Name: Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Öğrenin, polietilen emiş pipeti kullanarak nöronlara yüksek konsantrasyonda floresan ve kalsiyum duyarlı boyaları düşük maliyetli bir teknikle nasıl yükleyeceğinizi. Bu yöntem, sinirbilim araştırmalarında nöronal aktiviteyi görselleştirmeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüleri ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Strok intramural programı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca yöntem ve Şekil 3&#39;te verilere daha önceki katkıları için Dr George Mentis teşekkür etmek istiyorum.</p

Floresan dekstranlar anatomik araçları olarak ve görüntüleme nöronal aktivitenin 1-4 için kullanılmıştır. Alanlar ve ark., (2009) 4 model sistem olarak omurilik odaklanarak aksonal yolları için iyon ve voltaj duyarlı boya uygulamak için bir protokol yayınlamıştır. Burada in-vitro optophysiological ve morfolojik çalışmalar için kesim ventral kök, dorsal kök ve omuriliğin herhangi bir nöronal yollarını floresan ve / veya iyon duyarlı boya uygulamak için daha ayrıntılı bir prosedür tanımlamaktır. 1. Tip I ve Tip-II Pipetler Sivri uçları olan pipetler üretmek için bir alkol lambası 7 ateşte polietilen boru iki kısa bölümler (PE90, Clay Adams Marka) çekerek başlayın. Bir pipet (Tip-I) sıkıca hedef kök veya sistem (:; İç Çapı 0.2-0.4 mm: 0.1-0.3 mm Dış Çap) tutun küçük bir uç ile (3-7 mm) kısa olmalıdır. Sonra ikinci bir pipet (Tip çekin-II) daha uzun (8-12 cm) ince, şaft ve çok ince bir uç (Dış Çap: 0.2-0.3 mm, iç çapı: eklenebilen 0.1-0.2 mm) Tip-I kadarıyla Pipeti ucu. İkinci ince pipetle Tip I-pipetle sırasıyla yapay serebrospinal akışkan (aCSF) ve boya çözeltisi aspire ve tanıtmak üzere kullanılacaktır. 2. Konumlandırılması Tip-I Pipeti Inceleyin ve omurilik 8,9 yalıtmak ve yükleme süreci boyunca soğutulmuş aCSF (~ 16 ° C) ile superfused bir banyo, içine koyun. Tip-I sırtını açılış kolay, esnek bir tüp aracılığıyla bir şırınga (1ml U-100 insülin şırınga, Becton Dickenson veya eşdeğeri) bağlanabilir böylece bir elektrot tutucu (H1/12 elektrot tutucu, Narishige) üzerine Pipeti (PharMed yerleştirin BPT, Cole-Parmer, # AY242002; 10 cm) (Fig.1A-B). 3. Boya Uygulama <ol><li> Şırınga kullanarak, ilk çizmekTip I-pipetle sınırlandırılır (Şekil 1b; 2A) içine aCSF akson yolu veya (Şek. 2B) doldurulması için kök izledi. Esnek tüp daha sonra geri açılması çıkarılmalıdır. Tip-II pipet başka bir enjektöre bağlanmış ve Tip-I aksonal yolu veya kök tutarak Pipeti eklenir. Bu yüzden artık aCSF sadece aksonal yolu (; 2C-D Fig.1C) kapsar tip-II pipet, aspirat aCSF bağlı şırınga kullanma. Sonra tip-I pipetle tip-II pipet çekebilirsiniz. Aksonal yolu ya da sinirler üzerinde iyi bir sızdırmazlık doğrulamak için birkaç dakika aCSF seviyesi (&quot;iyi bir sızdırmazlık&quot; için Sorun Giderme bölümünde bakınız Bölüm 3) izleyin. </li><li> ACSF içinde boya veya çift distile su içinde% 0.2 Triton X-100 eritin ve hava kabarcıkları dahil etmemeye dikkat ederken Type-II pipet içine çekmek. Tip-I pipet içine ve artık aCSF çözüm (Şekil 2E) içine boya içeren Tip-II pipet yerleştirin. Yavaş yavaş serbest bırakınhafif pozitif basınçlı (Şekil 2F) kullanılarak aCSF içine boya. Herhangi bir hava kabarcığı tanıtmak veya ucun içinden hedef dokuda ötelemeye neden için dikkatli olun. Boya yeterli miktarda (boya çözeltisi 3-5 uL) yayımlanmıştır sonra tip-II pipet çekin. </li></ol> 4. Kuluçka