçümü, hepatik mikrosirkülasyon, sırasıyla 59.8 ve 38.9 milimetre cıvanın portal ve merkezi venal oksijen kısmi basıncını gösterdi ve oksijen konsantrasyonunun etkili bir şekilde ölçüldüğünü gösterdi. Daha sonra, bu metodolojiyi bir hepatit modeline uyguladık.

Portal ES sinüzoidal ve santral es'de oksijen parsiyel basıncının arttığını, ancak portal ve santral es arasında basınç farkının azaldığını bulduk. Bu muhtemelen hepatosit nekrozu nedeniyle merkezi Ven bölgesinde oksijen tüketiminin azalmasından kaynaklanmaktadır. Bu sonuçlar, hepatik hemodinamik ve oksijen tüketimini ölçmek için optik bir sistem kullanma metodolojimizin, hepatik mikro dolaşımdaki çeşitli karaciğer hastalıklarının mekanizmalarını aydınlatabildiğini göstermektedir.

Oksijen gradyanı, periportal ve parasantral bölgelerdeki enzimlerin ekspresyonlarını, mikro dağılımlarla ilgili karaciğer hastalık türlerini içeren önemli bir parametredir, bu nedenle kan akışını ve oksijen tüketimini ölçmek önemlidir. Mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için, yöntemimizin avantajı temassız olmasıdır ve sürekli optik ölçüm, hepatik mikro dolaşımdaki kan akışını, patlama damarı çaplarını ve oksijen gradyanını ölçebilir. Bir donör fareden tam kan alındı ve eritrositler PBS ile iki kez santrifüj edilerek 400 G'da beş dakika süreyle yıkandı.

Daha sonra, 0.2 mikronluk bir gözenek zarından filtrelemeden önce iki miligram FITC'yi bir mililitre, 100 milimolar DI sodyum hidrojen fosfat içinde çözün. Daha sonra, 0.15 mililitre üç milimolar hünerli çözelti, 0.25 mililitre 180 milimolar DI sodyum hidrojen fosfat ve 1.5 mililitre 100 milimolar DI sodyum hidrojen fosfat ile birlikte bir mililitre FITC çözeltisini bir test tüpüne yerleştirin ve karıştırmak için dokunun. Lekeli RBC'leri PBS ile iki kez yıkamadan önce iki saat oda sıcaklığında tutun.

Daha sonra, bir cam slayt üzerine az miktarda RBC süspansiyonu yerleştirin ve hem normal RBC görünümünü hem de yeterli floresansı onaylayın, 0.1 mililitre RBC'yi 0.9 mililitre PBS'de askıya alın ve bir sonraki Kullanışa kadar dört santigrat derece tutun, 500 miligram BSA'yı 10 mililitre PBS'de çözün. Daha sonra 30 miligram paladyum porfirin ekleyin ve gece boyunca santrifüj yapın, çözünmemiş paladyum porfirini çıkarmak için çözelti ve SUP natini 0.2 mikron po membrandan süzün, bir mililitre süzüntüyü test tüplerine süzün ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Tekrarlanan donma ve çözülmeyi önlemek için özen gösterildi.

Mikrosirkülasyonu mikroskobik olarak görselleştirmek için, plastik bir plakada 20 milimetre çapında bir delik açın ve deliği 30 milimetre yana kare bir kapak camı ile kapatın. Bir kuyruk damarını kanüle ettikten sonra ana hepatik lobu yüzüstü pozisyonda plastik bir plakaya yayın. Daha sonra, solunum ve kurumadan kaynaklanan hareketi önlemek için lobu çevreleyen alanı kaplamak için üç milimetreye sekiz milimetrelik birden fazla plastik gıda sargısı kullanın.

Karaciğer dolaşımını bir iletim mikroskobu ile görselleştirin ve görüş alanında en az 15 dakika boyunca kan akışının durgunluğu olmadığını doğrulayın. Kan akışını gözlemlemek için yavaş yavaş enjekte edin. İki mililitre floresan etiketli RBC'yi işaret edin.

