Akut Hepatit Model Uygulama: Görselleştirme ve Hepatik Mikrosirkülasyon Kan Akış ve Oksijen Tüketimi Analizi

Floresan işaretli eritrositler ile hepatik mikrosirkülasyonu görselleştirmek ve lazer destekli fosfo görüntüleme ile mikrodamarlardaki oksijen kısmi basıncını ölçmek için bir optik sistem geliştirilmiştir. Bu yöntem; mikrovasküler yapı, çap, kan akış hızı ve oksijen tansiyonu analiz edilerek fizyolojik ve patolojik mekanizmaların araştırılmasında kullanılabilir. Hepatik mikrosirkülasyonda kan, portal ES'den santral ES'ye doğru akar ve bu iki bölge arasında bir oksijen gradyanı oluşturur.

Karaciğerdeki oksijen konsantrasyonu, hem enzim ekspresyonunu hem de patolojiyi etkilediğinden, kan akış analizi ve oksijen ölçümü araştırmaların önemli konuları haline gelmiştir. Deneysel yöntemimiz, floresan ile işaretlenmiş kırmızı kan hücrelerinin intravenöz olarak uygulanmasını içermektedir.

Oksijen parsiyel basınç ölçümü için floresans kullanarak mikrosirkülasyonu görüntülemek amacıyla, bir lazer tarafından uyarıldığında çevredeki oksijen konsantrasyonuna bağlı olarak kan akışında fosforesans yayan paladyum porfirini intravenöz olarak uyguluyoruz. Bu süreç oksijenin kantitatif analizine olanak tanır; hepatik mikrosirkülasyonun parsiyel basınç ölçümleri, portal ve santral venöz oksijen parsiyel basıncının sırasıyla 59.8 ve 38.9 milimetre cıva olduğunu göstermiş ve oksijen konsantrasyonunun etkili bir şekilde ölçüldüğünü kanıtlamıştır. Ardından, bu metodolojiyi bir hepatit modeline uyguladık.

Portal ES sinüzoidal ve merkezi es'lerde yükselmiş oksijen parsiyel basıncı saptadık, ancak portal ve merkezi es'ler arasındaki basınç farkında azalma gözlemledik. Bu durum, muhtemelen hepatosit nekrozu nedeniyle merkezi ven bölgesindeki oksijen tüketiminin azalmasından kaynaklanmaktadır. Bu sonuçlar, hepatik hemodinamik ve oksijen tüketimini ölçmek için bir optik sistem kullanmaya dayalı metodolojimizin, hepatik mikrosirkülasyondaki çeşitli karaciğer hastalıklarının mekanizmalarını aydınlatma kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir.

Oksijen gradyanı, periportal ve parasentral bölgelerdeki enzim ekspresyonlarını ve mikro dağılımlarla ilişkili çeşitli hepatik hastalıkları etkileyen temel bir parametredir; bu nedenle kan akışının ve oksijen tüketiminin nicelleştirilmesi önemlidir. Mekanizmaları aydınlatmak adına yöntemimizin avantajı, temassız ve sürekli optik ölçümlerle hepatik mikro dolaşımdaki kan akışını, damar çaplarını ve oksijen gradyanını nicelleştirebilmesidir. Donör fareden tam kan alındı ve eritrositler, 400 G'de beş dakika boyunca santrifüj edilerek PBS ile iki kez yıkandı.

Ardından, 0,2 mikron gözenekli bir membranla filtrelemeden önce, iki miligram FITC'yi bir mililitre 100 milimolar DI sodyum hidrojen fosfat içerisinde çözün. Daha sonra, bir test tüpüne bir mililitre FITC çözeltisi ile birlikte 0,15 mililitre üç milimolar dekstran çözeltisi, 0,25 mililitre 180 milimolar DI sodyum hidrojen fosfat ve 1,5 mililitre 100 milimolar DI sodyum hidrojen fosfat ekleyin ve karıştırmak için hafifçe vurun. Boyanan RBC'leri PBS ile iki kez yıkamadan önce, karışımı iki saat boyunca oda sıcaklığında bekletin.

Ardından, cam lam üzerine az miktarda RBC süspansiyonu yerleştirin ve hem normal RBC görünümünü hem de yeterli floresan ışımayı doğrulayın; 0,1 mililitre RBC'yi 0,9 mililitre PBS içinde süspande edin ve kullanım vaktine kadar dört derece Celsius'ta saklayın. Daha sonra, 500 miligram BSA'yı 10 mililitre PBS içinde çözün. Ardından 30 miligram palladium porfirin ekleyin ve gece boyunca karıştırın; çözünmeyen palladium porfirini uzaklaştırmak için çözeltiyi santrifüjleyin ve süpernatantı 0,2 mikronluk bir gözenekli membran üzerinden süzün. Bir mililitre filtratı test tüplerine aktarın ve eksi 20 derece Celsius'ta saklayın. Tekrarlanan dondurma ve çözme işlemlerinden kaçınmaya özen gösterin.

Mikrodolaşımı mikroskobik olarak görüntülemek için, plastik bir plakada 20 milimetre çapında bir delik açın ve bu deliği kenarı 30 milimetre olan kare bir lam ile kapatın. Kuyruk veni kanüle ettikten sonra, ana hepatik lobu plastik bir plaka üzerine yüzüstü pozisyonda yayın. Ardından, solunuma bağlı hareketleri ve kurumayı önlemek için lobu çevreleyen alanı kapatmak üzere üç milimetreye sekiz milimetre boyutlarında birden fazla plastik streç film parçası kullanın.