Deney tipine bağlı olarak 6-20 saat arasında karanlıkta doku inkübe. Bir kez yeterli zaman doldurmak için izin verildi, hafifçe görüntüleme veya histoloji için doku hazır bırakarak doku elektrot acılır. Sorun Giderme <ol><li> Hedef dokuda Tip-I pipet ucu kolayca girmek veya bir zamanlar içinde gevşek değilse, o zaman uç çapı yanlıştır. Bu durumda, çekin ve farklı bir pipet kullanın. </li><li> Tip-I pipet içinde aCSF için boya eklemeden önce, yeterince aCSF bu ulaşılabileceği böylece kalır emin olunTip-II pipet ucu (Şekil 2B). Boya eklenir kez Aksi takdirde, bir hava boşluğu var olacaktır. Bu durumda, boya ekleyin ve pipetle aksonal yolu kaldırın ve Type-II pipet ile ulaşılabilir yeterli aCSF ile geri çekmek değildir. </li><li> Tip I-pipetle artar aCSF seviyesi, Tip II-pipetle aspire edildi sonra, bu doku ile conta iyi olmadığı anlamına gelir. Farklı bir elektrot kullanmak, aksi boya etiketleme prosedürü sırasında seyreltilmiş edilecektir. </li><li> Boya enjekte ederken bir hava kabarcığı Tip-I pipet girmiş ise, kabarcık Type-II pipet yakın ilerleyen ve yavaşça ekli şırınga kullanarak zayıf bir negatif basınç uygulayarak balonu boşaltın. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Yöntemin bir uygulama göstermek için, aynı anda yükleme motonöronlar, duyu afferentleri ve üç farklı Dext ile spinal internöronlardanfloresan boyalar (Şekil 3A)-konjuge koştu. Gibi ölçülmüştür. Nöron 3B, üç sınıf etiketli; duyusal aferentlerde (kırmızı), ventral kordon (yeşil) ve motonöronlar (mavi) içine uzayan internöronlardan. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> Şekil 1.. Şematik Pipet gösteren Tip I ve Tip-II montaj. (A) Tip I bu açılma kolayca esnek bir elastomer boru (B) bağlanabilir ve içine bir Tip II pipetle (C) eklenebilir geri var ki pipetle (açık mavi), bir elektrot tutucu üzerine yerleştirilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> Şekil 2. Şematik floresan boyalarla motonöronlar ve yükleme süreci gösteriyor. (A) Tip-I pipet doldurulacak ventral kök yakın yerleştirilir. (B) Emme kök takiben pipetle içine aCSF çizmek için pipetle uygulanır. (C-D) Tip-I pipet end&#39;deki esnek elastomer tüp ayırın ve Tip-II pipet için emme uygulayarak aCSF miktarını azaltır. (E) Tip I-pipetle içinde kalan aCSF içine eritildi boya içeren Tip II-pipet ucu yerleştirin. (EF) Yavaşça boya ile Tip-I pipet doldurmak ve ardından Tip-II pipet kaldırın. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> Şekil 3. İzole fare omuriliğe dolum işlemi uygulanması. (A) şematik gösteren üç Tip-I omurilik farklı nöronal sınıfları doldurmak için kullanılan pipetler. Motonöronlar (mavi; Cascade Mavi dekstran) ve sakral duyusal aferentlerde (kırmızı; Texas-Kırmızı dekstran) sırasıyla, ventral ve dorsal kökleri aracılığıyla backfilled edildi. Floresein dekstran olan aksonlar ventral kordon (VF) aracılığıyla yükselmek spinal internöronlardan (yeşil) yüklemek için kullanılır. Her bir boya dekstran 1 mg (10.000 MW; Molecular Probes)6 uL distile su içeren% 0.2 içinde eritildi Triton X-100 (B). Etiketli duyusal aferentlerde birkaç kontralateral projeksiyonları esas ipsilateral olduğunu A. Not açıklandığı gibi nöronlar arka etiketli olduğu bir omuriliğin sakral kord bir bölümünün Konfokal görüntü. Etiketli internöronlardan dolgu yan (ok başı) kontralateral iken etiketli motonöronlar dolu ventral kök ipsilateral vardır. 200 mikron Kalibrasyon bar.

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran-amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
<li>McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+neuronal+activity+in+tissue+labeled+by+retrograde+transport+of+Calcium+Green+Dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran.</a> Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).</li>
<li>Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nervous+system+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging nervous system activity.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3(2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+neurons+retrogradely+and+anterogradely+labelled+with+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes.</a> J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).</li>
<li>Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+recording+using+retrogradely+transported+dye+in+the+chicken+spinal+cord%3A+staining+and+signal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).</li>
<li>Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology+II%3A+Extracellular+Suction+Electrode+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication.</a> J. Vis. Exp. (48), e2580(2011).</li>
<li>Smith, J. C., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+brainstem-spinal+cord+preparations+for+study+of+motor+systems+for+mammalian+respiration+and+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion.</a> J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (35), e1660(2010).</li>
<li>Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+reduced+sensorimotor+connections+form+with+normal+specificity+despite+abnormal+muscle+spindle+development%3A+the+role+of+spindle-derived+neurotrophin+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3.</a> J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).</li>
<li>Mentis, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+impairment+of+sensory-motor+connectivity+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neuron. 69, 453-467 (2011).</li>
<li>Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+sacral+neurons+involved+in+activation+of+the+lumbar+central+pattern+generator+for+locomotion+in+the+neonatal+rodent+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Neurosci.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord.</a> Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+spatiotemporal+organization+of+neural+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord.</a> Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).</li>
<li>Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterns+of+vestibular-mediated+synaptic+inputs+to+axial+and+limb+motoneurons+in+the+neonatal+mouse+assessed+by+optical+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording.</a> J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).</li>
<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Biz ifşa hiçbir şey yok.</p

<p class="jove_content"&gt; Biz burada nöronlar, sinirler ve spinal yolları içine boyalar tanıtılması için basit ve düşük maliyetli bir protokolü tanımlar. Bu yöntem, yükleme işlemi süresi için bir yüksek oranda konsantre boya çözeltisine tanımlanan anatomik yollar açığa içerir. Biraz arka plan bilgisi ile hedef sitenin retrograd etiketleme Bu sonuçlar microinjections, banyo uygulama ve elektroporasyon tekniklere nazaran. Bununla birlikte, bu yöntem, bir akson izole edilebilir yollarının sinir sisteminde siteleri ile sınırlıdır. Boya hücre gövd...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td colspan="2"<strong&gt; Malzeme Adı</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="2"&gt; Boru</td&gt;<td&gt; PE90 (IDxOD: 0.034 &quot;x0.050&quot;; Duvar Kalınlığı: 0.008 &quot;)</td&gt;<td&gt; Clay Adams Marka Intermedic</td&gt;<td&gt; 427.421</td&gt;<td&gt; Tip I ve Tip II pipetler için</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NSF-51 (IDxOD: 1/16x1/8; Duvar Kalınlığı: 1/32)</td&gt;<td&gt; PharMed BPT, Cole-Parmer</td&gt;<td&gt; AY242002</td&gt;<td&gt; Esnek borular için</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Şırınga</td&gt;<td&gt; 1ml insülin şırınga, U-100</td&gt;<td&gt; Becton Dickenson</td&gt;<td&gt; 329.650</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; İğne</td&gt;<td&gt; 19G x1-1/2 &quot;Metal Hub İğne</td&gt;<td&gt; MONOJECT</td&gt;<td&gt; 200.136</td&gt;<td&gt; Şırıngaya Tip II pipet Bağlanması</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Alkol Lamba</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Musluk</td&gt;<tdErkek Luer Fişi Adaptörü ile&gt; Üç yollu Musluk</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corp</td&gt;<td&gt; 2C6241</td&gt;<td&gt; Şırınga ile kullanın</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="3"&gt; Holder</td&gt;<td&gt; H-1 elektrot tutucu</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; H-1/12</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mıknatıs standı</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; GJ-8</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mikromanipülatör</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; M-3333</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cımbızlar</td&gt;<td&gt; S &amp; T DUMONT İsviçre 00.632-11</td&gt;<td&gt; DUMONT</td&gt;<td&gt; JF-5 TC</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"&gt; * Bu önerilen malzemelerdir. Herhangi bir uyumlu ürünler ile değiştirilebilir</p

sinirler, yolları ve floresan boyalar ile spinal roots retrograd yükleniyor

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Nöronların Retrograd etiketleme de nöronlar 3-6, kalsiyum ve voltaj duyarlı boyalar yüklemek için kullanılan bir standart anatomik yöntemi 1,2. Genel olarak, boyalar katı kristaller halinde ya da cam pipet kullanılarak lokal baskısı enjeksiyon yoluyla uygulanır. Bununla birlikte, bu birkaç saat boya difüzyonu için gerekli olan, özellikle boya ve azaltılmış etiketleme yoğunluğunun seyreltme ile sonuçlanabilir. Burada boya çözeltisi ile doldurulmuş bir polietilen emiş pipet kullanılarak nöronlar içine flüoresan ve iyon karşı hassas boyaların sokulması için basit ve düşük maliyetli bir teknikle göstermektedir. Bu yöntem, yükleme işlemi boyunca akson ile temas halinde boya yüksek bir konsantrasyonunun muhafaza için güvenilir bir yol sunar.

Biz nöron veya polietilen emme pipet kullanarak herhangi bir nöronal yoluna floresan ve kalsiyum duyarlı boyalar yüksek konsantrasyon tanıtmak için basit ve düşük maliyetli tekniği tanımlandı.

Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor

Nöronların retrograd etiketlenmesi, aynı zamanda nöronlara kalsiyum ve voltaj duyarlı boyaların yüklenmesi için de kullanılan standart bir anatomik yöntemdir1,23-6. ...

Bu prosedürün genel amacı, basit ve düşük maliyetli bir teknik kullanarak nöronlara veya herhangi bir nöronal yola yüksek konsantrasyonda floresan veya iyon duyarlı boya aktarmaktır. Bu işlem, öncelikle tip bir ve tip iki olmak üzere iki tip pipet üretilerek gerçekleştirilir. Ardından, tip bir pipete esnek bir elastomer tüp bağlanır ve hedef nöronal yolun tip bir pipete çekilmesi için pozitif basınç uygulanarak iyi bir sızdırmazlık sağlandığı doğrulanır.Ardından, tip iki pipeti tip bir pipetin içine yerleştirin ve tip bir pipette kalan A CSF'yi aspire etmek için tip iki pipeti kullanın. Daha sonra, tip bir pipete hava kabarcığı oluşturmadan boyayı ekleyin. Son adım, nöronları karanlıkta 6 ile 20 saat arasında inkübe etmektir.Son olarak, tip bir pipet çıkarıldıktan sonra, preparat in vitro, elektrofizyolojik veya morfolojik çalışmalar için hazır hale gelir. Bu tekniğin banyo uygulaması, BOS enjeksiyonu ve elektroporasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, D'nin tanımlanmış bir nöronal popülasyona iletilmesidir. Bu yöntem; tanımlanmış nöronların aktivitesi, bağlantısallığı, morfolojisi ve dağılımı gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Genel olarak teknik pratik gerektirir; özellikle boyanın tip bir pipet içinde seyrelmemesini ve içine hava kabarcığı girmemesini sağlamak önemlidir. Bu prosedüre, konik uçlu iki kısa pipet oluşturmak için polietilen tüpü bir alkol lambasının alevi üzerinde çekerek başlayın. İlk olarak, hedef kökü veya yolu sıkıca tutabilecek küçük uçlu kısa bir tip bir pipet çekin.Ardından, tip bir pipetin ucuna kadar yerleştirilebilen, daha uzun ve ince bir gövdeye ve çok ince bir uca sahip tip iki bir pipet alın. Sonrasında, tip iki pipeti 19 gauge'lik EC klipsli iğneye bağlayın. Daha sonra izole edilen omuriliği bir banyoya yerleştirin.Yükleme işlemi boyunca soğutulmuş A CSF ile süper füzyon gerçekleştirin. Ardından, tip 1 pipeti, arka açıklığının esnek bir tüp aracılığıyla bir şırıngaya kolayca bağlanabileceği şekilde bir elektrot tutucuya yerleştirin. Bu prosedürde, önce bir şırınga kullanarak tip 1 pipetin içine CSF çekin.Ardından, doldurulacak olan aksonal yol veya kökü çizin. Daha sonra esnek tüpü arka açıklıktan çıkarın. Bundan sonra, tip iki pipeti başka bir şırıngaya takın.Bunu, mikroskop altında bir aksonal yolak veya nöronal kökü tutan birinci tip pipete yerleştirin. Kalan A CSF'nin aksonal yolağı sadece kaplayacak kadar olması için, ikinci tip pipete takılı olan şırıngayı kullanarak A CSF'yi aspire edin. Ardından, ikinci tip pipeti birinci tip pipetten geri çekin.Aksonal yol veya sinirlerin iyi mühürlendiğini doğrulamak için A CSF seviyesini birkaç dakika boyunca izleyin. Ardından, boyayı A CSF veya çift distile su içindeki %0,2 Triton X 100 ile çözün. Hava kabarcığı çekmemeye dikkat ederek, bağlı şırıngaya hafif negatif basınç uygulayarak çözeltiyi iki numaralı pipete çekin.Ardından, boya içeren iki numaralı pipeti kalıntı A CSF solüsyonunun içine yerleştirin. Bir numaralı pipette, şırıngaya hafifçe pozitif basınç uygulayarak boyayı yavaşça A CSF içine salın. Herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadığınızdan veya hedef dokunun uç içinden yerinden oynamasına neden olmadığınızdan emin olun. Boya enjekte edilirken bir numaralı pipete bir hava kabarcığı girerse, iki numaralı pipet ucunu kabarcığa yaklaştırıp ardından bağlı şırıngayı kullanarak hafif bir negatif basınç uygulayarak kabarcığı dışarı çekin.Yeterli miktarda boya salındıktan sonra, tip iki pipeti geri çekin. Ardından, deneyin türüne bağlı olarak dokuyu altı ila 20 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. Dolum için yeterli süre geçtikten sonra, elektrodu dokudan nazikçe çekerek çıkarın.Ardından doku, görüntüleme veya histoloji için hazır hale gelir. Burada, motor nöronlara, duyusal afferentlere ve spinal internöronlara aynı anda üç farklı konjuge floresan boyalı dekstranın yüklendiğini gösteren şematik bir diyagram yer almaktadır; motor nöronlar ve sakral duyusal afferentler, sırasıyla ventral ve dorsal kökler aracılığıyla Cascade blue Dekstran ve Texas red dekstran ile geri doldurulmuştur. Aksonları ventral funikulus üzerinden yükselen spinal internöronlara ise yeşil floresan dekstran yüklenmiştir.Burada, nöronların geriye doğru etiketlendiği sakral omurilikten bir kesitin konfokal görüntüsü gösterilmektedir. Etiketli duyusal afferentlerin öncelikle ipsilateral olduğuna dikkat edin. Birkaç kontralateral projeksiyonla birlikte, etiketli motor nöronlar dolu ventral köke göre ipsilateraldir; buna karşılık, ok ucuyla belirtildiği gibi etiketli internöronlar buna kontralateraldir.Bu prosedürün ardından; fonksiyonel bağlantısallık, eksitatör inhibitör dengesi, sinüs tipi, dağılım ve DI alan nöronlarındaki nörotransmitter üretimi gibi temel soruları yanıtlamak amacıyla ek yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, omurilik ve beyin sapı nörofizyolojisi alanındaki araştırmacıların, iyon duyarlı boyalar kullanarak spesifik nöronal popülasyonları belirlemelerine yol açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, izole edilmiş omurilikteki nöronlara ve duyusal liflere floresan ve/veya iyon duyarlı boyaların nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

