Α-testi: Tüm Tükürük Kullanarak Hızlı Hücre içermeyen CD4 sayımı

Kaynakların sınırlı olduğu bölgelerde HIV hastalığını izlemek için uygun maliyetli CD4 sayımına acil ihtiyaç vardır. Bu video, CD4 sayılarının tükürükteki proteinaz inhibitörü Alpha 1 PI varlığına dayanarak belirlendiği, düşük maliyetli bir hasta başı tarama testini göstermektedir. Bunu yapmak için, denek veya hastaya öncelikle tükürüğe seröz sıvı eksüdasyonunu uyarmak amacıyla bir limon damlası verilir.

Tükürük bir numune kabında toplanır ve 96 kuyucuklu bir analiz plakasına aktarılır. Ardından, tükürüğe alfa-1 anti-tripsinle bağlanıp onu inhibe edecek doyurucu miktarda porcine pancreatic elastase proteinazı eklenir. Sonrasında, kolorimetrik elastaz substratı eklenir.

Geriye kalan bağlanmamış tüm elastazlar substratı parçalayarak şeffaftan sarıya bir renk değişimine neden olur. Toplam proteini boyamak için kuyucuklara Kumasi mavisi eklenir ve bir mikroplaka okuyucu kullanılarak kolorimetrik ölçümler yapılır. Son aşamada, alfa 1 PI'nın toplam proteine oranı belirlenir ve bir indeks değerine dayanarak CD 4 sayımlarını doğru bir şekilde değerlendirmek için kullanılır.

Bu tekniğin, mevcut yöntem olan akış sitometrisine göre çeşitli avantajları vardır. Analiz, travmatik ve maliyetli olan kan toplama işlemine gerek kalmadan sahada yapılabilir; pahalı olan monoklonal antikorların kullanımına ihtiyaç duymaz; teknik eğitim gerektirmez ve soğutma veya numune taşıma zorunluluğunu ortadan kaldırır. Bu yöntem, AIDS müdahalesinin önündeki kritik bir engeli aşmakta olup; hastaların maliyetleri ve sağlık sonuçları ile HIV bulaşma sıklığı üzerinde büyük bir etki yaratacaktır ki bunların tümü küresel ekonomi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir.

Bu yöntem, Alpha ve PI'nin adezyon ve migrasyon yoluyla CD four T hücresi sayısını nasıl düzenlediğine dair içgörü sağlayabilir; ancak diğer protein inhibitörlerinin diğer hücre tiplerinin adezyon ve hücre migrasyonunu nasıl düzenlediği gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, HIV enfekte hastalarında Alpha one PI seviyelerinin, kana geçen CD four T hücrelerinin sayısını sınırlayacak kadar düşük olduğunu keşfettiğimizde ortaya çıktı. Bu protokole, kullanılacak her bir mikroplaka için gerekli çalışma çözeltilerini hazırlayarak başlayın.

7.8 pH değerinde 60 mililitre 0.05 molar tris tamponlu salin veya TBS hazırlayın. Ayrıca, her bir mikroplaka için altı mililitre tip bir porsin pankreatik elastaz veya PPE hazırlayın. PPE süspansiyonunu iyice çalkalayın ve ardından mililitre başına yaklaşık 0.01 ünite konsantrasyona ulaşana kadar TBS ile seyreltin.

Ardından, DMSO içinde 0,1 molar bir kolorimetrik substrat SA three NA stok çözeltisi hazırlayın. Bu stok çözelti ya hemen kullanılmalı ya da stok hemen kullanılmayacaksa -20 °C'de saklanmalıdır. Her mikroplaka için, bu çözeltiyi TBS ile 1/100 oranında seyrelterek altı mililitre çalışma çözeltisi hazırlayın. Son olarak, TBS içinde %10'luk bir kumasi brilliant blue R two 50 stok çözeltisi hazırlayın ve bunu ya hemen kullanın ya da hemen kullanılmayacaksa -20 °C'de saklayın.

Stoku TBS içinde 1/1000 oranında seyrelterek her bir mikroplaka için altı mililitre hazırlayın. Tükürükle çalışırken, araştırma deneği veya hasta ayaktayken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi uygun önlemlerin alınması önemlidir. Serum eksüdasyonunu stimüle etmek için ağza bir SGO yerleştirin.

Bu gösterimde HIV hastasının rolü bir araştırma asistanı tarafından canlandırılmaktadır. Sıkça dişsiz olan ve sakız çiğneyemeyen HIV hastaları için şekersiz limonlu şeker kullanımı uygundur; hastanın ilk üç dakika boyunca ihtiyaca göre yutkunması ve sonraki üç dakika boyunca tüm ağız tükürüğünü bir örnek kabına toplaması istenir. Bu işlem yaklaşık iki mililitre tükürük sağlayacaktır.

Tükürük hemen kullanılmayacaksa dondurulmalı ve -80 °C'de saklanmalıdır; işlem gününde numune 37 °C'de çözdürülmelidir. Çözündürülen tükürük, 2 ila 4 °C'de üç güne kadar saklanabilir. Analizi kurmak için her numune ve kontrol, 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakada üç paralel şeklinde ekilmeli ve her bir numune kuyucuğuna ve kontrol kuyucuğuna 130 µL TBS eklenmelidir.

Ardından, viskoz olan ve serum eksüdası içermeyen müsinle temas etmekten kaçının. Her bir üç test kuyucuğuna ve üç negatif kontrol kuyucuğuna 20 µL tükürük aktarın. Daha sonra, pozitif kontrol kuyucuklarına 20 µL TBS ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.

Bu adımda, tükürüğü pipetlerken kabarcık oluşumuna neden olacak şekilde vortekslemeden kaçınmak ve katı partikülleri pipetlemekten ve bunları ezmekten kaçınmak önemlidir. Ardından, pozitif kontrol pankreatik elastaz veya PPE çalışma çözeltisini iyice karışana kadar çalkalayın; daha sonra örnek kuyucuklarına, pozitif kontrol kuyucuklarına ve negatif kontrol kuyucuklarına 50 µL ekleyin.

50 µL TBS ekleyin. Eklenen hacim, tükürük karışımı içinde homojen dağılım sağlamak için yeterince büyük olduğundan karıştırmaya gerek yoktur. Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, her bir kuyuya 50 µL elastaz substratı SA three NA çalışma çözeltisi ekleyin. Ardından 23 °C'de 45 dakika daha inkübe edin. 45 dakika geçtikten sonra, her birine 50 µL Coomassie blue çalışma çözeltisi ekleyin.

Ardından, SA üç NA kesimini tespit etmek için 405 nanometre dalga boyunda ve toplam protein içeriğini temsil eden kumasi blue'yu tespit etmek için 595 nanometre dalga boyunda bir mikroplaka okuyucuda absorbansı okuyun. Alfa bir PI indeksini hesaplamak için, öncelikle örnek ortalaması ile negatif kontrol ortalaması arasındaki farkı, pozitif kontrol ortalaması ile negatif kontrol ortalaması arasındaki farka bölerek her bir dalga boyu için normalize edilmiş absorbansı elde etmek üzere aşağıdaki formülü kullanın. Daha sonra, alfa testinin endemic kaynakların sınırlı olduğu bölgelerde CD dört sayılarını izlemek için bir hasta başı tarama testi olarak kullanıma uygun olup olmadığını belirlemek amacıyla, burada gösterildiği gibi 405 nanometredeki normalize absorbansı 595 nanometredeki normalize absorbansa bölerek alfa bir PI indeksini elde edin.

Kamerun'da rutin bakım için kliniğe gelen 20 kadın ve 11 erkek HIV-1 deneğinden uyarılmış tükürük örneği toplanmıştır; New York City'de toplanan tükürükler kullanılarak gerçekleştirilen alfa testinin geliştirilmesi sırasındaki ön gözlemlerle uyumlu olarak, alfa 1 PI indeksi ve Kamerun'da toplanan tükürükler, 0,91 R kare değeri ve 0,0001'den küçük P değeri ile CD4 sayıları ile korelasyon göstermiştir. Bu ilişki, doz-yanıt ilişkisiyle tutarlı olan üç parametreli sigmoid bir eğri ile tanımlanmıştır. %95 güven ve tahmin aralıkları sırasıyla mavi ve kırmızı çizgilerle gösterilmiştir.

Önceki bir çalışmada, HIV 1 hastalarında ve alfa 1 PI eksikliğinin kalıtsal versiyonuna (PIZZ) sahip deneklerde, CD four pozitif T hücrelerinin 23 artı eksi 3,5 günlük periyotlarla sinüzoidal döngü sergilediğini belirledik. Burada, 27 günlük periyot sergileyen HIV negatif sağlıklı bir kontrolde, CD four döngüsünün bilgisayar tarafından oluşturulmuş sinüs eğrisi analizinin temsilci bir örneği gösterilmiştir. Altı denekteki CD four pozitif T-hücresi değişikliklerinin bilgisayar tarafından oluşturulmuş sinüs eğrisi analizi, beklendiği üzere tepe-tepe genliği ve osilasyon ekseni için değerler sağlamıştır. Osilasyon ekseni, 0,96 R-kare değeri ve 0,009 p değeri ile genlik ile korele bulunmuştur.

Düşük CD four pozitif T-hücre sayılarına sahip hastalarda, CD four T-hücre sayısındaki döngüsel değişimler küçükken, yüksek CD four pozitif T-hücre sayılarına sahip hastalarda döngüsel değişimler büyüktü; çünkü burada gösterilen regresyon doğrusu salınım eksenini tahmin etmektedir ve salınım ekseni genlikle koreledir. Regresyon doğrusu için genlik hesaplanarak, döngüsellik nedeniyle CD four pozitif T hücrelerinin regresyon doğrusunun ne kadar üzerinde ve altında değişmesinin beklendiği tahmin edilebilir; hesaplanan genlik ve güven aralığı üst üste bindirildiğinde, yeşil çizgi ile belirtilen genliğin, mavi çizgi ile belirtilen %95 güven aralığı içinde kaldığı görülmüştür.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, tükürük toplama anından hastaya CD4 hücre sayısı sonucunun iletilmesine kadar olan süreç 90 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedür, CD4 sayılarını izlemek için bir tarama testi olarak kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bir hastanın CD4 sayılarında önemli değişiklikler görülürse, CD4 sayısı ölçümlerinin doğruluğundan emin olmak ve tedavi kararlarına yardımcı olmak için o hasta akış sitometrisi kullanılarak takip edilmelidir.

Geliştirmenin bir sonraki aşamasında, mikroplaka testi, testlerin bir cihaz veya elektrik olmadan gerçekleştirilmesine olanak tanıyan dipstick (batır ve oku) teknolojisine dönüştürülecektir. HIV'in tükürük yoluyla bulaşma olasılığı düşüktür, ancak HIV hastaları sıklıkla tüberküloz ve hepatit C gibi diğer bulaşıcı hastalıklara da sahiptir; bu nedenle, tükürükle çalışmanın da tıpkı kanla çalışmak gibi bilinmeyen enfeksiyöz partiküller nedeniyle son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür gerçekleştirilirken eldiven ve diğer kişisel koruyucu donanımların kullanılması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.