Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Bu deney, ekzojen gen ekspresyonunun orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron diferansiyasyonu üzerindeki etkisini incelemek için civciv orta beyninin in ovo elektroporasyonunu göstermektedir. Öncelikle, ekzojen DNA'yı gelişmekte olan orta beyin vezikülüne spesifik olarak hedeflemek için hamburger Hamilton evre 11 civciv embriyolarının orta beynine istenen plazmit DNA enjekte edilir. Ardından, özel yapım küçük elektrotlar kullanılarak, ekzojen DNA'yı spesifik olarak orta beyin nöral progenitorlerine iletmek için orta beyin vezikülüne elektroporasyon uygulanır.

Ardından, orta beyinde iyi M cherry ekspresyonu gösteren 23. evre embriyoları hasat edin ve optimal orta beyin transvers kesitleri oluşturun. Nihayetinde, tirozin hidroksilaz gibi dopaminerjik nöron belirteçleri için yapılan immün boyama analizi, ilgilenilen genlerin ekspresyonu ile indüklenen nöral progenitorlerin olgun dopaminerjik nöronlara farklılaşmasını gösterebilir. Bu tekniğin mevcut diğer in ovo elektroporasyon yöntemlerine göre temel avantajı, bu protokolün mirin dopaminerjik nöron farklılaşmasını incelemek için membrana özgü elektroporasyon sağlayabilmesidir.

Bu yöntem orta beyin gelişimi hakkında bilgi sağlayabilse de, kader haritalama analizi yapmak ve gen ekspresyonunun düzenlenmesini araştırmak için sinir sisteminin diğer bölümlerine de uygulanabilir. Hamburger-Hamilton evre 11 embriyoları elde etmek için, her döllenmiş yumurtayı yan tarafına gelecek şekilde yerleştirin ve üst kısmını kurşun kalemle işaretleyin. Ardından tepsileri, önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir inkübatördeki sarsak platforma yerleştirin.

Döllenmeden sonraki 41. saatte, her 24 saatte bir nemi ve su seviyesini kontrol edin. Yumurtaları inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığında saklayın. Her yumurtanın yüzeyini %70 ethanol ile temizleyin ve silerek kurulayın.

Şimdi, kalemle çizilen çizginin üzerine büyük bir dikdörtgen oluşturmak için iki adet dört santimetrelik şeffaf bandı bir yumurtanın üzerine yan yana yerleştirin. 18 gauge iğne takılı 10 mililitrelik bir şırınga ile pencereyi çerçevelemek için bandı yumurtaya iyice yapıştırın. Embriyoyu rahatsız etmemek veya ona zarar vermemek için iğneyi sarıdan uzaklaşacak şekilde açıyla tutarak yumurta kabuğunu delin.

Yumurtadan beş mililitre albümin çekin. İğneyi %70 etanol ile temizleyin. Bir sonraki yumurtayı delmeden önce iğneyi kurutun.

Alevli kahverengi mikropipet çekici için ayarları girin. Ardından, P 10 pipet kullanarak ince duvarlı kapiler tüpleri enjeksiyon iğnelerine dönüştürün. Uzun uçlu bir kapiler pipet ucuna 5 ila 10 µL plazmid çözeltisi alın.

Ardından, cam iğneyi hava kabarcığı kalmayacak şekilde, sürekli bir sütun halinde yavaşça doldurun. Doldurulmuş iğneyi, mikro manipülatöre ve mikro enjektöre bağlı olan iğne tutucuya yerleştirin. Şimdi, iğneyi daha iyi görebilmek için koyu bir arka plan kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu altında, iğneyi yeşil sıvının durduğu noktadan yaylı makasla kesin.

Önceki iğne deliğinden iki ila iki buçuk santimetre çapında bir pencere açın. Albümin çekmek için. Kesme işlemi sırasında yumurtayı bir elinizde döndürün.

Yumurtalar arasında makasları %70 ethanol ile doyurulmuş bir kim wipe ile temizlemeyi unutmayın. Civciv embriyosunu bir diseksiyon mikroskobu altında incelemeye geçin. Gerekirse, civciv embriyosunun altına PBS içinde 0,22 mikrometre filtrelenmiş %20 India ink enjekte ederek embriyoyu görünür hale getirin. Embriyoyu, başı iğneden uzak olacak şekilde, iğnenin izleme yoluna paralel olarak konumlandırın.

Neural tüpü, orta beyin ve arka beyin birleşim noktasından 45 derecelik bir açıyla yavaşça delin. Süresi 25 milisaniyeye ayarlanmış pico spritzer mikro enjektörler ile enjeksiyona başlayın. İğne ucunun konumuna göre süreyi ayarlayın ve yalnızca orta beyni temsil eden neural vezikülü fast green boyası içeren plazmid DNA ile doldurun.

Enjeksiyon iğnesini geri çektikten sonra, embriyonun üzerine üç damla pen strep solüsyonu damlatın. Verimli bir elektroporasyon için B-T-X-E-M-C eight 30 elektroporatör ayarlarını doğrulayın. Ventral orta beyin konumunda, özel yapım küçük L şeklinde platin elektrotları, embriyonik orta beyin iki elektrot arasında merkezlenecek şekilde, nöral tüpün altıyla aynı yatay seviyeye yerleştirin.

BTX ayak pedalına bir kez basın ve elektrotların etrafında oluşan hava kabarcıklarını gözlemleyin. Her başarılı elektroporasyondan sonra elektrotları yumurtadan dikkatlice çıkarın ve elektrotları silin. %70 ethanol ile ıslatılmış bir kimyasal mendil kullanarak, embriyo üzerine üç damla daha pen strep solüsyonu damlatın.

Şimdi pencereyi beş santimetreye beş santimetre boyutunda şeffaf bir paketleme bandı ile kapatın. Yumurta içeriğine dokunmadan yumurtayı iyice mühürleyin ve yumurtaları, döndürme mekanizmaları kapalı haldeyken inkübatöre geri yerleştirin. İstenen aşamaya ulaşıldığında, canlı embriyoları her bir koşul için PBS dolu ortak bir Petri kabına toplayın.

Ardından, floresan diseksiyon mikroskobu kullanılır. Toplanan embriyolar m cherry ekspresyonu açısından taranır ve pozitif embriyolar 24 kuyucuklu bir plağın ayrı kuyucuklarına aktarılır. Her kuyucuğa taze hazırlanmış 1 mL %2 paraformaldehit eklenir ve 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edilir.

Fikse edilmiş embriyoları 3 kez PBS ile yıkayın; dengeleme gerçekleşip senkronize olana kadar embriyoları %15 sukroz içinde bekletin. Dengeleme işlemini %30 sukrozda tekrarlayın, ardından her bir embriyoyu OCT içine gömün; sonraki analizler için optimal orta beyin kesitleri elde edebilmek amacıyla embriyoları uygun şekilde yönlendirin.

Embriyonik civciv midbrain in ovo elektroporasyon deneyi hh kapsamında, ileriki analizler için kalın orta beynin 18 mikron kalınlığında kriyostat kesitlerini hazırlayın. Evre 11 civciv embriyolarına, m cherry floresan markör ve ilgilenilen genlerden oluşan bir plazmid kokteyli ile enjeksiyon sürecini takip eden fast green boyalı bir izleyici enjekte edilir. Orta beyin elektroporasyonundan sonra embriyolar inkübe edilmeye devam edilir ve m cherry pozitif embriyolar toplanıp fiksifiye edilerek gömülür.

Ardından orta beyin kriyoseksiyonları hazırlanır. Başarıyla enjekte edilmiş ve elektropore edilmiş civciv embriyolarında, tirozin hidroksilaz gibi orta beyin belirteçleri kullanılarak immün boyama ile örnekler analiz edilir. M cherry ekspresyonu, bir enjeksiyon belirteci olarak kullanılarak yapılan gelişim sonrası tipik olarak orta beyin bölgesinde görünür hale gelir.

Uygun m cherry ekspresyonu sergileyen embriyolar daha sonra fikse edilir, gömülür ve orta beyin kriyoseksiyonlarını hazırlamak için yönlendirilir. Burada, elektropore edilmiş nöral progenitörlerde dopaminerjik kaderin spesifikasyonu, m cherry ve flag etiketli genin, dopaminerjik nöron markörü tirozin hidroksilaz ile kolokalizasyonu incelenerek değerlendirilir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA konstrüktlerinin spesifik olarak orta beyin bölgesine nasıl enjekte edileceği ve bu prosedürü takiben küçük, özel yapım elektrotlar kullanılarak elektroporasyonun nasıl tam olarak hedefleneceği de dahil olmak üzere, gen ekspresyonunun embriyonik orta beyin dopaminerjik nöron progenitörlerine bölgesel olarak nasıl kısıtlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Sinir sisteminin belirli bölgelerinde ve hücre tiplerinde gen fonksiyonunu ve gen düzenlemesini incelemek için RNI aracılı kilitleme veya rapor genlerine bağlı güçlendiricilerin ekspresyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.