retrograde-loading-nerves-tracts-spinal-roots-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kalsiyum sinir sistemi her yerde bulunan bir haberci, sinaptik gücü nörotransmitter salınımı ve değişiklikleri tetiklenmesi için gerekli. Burada Ca 2 +-göstergeler Drosophila sinir uçları içine yüklemek için bir teknik göstermektedir. Biz de gerekli aparat imalatı göstermek ve tekniğinin başarısı için kritik noktaları vurgulamak.

Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

Floresan boya retrograd taşıma anatomik projeksiyona dayalı nöronların bir alt-nüfus etiketler. Etiketli akson görsel olarak...

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

Kaynak: İnal, M. A. et. al., Lipofilik Floresan Boyalar Kullanılarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronlarının Retrograd İzlemesi. J. Vis. Uzm.  (2020)Bu video, lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının geriye dönük etiketleme yöntemini göstermektedir. Boya aksona girer, geriye doğru hareket eder ve nöronları yeşil olarak etiketleyerek morfolojilerinin ve projeksiyonlarının konfokal bir mikroskop altında ayrıntılı olarak görselleştirilmesini sağlar.

Floresan lipofilik boyalar kullanılarak Drosophila motor nöronlarının retrograd etiketlenmesi

Kaynak: Wang, J., {{}} ve diğerleri. İmmünofloresan ve Nöral İzleme ile Sıçan Kraniyal Dura Materinin Kalsitonin Geniyle İlişkili Peptit İmmünoreaktif İnnervasyonunun Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2021).  Bu video, floresan mikroskobu kullanarak dura materdeki duyusal nöronların kökenlerini izlemek için bir yöntem göstermektedir. Anestezi uygulanmış bir sıçanın açıkta kalan dura materine retrograd bir izleyici sokulur. İzleyici, duyusal nöronal aksonlar tarafından alınır ve trigeminal...

Floresan mikroskobu kullanılarak dura materdeki duyusal nöronların kökenlerinin araştırılması

Akson ve miyelin yaralanmalarının dinamiklerini gerçek zamanlı olarak aynı anda görselleştirmek için iki foton uyarımlı hızlandırılmış mikroskopi kullanan bir protokol sunuyoruz. Önerilen bu protokol, yaralanma sonrası merkezi miyelinli akson kaderini etkileyebilecek ve kalıcı klinik sakatlığa katkıda bulunabilecek hem içsel hem de dışsal faktörlerin çalışmasına izin vermektedir.

Bir Ex vivo Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Burada, sinir uçlarına kurbağa sinir kütüğünden kalsiyuma duyarlı bir boya yüklemek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, periferik sinir uçlarında hızlı kalsiyum geçişlerinin kaydedilmesi ve analizi için bir protokol de sunuyoruz.

Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Öğrenin, polietilen emiş pipeti kullanarak nöronlara yüksek konsantrasyonda floresan ve kalsiyum duyarlı boyaları düşük maliyetli bir teknikle nasıl yükleyeceğinizi. Bu yöntem, sinirbilim araştırmalarında nöronal aktiviteyi görselleştirmeyi kolaylaştırır.

Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor

Daha fazla video keşfet