Oksijen kısmi basıncını ölçmek için 0.2 mililitre paladyum porfirin çözeltisi enjekte edin. FITC etiketli RBC'ler, görselleştirilen bölgede dolaşımda olan tüm RBC'lerin 50'de birini oluşturacak, FITC'yi 450 ila 490 nanometre bant geçiren bir filtreden geçirilen bir cıva lambası ile ışınlayarak uyaracak ve floresansı bir CCD kamera ile kaydedecektir. Paladyum Porfirin fosforesansı nispeten zayıftır ve yüksek hassasiyetli bir dedektör ve karanlık bir oda gerektirir.

Paladyum porfirin absorpsiyon tepe noktaları 410 ve 532 nanometre civarındadır ve 532 nanometrelik ikinci harmonik dalga boyu önerilir. Bu dalga boyu, bir neodimyum YAG darbeli lazer tarafından üretilir, lazer ışınını ters çevrilmiş bir mikroskoba bağlar ve ışın odak düzleminin merkezini aydınlatacak şekilde ayarlanır. Lazerin uzamsal çözünürlüğü, ışını bir iğne deliğinden geçirerek ayarlanabilen nokta boyutuna bağlıdır.

Fosforesansı tespit etmek için mikroskoba uzun geçiren bir filtre ve fotoçoğaltıcı tüp de takın. PMT, kırmızı dalga boylarına, özellikle 700 nanometre civarına duyarlı olmalıdır. Fosforlu sinyali örnekleyin ve üstel bir fonksiyon uygulayarak bozunma süresi sabitini hesaplayın.

Bu deneyde, 200 kilohertz'de 500 nokta örnekledik. Kalibre etmek için, her biri 150 oksijen kısmi basıncı ve sıfır milimetre cıva içeren iki paladyum porfirin çözeltisi hazırlayın. Sıfır milimetre cıva çözeltisi için, kalibrasyon sırasında oksijenin olmadığı durumu oluşturmak için numunelere %1 dihi sodyum ekleyin.

Numune pH'ını 7,4 ve sıcaklığı 37 santigrat derece olarak koruyun. Fareyi mikroskop tablasına yerleştirin ve hepatik mikrosirkülasyonu görselleştirmek istediğiniz mikro damarları, gece boyunca suya serbest erişimle lazer nokta hızlı farelerin noktasına ayarlayın, enjeksiyondan 24 saat sonra kilogram başına 200 miligram intraperitoneal asetaminofen enjekte edin, fareyi uyuşturun ve karaciğeri medyan bir insizyonla açığa çıkarın. Hepatit varsa, parasantral bölgedeki nekroz yoluyla çıplak gözle kolayca görülebilir.

Farelerde kısmi oksijen basıncı ve Hepatik mikro damar ölçümümüz, portallar, sinüs toprakları ve merkezi damarlar için sırasıyla 59.8, 48.2 ve 38.9 milimetre cıva ortalama oksijen basınçları gösterdi. Başka bir deyişle, portaldan merkezi ES'ye oksijen gradyanı, sinüzoidlerden geçerken RBC'lerden yeterli oksijen salınımını gösterir. Asetaminofen ile indüklenen hepatit farelerini hepatik mikrodamarları ölçmek için hazırladık.

Örnek bir patoloji modeli olarak, portal vees, sinüzoidal ve santral Es'deki oksijen parsiyel basınçlarının asetaminofen grubunda normal farelere göre daha yüksek olduğunu bulduk. Portal ve merkezi damarlar arasındaki oksijen kısmi basınç farkı, normal fareler için 20.9 milimetre cıva ve hepatit model fareler için 16.9 milimetre cıva idi. Portal ve merkezi damarlar arasındaki oksijen kısmi basınç farkı, normal fareler için 20.9 milimetre cıva ve hepatit model fareler için 16.9 milimetre cıva idi.

Hepatik mikrosirkülasyondaki oksijen gradyanı esas olarak hepatositler tarafından tüketilen portal venden oksijen verilmesi, asetaminofenin neden olduğu merkezi venal alanda hepatosit nekrozu, oksijen tüketiminin azalmasına, aşağı akış mikrosirkülasyonuna ve dolayısıyla hemodinamik ile ilgili sorunlara neden olur. Oksijen temini ve oksijen tüketimi, karaciğer hastalığının birçok formunda rol oynar. Akut hepatit modeli yapıldı ve mikro damarlarda oksijen tansiyonu artışı tespit edildi.

Optik sistemimiz, mikrovasküler yapıyı, akış dağılımını ve oksijen tüketimini analiz ederek fizyolojik ve patolojik mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir.