Alerjik Havayolu Enflamasyon sırasındaki solunum Dendritik Hücre olgunlaşması ve Göç Analizi

Bu prosedürün amacı, farelerde Val Boomin ile indüklenen alerjik havayolu inflamasyonu seyri sırasında pulmoner dendritik hücre veya DC maturasyonunu ve migrasyonunu değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle farelerin Val Boomin ile sensitize edilmesi ve ardından fitsy etiketli Val Boomin ile havayolu challenge uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, akciğer ve mediastinal lenf düğümleri toplanır.

Son olarak, akciğer ve lenf düğümü dokularından tek hücre süspansiyonu hazırlanır. Nihayetinde, FITC Val Boomin challenge sonrası mediastinal lenf düğümünde bulunan pulmoner dendritik hücrelerin olgunlaşma durumu ve mutlak hücre sayısı akış sitometrisi analizi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem; dendritik hücrelerin olgunlaşıp olgunlaşmadığı, antijene maruz kalma durumu ve drenaj lenf düğümlerine göç edip etmedikleri gibi pulmoner immün yanıtlarla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Ve eğer göç ederlerse, göç hızının ne olduğu belirlenir. Bir tüp içindeki alum çözeltisine, vortexleyerek, taze hazırlanmış Val Boomin çözeltisini birer birer oranında damla damla ekleyerek başlayın. Karışımı 30 dakika boyunca karıştırın ve ardından bir mililitrelik şırıngayı karışımın 0,2 mililitresi ile doldurun.

Bir elin başparmağı ve işaret parmağını kullanarak, fareyi kafatasının tabanına yakın boyun derisinden kavrayın. Ardından, diğer elinizle Val Boomin alum çözeltisini farenin peritonal boşluğuna enjekte edin. Alum içindeki Val'in ikinci enjeksiyonundan yedi gün sonra, alum ile duyarlı hale getirilmiş anestezi altındaki hayvanı dik pozisyonda tutun ve ardından steril pipet uçları kullanarak, taze hazırlanmış val fxi çözeltisinden 100 microliters miktarını damla damla farenin NAS bölgesine damlatın.

İşleme, bir mililitrelik bir şırıngaya 20 gauge bir kateter takarak başlayın. Ardından, farenin ötanazisinin gerçekleştiğini onayladıktan sonra, fare trakeasını açığa çıkarmak ve kanülize etmek için hayvanın göğüs boşluğunu boyna kadar tamamen açın. Periferik kanda bulunan tüm kontamine alveolar makrofajların ve mononükleer hücrelerin uzaklaştırıldığından emin olmak için akciğerleri lavaj yapmak ve kalbi perfüze etmek kesinlikle kritiktir.

Ve sonraki bu iki adımı dikkatle ve elbette elinizi titretmeden uyguladığınızdan emin olun. Şimdi, alt solunum yolunu durulamak ve alveolar boşluklardaki hücreleri uzaklaştırmak için kateter aracılığıyla üç kez buz gibi soğuk EDTA'lı PBS uygulayın. Ardından, 20 gauge iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, kalbin sağ ventrikülü üzerinden akciğerleri 10 mililitre heparin içeren PBS ile perfüze edin.

Akciğer damarlarındaki kalan tüm kan hücrelerinin temizleme işlemi, akciğerler beyaza döndüğünde tamamlanmış kabul edilir. Ardından, mediastinal lenf düğümlerini çıkararak ayrı bir kaba yerleştirin. Dokunun ışığa maruz kalmasını minimize ederek floresan sönümlenmesini önleyin.

Ardından perfüze edilmiş akciğerleri disseke edin ve bir Petri kabına yerleştirip makas kullanarak akciğerleri küçük parçalara ayırın. Sonra, akciğer dokusunu 37 °C'de 250 units/mL kollajenaz D ile sindirin. 25 dakikalık inkübasyonun ardından, kollajenaz aktivitesini durdurmak için karışıma beş dakika boyunca EDTA ekleyin. Son olarak, sindirilmiş akciğer parçalarını 100 µm hücre süzgecinden geçirin ve eritrositleri hipotonik tamponla lize edin.

Mediastinal lenf nodlarını ince iğneler kullanarak ayırın ve akciğerler için gösterildiği gibi kollajenaz ile sindirin; ardından intraperitoneal, sensitizasyon ve hava yolu challenge sonrası dokuyu bir hücre süzgecinden geçirin. İnflamatuar hücrelerin varlığı, kontrol grubundan alınan temsili akciğer kesitlerinde hematoksilin ve eozin boyama ile değerlendirilebilir.

Salin uygulanan hayvanlarda, üstteki grafikte gösterildiği üzere dokularda enflamasyon görülmemektedir. Buna karşılık, sensitize edilmiş ve tetiklenmiş hayvanlardan alınan akciğer kesitlerinde, alttaki grafikte görülebileceği üzere enflamatuar hücrelerin yaygın olduğu görülmektedir. Alttaki grafikte gösterildiği gibi, mukus üretimini değerlendirmek için periyodik asit-Schiff boyaması kullanılabilir.

Val ile sensitize edilmiş farelerde, val ile challenge sonrası hava yolu alerjik inflamasyonun indüksiyonu, mukusun varlığı ile doğrulanır. Buna karşılık, üstteki grafikte gösterildiği üzere, salin ile tedavi edilen kontrol farelerinde mukus üretiminin tamamen yokluğu görülür; val ile challenge sonrası pulmoner dcs olgunlaşır ve ardından drenaj lenf düğümlerine migrasyon gerçekleştirir.

Buradaki fare mediastinal lenf düğümlerinin temsili bir analizi, Val Boomin ile sensitize edilmiş ve challenge edilmiş hayvanlarda, salin ile tedavi edilen farelere kıyasla CD 11 C pozitif hücrelerin oranında mütevazı ancak tutarlı bir artış olduğunu göstermektedir. Ayrıca, sensitize edilmiş ve challenge edilmiş farelerin mediastinal lenf düğümlerinden alınan CD 11 C pozitif CD 11 B pozitif Val Boomin fits C pozitif hücrelerin mutlak hücre sayısı analizi, challenge edilen farelerde DC sayılarının salin ile tedavi edilen hayvanlara kıyasla birkaç kat daha yüksek bir artış gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, pulmoner dendritik hücre maturasyonu ve migrasyonunu analiz etme tekniğimiz hakkında oldukça iyi bir anlayışa sahip olmalıyız.

Bu tekniği gerçekten kavradığınızda, yöntemi diğer patojenlere ve diğer deneysel faktörlere karşı pulmoner dendritik hücre yanıtlarını değerlendirmek için modifiye edebilirsiniz.