Moleküler Mekanizmalarının Karakterizasyonu

Bu video, sıçanlarda ultraviyole radyasyon kullanarak katarakt oluşturma yöntemini göstermektedir. Katarakt gelişiminde yer alan moleküler mekanizmalar daha sonra kantitatif gerçek zamanlı PCR ve immünositokimya kullanılarak incelenmektedir. İlk olarak, katarakt oluşumunu tetiklemek için sıçanın gözü ultraviyole radyasyona maruz bırakılır.

Diğer göz kontrol olarak kullanılır. Ardından, CAS B'nin üç ifade seviyesini kantitatif gerçek zamanlı PCR ile değerlendirmek için lensler diseke edilir ve RNA elde etmek üzere işlenir veya cleaved caspase'a karşı bir antikor kullanılarak boyanır. Üçü, aktif proteinin ifadesini ve lokalizasyonunu değerlendirmek içindir.

Nihayetinde, bu analizlerden elde edilen sonuçlar, UVR maruziyeti sonrası lens hücrelerinin çekirdeğinde kaspaz üç mRNA'sında ve aktif protein ekspresyonunda bir artış olduğunu doğrulamaktadır. Bu protokolün mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hayvanları iyi tanımlanmış bir UV spektrumu ve dozuna güvenli ve hassas bir şekilde maruz bırakmamıza olanak tanıyan benzersiz bir dar bantlı UVR kaynağı ve evrensel sıçan sabitleyici kullanmasıdır. Ayrıca, lensteki apoptozu incelemek için modern biyolojik teknikler olan kantitatif R-T-P-C-R ve immünohistokimya uyguladık; bu yöntem, ultraviyole radyasyon kaynaklı kataraktın moleküler mekanizmaları hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntem ayrıca ultraviyole veya radyasyon kaynaklı cilt kanserleri, sıçan davranış nörobilimi ve apoptoza odaklanan deneysel göz araştırmaları gibi diğer deneysel modellere de uygulanabilir. Bu protokole, anestezi uygulanmış dişi bir Sprague-Dawley sıçanı bir sıçan sabitleyiciye yerleştirerek ve gövdeyi sıkıştırmadan, sıçan hareketsiz kalana kadar kemerleri sıkarak başlayın. Pupillada midriyazis veya dilatasyon indüklemek için her bir göze 10 mg/mL'lik tropicamide çözeltisinden bir ila iki damla damlatın.

Ardından, maruz bırakılmayacak göze merhem uygulayın ve UV ışınlarını engellemek için siyah bantla kapatın. Sonra, yüksek basınçlı cıva lambasından üretilen, 300 nanometre dalga boyunda ve 10 nanometre yarı değer genişliğinde dar bir ultraviyole radyasyon demeti alacak şekilde hayvanı sabitleyiciye yerleştirin. Sıçanı, tek taraflı olarak 15 dakika boyunca metrekare başına bir kilojoule UVRB eşik altı dozuna maruz bırakın.

Maruz bırakılmayan gözdeki bandı çıkarın ve her iki göze pomad uygulayın. Hayvanı kafesine geri koyun ve sıcak tutmak için üzerini yumuşak kağıtla örtün. Hayvan, sternal rekümbent pozisyonu koruyabilecek kadar bilinci yerine gelene dek takip edin.

Ardından, iyileşen sıçanı diğerleriyle birlikte kafesine geri yerleştirin. Pozlama sonrasındaki 1, 5, 24 ve 120. saatleri takip edin.

Ötanize edilen sıçanın enükle edilmiş gözünü, kornea aşağı ve posterior taraf yukarı gelecek şekilde yumuşak bir kağıt mendil üzerine yerleştirin. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında çalışın. Sklera ile çok yakın konumda olan lense zarar vermemek için, skleraya tanjant olarak iterek minimal bir delik açmak amacıyla 27 gauge kanül kullanın.

Ardından, bir çift oftalmik cerrahi makas kullanarak, sklera'nın posterior kısmı kaldırılabilecek hale gelene kadar limbusun hemen arkasından çevresel olarak kesin. Daha sonra küt uçlu eğri forseps kullanarak lensi kaldırın, lensi dengeli tuz çözeltisine yerleştirin ve siliyer cismin kalıntılarını lensten temizleyin. Lens, dengeli tuz çözeltisinde 10 dakikadan fazla tutulmamalıdır.

Diseksiyonun ardından, bir lensi, NucleoSpin RNA Two Total RNA İzolasyon Kiti'nden 350 µL RA1 lizis tamponu ve 3,5 µL Beamer keto etanol içeren iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, sadece sert nüklüs kalana kadar lensi mekanik olarak homojenize etmek için bir iğne kullanın. Lensin korteksi ve kapsülü lizis tamponu tarafından lize edilecektir.

Çekirdeği karışımdan çıkarın ve atın. Örnekleri derhal -70 °C'de saklayın. İşleme geçilmeye hazır olana kadar örnekler bir yıla kadar saklanabilir.

Örnekleri alın ve RNA'yı kitin kültür hücrelerinden ve dokulardan toplam RNA saflaştırma protokolüne göre saflaştırın. RNA örneklerini -70 °C'de saklayın. Her bir örnekten DNA'nın yeterince uzaklaştırıldığını doğrulamak için, P 53 DNA'ya özgü primerleri kullanarak aşağıdaki koşullar altında DNA amplifikasyonu gerçekleştirin.

Adım 1: 95 °C'de iki dakika. Adım iki: 40 döngü boyunca, 95 °C'de 20 saniye. 55 °C'de 20 saniye.

20 saniye boyunca 72 °C. Adım 3: yedi dakika boyunca 72 °C. Çalışma tamamlandığında, ürünleri %1,5'luk AROS jelinde yürütün.

243 baz çifti uzunluğundaki DNA'ya özgü PCR ürününü tespit etmek için, mutlaka pozitif ve negatif kontrol örnekleri ekleyin. DNA başarıyla uzaklaştırılmışsa, PCR ürünleri görülmeyecektir. RNA örneklerinin konsantrasyonunu ölçmek ve RNA/protein oranını belirlemek için NanoDrop spektrofotometresi kullanıldığında, sadece pozitif kontrol şeridinde bir bant görülmelidir.

RNA örneğinin absorbansının proteinle oranı veya 260/280 oranı 2,0 veya daha fazla ise RNA örneği saftır. Ardından, 1 µg RNA kullanarak, RT-PCR için bir birinci zincir cDNA sentez kiti ile cDNA sentezleyin; cDNA örneklerini -20 °C'de saklayın. Daha sonra kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için örnekleri 96 kuyucuklu bir plakaya üç tekrarlı olarak uygulayın.

Her bir kuyu, caspase 3 için TAC man gen ekspresyonu master mix'i ile birleştirilmiş bir mikrolitre cDNA örneği içermelidir ve bunlar ayrı bir plakada bulunmalıdır. Aynı örnekleri, bu kez 18 s için TAC man gen ekspresyonu analizi kullanarak uygulayın. Ardından, analiz için bir standart eğri oluşturmak amacıyla, rastgele seçilmiş maruz kalmamış üç lensten alınan bir mikrolitre cDNA'yı seri şekilde dilüe edin.

Numunelerden elde edilen cDNA ile birlikte seri dilüsyonlar gerçekleştirin. Her plakada 96 kuyucuklu bir plaka kullanın. Plakayı santrifüjleyin, ardından tek renkli gerçek zamanlı PCR tespit sistemi olan I cycler my iq üzerinde çalıştırın.

Çalışma tamamlandıktan sonra, IQ yazılımımı kullanarak, her plakadaki seri dilüsyonlar için eşik değerindeki döngü sayısını, kalibratörün bağıl konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak ifade eden bir standart eğri oluşturun. Her örnek için ölçülen eşik döngü sayısını kullanarak, örnek cDNA'nın bağıl konsantrasyonunu belirlemek için standart eğriyi kullanın.

Son olarak, hedef cDNA'nın bağıl konsantrasyonunu internal kontrol olan 18 s cDNA ile ilişkilendirerek hedef genlerin ekspresyon seviyesini belirleyin. İmmünohistokimyasal boyama yapmak için gözü diseke edin ve diseksiyon sonrası PBS içine yerleştirin. Gözü %4 paraformaldehit ile doldurulmuş bir tüpe aktarın ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.

Bir mikropipet kullanarak paraformaldehiti uzaklaştırın. Ardından gözü, 1 mL buz gibi soğuk PBS içeren iki mililitrelik bir eppendorf tüpüne aktarın ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Sonrasında, gözü %30 sükroz içeren bir eppendorf tüpüne aktarın.

Dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gözü optimal kesme sıcaklığı veya OCT ortamıyla dolu bir kaba aktarmak için pens kullanın. Gözü, kesitleme işlemi için düz bir konuma getirin.

Ardından, gözü floresan mikroskobu ile analiz etmek üzere kesitlere ayırana kadar, dondurarak saklamak için kabı -70 °C'de kuru buz üzerine yerleştirin. Kriyoseksiyon işlemi için, OCT'ye gömülmüş gözü kriyostat içindeki bir tutucuya yerleştirerek başlayın. Göz lensinin en düz tarafını bıçak kenarına paralel olacak şekilde hizalamaya çalışın.

Her bir lensin orta kısmından beş mikron kalınlığında üç midsagittal kesit alın. Farklı kesitlerde aynı çekirdeklerin boyanmasını önlemek için ardışık kesitler arasında en az altı kesiti atın. Bir kesit alındığında, üzerine nazikçe bir lam yerleştirin.

Ardından kesit lamın üzerine yapışmalıdır. Lamları kullanmadan önce havada kurumaya bırakın. Lamlar, boyama işlemi için gerekli olana kadar -70 °C'de saklanabilir.

Slaytların oda sıcaklığına dönmesini bekleyin. Ardından, beraberindeki belgede açıklandığı şekilde, cleaved CAS phase three'ü belirlemek için antikor boyamasını gerçekleştirin ve birkaç saat içinde slaytları floresan mikroskobu altında inceleyin. Tüm lens epitel hücre çekirdeklerini sayın.

DAPI ile boyanan hücreleri sayarak tüm lens epitel çekirdeklerinin sayısını ve aktif kaspaz 3 işaretli hücreleri sayarak kaspaz 3 pozitif çekirdeklerin sayısını kaydedin. Her kesit için hücreleri üç kez sayın.

Kaspaz 3, apoptozun yürütme aşamasındaki ana proteazdır. Transmisyon elektron mikroskopisi. Çalışmalar, UVR'nin lenste apoptozu indüklediğini desteklemektedir.

Apoptoz üzerine yapılan deneysel çalışmalar, kaspaz üçün güvenilir bir apoptoz belirteci olduğunu doğrulamaktadır. İn vivo UVR maruziyetinin kaspaz üç ekspresyonunu tetikleyip tetiklemediğini belirlemek amacıyla, 300 nanometre dalga boyunda metrekareye bir kilojoule UVR uygulanan in vivo maruziyetin ardından 1, 5, 24 ve 120. saatlerde kristallin lensteki mRNA ekspresyonu QPCR ile ölçülmüştür. Ardından, maruz kalan lens ile karşıt taraftaki maruz kalmayan lens arasındaki CASP üç mRNA'sının 18 S-rRNA'ya oranının ortalaması her bir zaman noktası için grafiğe dökülmüştür.

Bu şekil, zaman içindeki caspase three mRNA ekspresyonunu betimlemekte ve apoptozun transkripsiyonunu göstermektedir. Uzak UVR ortogonal testine maruz kaldıktan sonra lenslerde in vivo olarak incelenen marker caspase three, 120 saatlik latent dönem ile daha kısa latent dönemler arasında caspase three mRNA sinyali açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark ortaya çıkarmıştır. Maruz bırakılmış ve bırakılmamış lenslerdeki caspase three ekspresyonu, bu görüntülerde gösterildiği gibi, maruziyetten 24 saat sonra immunofloresan mikroskopi ile karşılaştırılmıştır; çekirdekler işaretlenmiş olup aktif caspase three varlığını belirtmektedir.

Bu immün boyama yöntemi, lensteki apoptoz belirteci caspase three ile işaretlenmiş epitel hücrelerin uzaysal dağılımı hakkında değerli bilgiler sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, UVR kataraktının deneysel olarak nasıl indükleneceği ve UVR kaynaklı kataraktın moleküler mekanizmasının kantitatif qPCR ve immünohistokimya kullanılarak nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.