Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor

Bu prosedürün genel amacı, basit ve düşük maliyetli bir teknik kullanarak nöronlara veya herhangi bir nöronal yol hattına yüksek konsantrasyonda floresan veya iyona duyarlı boya yerleştirmektir. Bu işlem, öncelikle birinci tip ve ikinci tip olmak üzere iki çeşit pipet üretilerek gerçekleştirilir. Ardından, birinci tip pipete esnek bir elastomer tüp bağlanır ve hedef nöronal hattı birinci tip pipetin içine çekmek için pozitif basınç uygulanır; bu sırada sızdırmazlığın tam sağlandığı doğrulanır.

Ardından, tip iki pipeti tip bir pipetin içine yerleştirin ve tip bir pipette kalan A CSF'yi aspire etmek için tip iki pipeti kullanın. Daha sonra, tip bir pipete hava kabarcığı oluşturmadan boyayı ekleyin. Son adım, nöronları 6 ila 20 saat arasında karanlıkta inkübe etmektir.

Nihayetinde, tip bir pipetin çıkarılmasının ardından preparat in vitro, elektrofizyolojik veya morfolojik çalışmalar için hazır hale gelir. Bu tekniğin banyo uygulaması, BOS enjeksiyonu ve elektroporasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, D'nin belirli bir nöronal popülasyona iletilmesidir. Bu yöntem; belirli nöronların aktivitesi, bağlantısallığı, morfolojisi ve dağılımı gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Genel olarak bu teknik pratik gerektirir; özellikle boyanın tip bir pipet içerisinde seyrelmemesini ve içine hava kabarcığı girmemesini sağlamak önemlidir. Bu prosedüre, konik uçlu iki kısa pipet oluşturmak için polietilen boruyu bir alkol lambasının alevi üzerinde çekerek başlayın. İlk olarak, hedef kökü veya traktı sıkıca tutabilecek küçük uçlu, kısa bir tip bir pipet çekin.

Ardından, birinci tip pipetin ucuna kadar yerleştirilebilen, daha uzun, daha ince gövdeli ve çok ince uçlu ikinci tip bir pipet alın. Sonrasında, ikinci tip pipeti EC klipsli 19 gauge iğneye bağlayın. Ardından, izole edilen omuriliği bir banyoya yerleştirin.

Yükleme işlemi boyunca soğutulmuş A CSF ile süper infüzyon uygulayın. Ardından, tip 1 pipeti, arka açıklığının esnek bir boru aracılığıyla bir şırıngaya kolayca bağlanabileceği şekilde bir elektrot tutucuya yerleştirin. Bu prosedürde, önce bir şırınga kullanarak tip 1 pipete CSF çekin.

Ardından, doldurulacak olan aksonal traktı veya kökü çizin. Daha sonra esnek tüpü arka açıklıktan çıkarın. Bundan sonra, tip iki pipeti başka bir şırıngaya takın.

Bunu, mikroskop altında bir aksonal yol veya nöronal kök tutan birinci tip pipete yerleştirin. Artık A CSF, aksonal yolu sadece kaplayacak şekilde aspirasyon yapmak için şırıngayı ikinci tip pipete bağlayarak kullanın. Ardından, ikinci tip pipeti birinci tip pipetten geri çekin.

Aksonal yol veya sinirler üzerinde sızdırmazlığın sağlandığını doğrulamak için A CSF seviyesini birkaç dakika boyunca izleyin. Ardından, boyayı A CSF içinde veya çift distile suyla hazırlanmış %0,2 Triton X 100 içinde çözün. Hava kabarcığı çekmemeye dikkat ederek, bağlı şırıngaya hafif negatif basınç uygulayarak boyayı tip iki pipete çekin.

Ardından, boya içeren tip iki pipeti kalıntı A CSF solüsyonuna yerleştirin. Tip bir pipetteki boyayı, şırınga ile hafif pozitif basınç uygulayarak A CSF içerisine yavaşça bırakın. Hava kabarcığı oluşmamasına veya hedef dokunun uç kısmının içinden yer değiştirmesine neden olmamaya dikkat edin. Boya enjekte edilirken tip bir pipete bir hava kabarcığı girerse, tip iki pipet ucunu kabarcığa yaklaştırıp ardından bağlı şırınga ile hafif bir negatif basınç uygulayarak kabarcığı dışarı çekin.

Yeterli miktarda boya salındıktan sonra, tip iki pipeti geri çekin. Ardından, deneyin türüne bağlı olarak dokuyu altı ila 20 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. Dolum için yeterli süre geçtikten sonra, elektrodu dokudan nazikçe çekerek çıkarın.

Ardından doku, görüntüleme veya histoloji için hazır hale gelir. Burada; üç farklı konjuge floresan boyalı dekstranın motor nöronlara, duyusal afferentlere ve spinal internöronlara eş zamanlı olarak yüklenmesini gösteren şematik bir diyagram yer almaktadır; motor nöronlar ve sakral duyusal afferentler, sırasıyla ventral ve dorsal kökler aracılığıyla Cascade blue Dextran ve Texas red dextran ile geriye doğru doldurulmuştur. Yeşil floresan dekstran ise aksonları ventral funikülüs boyunca yükselen spinal internöronlara yüklenmiştir.

Burada, nöronların geriye doğru işaretlendiği sakral omurilikten alınan bir kesitin konfokal görüntüsü gösterilmiştir. İşaretli duyusal afferentlerin öncelikle ipsilateral olduğuna dikkat ediniz. Birkaç kontralateral projeksiyonla birlikte, işaretli motor nöronlar dolu ventral kökün ipsilateralindeyken, işaretli internöronlar ok ucuyla belirtildiği üzere bunun kontralateralindedir.

Bu prosedürü takiben, DI alan nöronlarında fonksiyonel bağlantı, eksitatör-inhibitör denge, sinüs tipi, dağılım ve nörotransmitter üretimi gibi temel soruları yanıtlamak için ek yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, omurilik ve beyin sapı nörofizyoloji alanındaki araştırmacıların, iyon duyarlı boyalar kullanarak spesifik nöronal popülasyonları belirlemelerine yol açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, izole edilmiş omurilikteki nöronlara ve duyusal liflere floresan ve/veya iyon duyarlı boyaların nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.