Transmisyon mikroskobu ile hepatik dolaşımı görüntüleyin ve görüş alanındaki kan akışında en az 15 dakika boyunca staz olmadığını doğrulayın. Kan akışını gözlemlemek için, floresan işaretli RBC'lerin 0,2 mililitresini kademeli olarak enjekte edin.

Oksijen kısmi basıncını ölçmek için 0,2 mililitre paladyum porfirin çözeltisi enjekte edin. FITC etiketli RBC'ler, görüntülenen bölgedeki dolaşımdaki tüm RBC'lerin ellide birini oluşturacaktır; FITC'yi 450 ila 490 nanometre bant geçişli bir filtreden geçirilen cıva lambası ile ışınlayarak uyarın ve floresanışı bir CCD kamera ile kaydedin. Paladyum porfirin fosforesansı nispeten zayıftır; bu nedenle yüksek hassasiyetli bir dedektör ve karanlık bir oda gereklidir.

Palladyum porfirin absorbsiyon pikleri yaklaşık 410 ve 532 nanometre civarındadır ve 532 nanometrelik ikinci harmonik dalga boyunun kullanılması önerilir. Bu dalga boyu, bir neodyum YAG darbeli lazer tarafından üretilir; lazer ışını bir evirtilmiş mikroskoba bağlanır ve ışının odak düzleminin merkezini aydınlatacak şekilde ayarlanır. Lazerin uzamsal çözünürlüğü, ışının bir iğne deliğinden (pinhole) geçirilerek ayarlanabilen nokta boyutuna bağlıdır.

Fosforesansı saptamak için mikroskoba bir uzun geçiş filtresi ve fotomultiplier tüp de takın. PMT, kırmızı dalga boylarına, özellikle 700 nanometre civarına duyarlı olmalıdır. Fosforesans sinyalini örnekleyin ve üstel bir fonksiyon uygulayarak sönümlenme zaman sabitini hesaplayın.

Bu deneyde, 200 kilohertz hızında 500 noktadan örnekleme yaptık. Kalibrasyon için, oksijen kısmi basıncı sırasıyla 150 ve sıfır milimetre cıva olan iki palladyum porfirin çözeltisi hazırlayın. Sıfır milimetre cıva çözeltisi için, kalibrasyon sırasında oksijenin bulunmadığı koşulu oluşturmak amacıyla örneklere %1 sodyum dihidrit ekleyin.

Numune pH'ını 7.4'te ve sıcaklığı 37 °C'de tutun. Fareyi mikroskop tablasına yerleştirin ve hepatik mikrosirkülasyonunu görüntülemek istediğiniz mikrodamarları lazer noktasının altına gelecek şekilde ayarlayın. Suya serbest erişimi olan hızlı farelere gece boyunca 200 mg/kg dozunda asetaminofen intraperitonal olarak enjekte edin. Enjeksiyondan 24 saat sonra fareyi anestezi altına alın ve medyan insizyon ile karaciğeri açığa çıkarın. Eğer hepatit varsa, parasantral bölgedeki nekroz aracılığıyla çıplak gözle kolayca görülebilecektir.

Farelerdeki parsiyel oksijen basıncı ve hepatik mikrovasküler ölçümlerimiz; portal venler, sinüzoidler ve merkezi venler için sırasıyla 59,8, 48,2 ve 38,9 mmHg ortalama oksijen basınçları göstermiştir. Diğer bir ifadeyle, portalden merkeze doğru olan oksijen gradyanı, RBC'lerin sinüzoidlerden geçerken yeterli miktarda oksijen bıraktığını göstermektedir. Hepatik mikrovasküler yapıları ölçmek için asetaminofen ile indüklenmiş hepatitli fare modelleri hazırladık.

Örnek bir patoloji modeli olarak, asetaminofen grubundaki portal venlerde, sinüzoidal ve merkezi venlerdeki oksijen parsiyel basınçlarının normal farelere kıyasla daha yüksek olduğunu bulduk. Portal ve merkezi venler arasındaki oksijen parsiyel basınç farkı normal fareler için 20.9 mmHg ve hepatit model fareleri için 16.9 mmHg idi. Portal ve merkezi venler arasındaki oksijen parsiyel basınç farkı normal fareler için 20.9 mmHg ve hepatit model fareleri için 16.9 mmHg idi.

Hepatik mikro sirkülasyondaki oksijen gradyenti, temel olarak portal venden gelen ve hepatositler tarafından tüketilen oksijenlemden kaynaklanır; asetaminofenle tetiklenen merkezi venal bölgedeki hepatosit nekrozu, oksijen tüketiminde, distal mikro sirkülasyonda ve dolayısıyla hemodinamik ile ilgili sorunlarda azalmaya yol açar. Oksijen arzı ve oksijen tüketimi, birçok karaciğer hastalığı formunda rol oynamaktadır. Akut hepatit modeli oluşturduk ve mikrodamlarda oksijen tansiyonunun arttığını saptadık.

Optik sistemimiz, mikrovasküler yapıyı, akış dağılımını ve oksijen tüketimini analiz ederek fizyolojik ve patolojik mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir.