Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi In situ Hibridizasyon (FISH)

Bu prosedürün genel amacı, viral RNA'nın hücreler içindeki C ikideki yerini görselleştirmektir. Bunu başarmak için önce transfekte edilecek veya enfekte olacak hücreleri cam kapak kızakları üzerinde büyütün. İkinci adım, başarılı transfeksiyon veya enfeksiyondan sonra hücreleri% 4 paraform aldehit ile sabitlemektir.

Daha sonra, hücreleri RNA'yı etiketleyen bir hibridizasyon karışımı ile inkübe edin. Bu, kapak kayma hücresinin bir slayt üzerindeki hibridizasyon karışımının üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirilmesiyle yapılır. Bu prosedürdeki son adım, RNA etiketi için hücreleri boyamak için antikorlar kullanmaktır.

Sonuç olarak, etiketli RNA'nın hücre içindeki lokalizasyonu, C iki hibridizasyonunda veya balıkta floresan ile görselleştirilir. Bu tekniğin, RNA görüntüleme ve etiketler kullanan yaşam hücreleri gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, modifiye edilmiş RNA'nın aksine doğal RNA'nın tespit edilebilmesidir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, hastaların bakım ve kapak fişlerinin işlenmesi, yöntemin standardizasyonu ve kesin zamanlama gerektirmesi nedeniyle mücadele edeceklerdir.

İnkübasyonlar sırasında, Fiksasyon için hücrelerin kültürlenmesi için spesifik prosedür, hücrelerin tipine bağlı olacaktır. Yapışık hücreler için, başlangıçta onları işlenmemiş steril cam örtü fişleri üzerine tohumlamak önemlidir. Bu nedenle, hasat sırasındaki nihai akıcılık yaklaşık% 70 ila 80'dir, Yapışmayan hücreler, toplanmaya hazır olana kadar standart şekilde kültürlenmelidir.

Daha sonra, enfeksiyon veya transfeksiyondan 24 saat önce kuyu başına 150.000 hücre tipik bir 12 kuyulu polistiren doku kültürü plakası plakası için poli L lizin ile muamele edilmiş kapak fişleri ile inkübe edin. Hücre fiksasyonu işlemine başlamak için kapak dudaklarındaki hücreleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Ortamı dikkatli bir şekilde aspire ederek atın ve nazikçe bir XPBS hazırlanmış ve çift damıtılmış su ekleyin.

Veya DPBS hücreleri bir dakika boyunca yıkar. Dathyl pyro CARBATE veya DEPC ile muamele edilmiş bir XPBS de kullanılabilir. Rnaz enzimleri içerebileceğinden tedavi edilmemiş PBS kullanmayın.

DPBS'yi atın ve yavaşça yeterince ekleyin. Hücreleri tamamen kaplayacak şekilde %4 para formaldehit 15 ila 20 dakika inkübe edin Bundan sonra paraldehiti atın ve hücreleri bir dakika boyunca DPBS ile yıkayın. DPBS'yi atın ve 10 dakika boyunca 0.1 molar glisin inkübe edin.

Daha sonra, glisini atın ve hücreleri bir dakika boyunca DPBS ile yıkayın. DPBS'yi attıktan sonra% 0.2 Triton X 100 ekleyin, beş ila 10 dakika inkübe edin. Nükleolar veya nükleer zarf proteinleri için boyama yapılırsa, triton X 100 ile beş dakikadan fazla olmamak üzere nüfuz eder, aksi takdirde protein lokalizasyonu yayılır.

Triton X 100'ü atın ve balık işlemine başlamadan önce DPBS'de her seferinde bir dakika boyunca iki kez yıkayın. Kapağın kuluçkaya yatırılacağı tarafları hazırlayın Fişleri, iyice temizlemeye ve etiketlemeye özen göstererek. 18 milimetrelik bir kapak kayması için, slayta 50 mikrolitre DNA çözeltisi ekleyin.

Bu prosedürün en zor yönü, lamel kızakların uygun şekilde kullanılmasıdır. Kapak fişinin sağ tarafını kuluçkaya yatırdığınızdan ve nazikçe tuttuğunuzdan emin olmanız önemlidir. Kırılmayı önlemek için, kapak fişini slayta ekleyin, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirdiğinizden ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ettiğinizden emin olun 15 dakika sonra, kapak fişlerini bir X-D-P-B-S ile bir kültür kabına satış tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Kapak fişlerini bir dakika boyunca yıkayın. Bu karışım aşağıdakileri içerir. % 50 deiyonize form amid mililitre başına bir miligram, TRNA iki X-S-S-P-E beş X dnar RNA prob ve DEPC suyu 50 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar.

Prob, viral genomik RNA'ya tamamlayıcı olacak şekilde tasarlanmış bir dig genin etiketli RNA probudur. Yer. Her bir kapak, sürgü üzerindeki hibridizasyon karışımı üzerinde hücre tarafı aşağı bakacak şekilde kayar. İnkübasyon,% 50 FIDE iki X-S-S-P-E içeren bir tepside yapılmalıdır.

Karıştırın, 42 santigrat derecede 16 ila 18 saat inkübe edin. Daha sonra, 42 santigrat derecede 50 dakika boyunca 50 mikrolitre% 50 fide içinde kapak kapağı hücresi aşağı bakacak şekilde inkübe edin. Kapak fişlerini iki X-S-S-P-E'de 50 mikrolitre iki X-S-S-P-E'de her biri 42 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe ederek iki X-S-S-P-E halinde iki kez yıkayın.

Son olarak, kapak fişlerini bir dakika boyunca bir X-D-P-P-S'de yıkayın. Bu prosedüre başlamak için, hücre tarafını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 50 mikrolitrelik bir X Roche bloke etme solüsyonuna yerleştirerek kapak fişlerini bloke edin, blokaj tamamlandığında, her bir kapak kayma hücresi aşağı bakacak şekilde 50 mikrolitre bir primer antikor solüsyonuna yerleştirin deney için tüm primer antikorları uygun konsantrasyonlarında içeren bir primer antikor solüsyonu. Bir saat sonra 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Kapak kayma hücresi yukarı bakacak şekilde DPPS içeren bir kültür kabına yerleştirin ve kapak fişlerini 10 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, her bir kapak kayması için 50 mikrolitre ikincil antikor solüsyonunu bir slayt üzerine pipetleyin. Alexa zemin konjuge antikorları, bir dizi renk oluşturmak için kullanılabilir ve bir x bloke etme çözeltisinde ve bir X-D-P-B-S'de bir ila 500 seyreltmede kullanılır. Her bir kapak kayma hücresi aşağı bakacak şekilde ikincil antikor çözeltisine yerleştirin ve 37 derecede bir saat inkübe edin.

Kapak fişlerini her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. DPBS'de kuru, kapak hücre tarafı yukarı bakacak şekilde bir kurutma kağıdı üzerine kayar. Işığa maruz kalmamak ve ağartmayı önlemek için kapak kızaklarını kapattığınızdan emin olun.

Tüm sıvı buharlaştıktan sonra, kapak kızaklarını yeni slaytların üzerine monte edin. Sekiz mikrolitre immün montaj kullanarak, hava kabarcıklarını gidermek için kapak fişine hafifçe vurun, yerine sabitlemek için kapak fişinin kenarlarına oje sürün. RNA ve proteinlerin mikroskopi teknikleri ile görselleştirilmesi de bu prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir.

Kullanılan mikroskop üzerindeki ayarlar görselleştirmeye yardımcı olabilir veya engelleyebilir. Bu nedenle, mikroskop üzerindeki ayarların doğru şekilde ayarlanması ve belirli bir deneyde bir numuneden diğerine tutarlı olması çok önemlidir. Balıklar tarafından viral RNA görselleştirmesinin ve immünofloresan ile protein lokalizasyonunun temsili bir sonucu bu şekilde gösterilmektedir.

Hela hücrelerinin HIV bir ile transfekte edildiği bu ilk panelde, yeşil renkle izlenen HIV için viral RNA, çoğunlukla dağınık olarak görüntülenen sitoplazma boyunca görülür, ancak küçük sitoplazmik punte nadir değildir, özgüllük, pozitif hücrelerin, yalnızca viral RNA boyamasını temsil eden siyah beyaz iç görüntü ile gösterildiği gibi, floresan göstermeyen çevre hücrelerle karşılaştırılmasıyla görülebilir. Kırmızı leke, Ross GA PSH üç alan bağlayıcı proteinin veya G üç bp'nin immünofloresansını yansıtır, bu da esas olarak helo hücreleri, düzenleyici devir proteininden yoksun olan HIV ile transfekte edildiğinde sitoplazmayı işaretler. Üretilen viral RNA çekirdekte tutulur.

Bu, çekirdekte parlak yeşil bir sinyal ve sitoplazmada RNA floresan sinyalinin olmaması olarak görselleştirilebilir. HIV bir viral RNA'nın dağılımı, bazı hücresel proteinlerin aşırı ekspresyonu ile de değiştirilebilir. Örneğin, RAB yedi etkileşimli lizozomal proteinin veya gerçek, endozomal vezikül kaçakçılığında yer alan bir proteinin aşırı ekspresyonu, yeşil renkte izlenen viral genomik RNA'nın mikro tüp organizasyon merkezine yeniden lokalizasyonuna yol açar.

Burada endozomlar birinci lamba ile etiketlenir ve kırmızı ile boyanır. Buna karşılık, dine motor kompleksinin yapıştırılmış P one 50'sine bağlanamayan terminal olarak silinmiş bir amino terminal olarak silinmiş delta N'nin aşırı ekspresyonu, P 50 dyin ekspresyonu üzerine sitoplazma içindeki geç endozomları dağıtır, dine motorunun büyük alt birimini bloke eder ve geç endozomları serbest bırakır, aynı zamanda viral genomik RNA ve HIV V bir yapısal proteinleri hücre çevresine. HIV bir helo hücrelerinde eksprese edildiğinde ve daha sonra hücreler toplanıp farklı zaman noktalarında analiz edildiğinde, viral RNA, transfeksiyon ve enfeksiyondan üç saat sonra hücrede ortaya çıkar ve bu balık tekniği ile 12 saat içinde kolayca gözlemlenebilir hale gelir.

Burada viral RNA ekspresyonu yeşil renkte izlenirken, hücresel protein H-N-R-N-P-A kırmızı renkle boyanır Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa birinci gün 20 dakika ve ikinci gün dört buçuk saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kırılmalarını önlemek ve ikincil antikor uygulandıktan sonra ışıktan kaçındığınızdan emin olmak için kapak fişlerini hassas bir şekilde tutmayı unutmamak önemlidir. HIV V one ve diğer yüksek seviyeli patojenlerle çalışırken, fiksasyondan önce son derece tehlikeli olduğunu ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman yeterli eğitim ve sınırlama gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.