Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında
August 3rd, 2012
Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem tarif Ovo içinde elektroporasyon. Bu teknik, orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron farklılaşma farklı yönlerini incelemek için ilgi genlerin etkili ifade elde etmek için kullanılabilir.
Bu deney, ekzojen gen ekspresyonunun orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron farklılaşması üzerindeki etkisini incelemek için civciv orta beyninin in ovo elektroporasyonunu göstermektedir. İlk olarak, hamburger Hamilton'un orta beynine, istenen plazmid, DNA ile evre 11 civciv embriyolarını enjekte edin, böylece ekzojen DNA'yı gelişmekte olan orta beyin vezikülüne spesifik olarak hedefleyin. Daha sonra özel yapım küçük elektrotlar kullanarak, eksojen DNA'yı özellikle orta beyin nöral progenitörlerine iletmek için orta beyin vezikülünü elektropore etti.
Daha sonra, orta beyinde iyi M kiraz ekspresyonu olan 23. aşama embriyoları toplayın ve optimal orta beyin enine kesitleri oluşturun. Sonuç olarak, tirozin hidroksilaz gibi dopaminerjik nöron belirteçleri için immüno boyama analizi, nöral progenitörlerin, ilgilenilen genlerin ekspresyonu ile indüklenen olgun dopaminerjik nöronlara farklılaşmasını gösterebilir. Bu tekniğin diğer mevcut in ovo elektroporasyon yöntemlerine göre ana avantajı, bu protokolün mirin dopaminerjik nöron farklılaşmasını incelemek için membrana özgü elektroporasyon sağlayabilmesidir.
Bu yöntem orta beyin gelişimi hakkında fikir verebilse de, kader haritalama analizi yapmak ve gen ekspresyonunun düzenlenmesini araştırmak için sinir sisteminin diğer bölümlerine de uygulanabilir. Hamburger Hamilton, evre 11 embriyolarını elde etmek için, her döllenmiş yumurtayı yan yatırın ve üstünü bir kalem çizgisiyle işaretleyin. Ardından tepsileri önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir inkübatörde bir külbütöre yerleştirin.
Gübrelemeden 41 saat sonra her 24 saatte bir nem ve su seviyesini kontrol edin. Yumurtaları kuluçka makinesinden çıkarın ve oda sıcaklığında saklayın. Her yumurtanın yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve silin.
Şimdi, kalem çizgisinin üzerinde büyük bir dikdörtgen oluşturmak için iki adet dört santimetrelik bant parçasını bir yumurtanın üzerine yan yana yerleştirin. 18 gauge iğneye bağlı 10 mililitrelik bir şırınga ile pencereyi çerçevelemek için bandı yumurtaya karşı düzeltin. Embriyoyu rahatsız etmemek veya zarar vermemek için iğneyi yumurta sarısından uzaklaştırarak yumurta kabuğunu delin.
Yumurtadan beş mililitre albümin alın. İğneyi %70 etanol ile temizleyin. Bir sonraki yumurtayı delmeden önce iğneyi kurulayın.
Yanan kahverengi mikro pipet çektirmesi için ayarları girin. Daha sonra ince cidarlı kılcal boruları bir P 10 pipet ile enjeksiyon iğnelerine çekin. Uzun uçlu bir kılcal pipet ucuna beş ila 10 mikrolitre plazmit çözeltisi alın.
Ardından cam iğneyi hava kabarcıkları olmayan sürekli bir sütuna yavaşça yükleyin. Yüklenen iğneyi mikro manipülatöre ve mikro enjektöre bağlı iğne tutucusuna yerleştirin. Şimdi bir diseksiyon mikroskobu altında, iğneyi daha iyi görselleştirmek için koyu bir arka plan kullanarak, yeşil sıvının durduğu noktada iğneyi yaylı makasla kesin.
Önceki iğne deliğinden iki ila iki buçuk santimetre çapında bir pencere kesin. Albümin çizmek için. Keserken bir elinizle yumurtayı döndürün.
Makası yumurtalar arasında %70 etanole doyurulmuş bir kim mendiliyle temizlemeyi unutmayın. Civciv embriyosunu diseksiyon mikroskobu altında görüntülemeye devam edin Gerekirse, civciv embriyosunun altına PBS'de 0.22 mikrometre filtrelenmiş %20 Hindistan mürekkebi enjekte ederek embriyoyu görselleştirin. Embriyoyu, başı iğneden uzakta olacak şekilde iğnenin yoluna paralel olarak konumlandırın.
Nöral tüpü orta beyin arka beyin kavşağında 45 derecelik bir açıyla yavaşça delin. Pico spritzer mikro enjektörleri ile enjekte etmeye başlayın Süre 25 milisaniye olarak ayarlanmıştır. İğnenin kesilmesine bağlı olarak zamanı ayarlayın, sadece orta beyni temsil eden nöral vezikülü hızlı yeşil boya içeren plazmit DNA ile doldurun.
Enjeksiyon iğnesini aldıktan sonra, embriyonun üzerine üç damla kalem strep solüsyonu yerleştirin. Verimli elektroporasyon için B-T-X-E-M-C sekiz 30 elektro por ayarlarını doğrulayın. Ventral orta beyin pozisyonunda, küçük özel yapım, nöral tüpün dibi ile aynı yatay seviyede, embriyonik orta beyin iki elektrot arasında ortalanacak şekilde L şeklinde platin elektrotlar yaptı.
BTX ayak pedalına bir kez basın, elektrotların etrafında oluşan hava kabarcıklarına dikkat edin. Her başarılı elektroporasyonda, elektrotları yumurtadan dikkatlice çıkarın ve elektrotları silin. % 70 etanol kaplı bir kimyasal mendil ile embriyonun üzerine üç damla daha kalem strep solüsyonu yerleştirin.
Şimdi pencereyi beş santimetreye beş santimetrelik bir şeffaf ambalaj bandı ile örtün. Yumurta içeriğine dokunmadan, yumurtayı iyice kapatın, yumurtaları döner tablalar kapalı olarak kuluçka makinesine geri yerleştirin. İstenilen aşamaya ulaşıldığında, canlı embriyoları her koşul için ortak bir PBS dolgulu Petri kabına toplayın.
Sonra, bir floresan diseksiyon mikroskobu. Hasat edilen embriyoları m kiraz ekspresyonu için tarayın, pozitif embriyoları 24 oyuklu bir tabağın ayrı kuyucuklarına aktarın. Her biri bir mililitre taze yapılmış %2 para formaldehit ile iyice iyileşecek ve dört santigrat derecede üç saat inkübe edecekler.
Sabit embriyoları PB S3 kez yıkayın, embriyoları dengelendikten sonra senkronize olana kadar% 15 sükroz içine yerleştirin. Dengelemeyi% 30 sükrozda tekrarlayın, daha sonra optimal orta beyin oluşturmak için her embriyoyu OCT yönlendirme embriyolarına uygun şekilde yerleştirin. Sonraki analizler için kesitler.
Ovo elektroporasyon testinde embriyonik civciv orta beyninde aşağı akış analizi için kalın orta beynin 18 mikron kalınlığındaki kriyostat bölümlerini hazırlayın, hh. Evre 11 civciv embriyolarına, m kiraz floresan markörü ve ilgilenilen genlerden oluşan bir plazmit kokteyli ve enjeksiyon işleminin hızlı yeşil boyalı bir izleyicisi enjekte edilir. Orta beyin elektroporasyonundan sonra, embriyolar daha fazla inkübe edilir ve m kiraz pozitif embriyolar toplanır, sabitlenir ve gömülür.
Daha sonra orta beyin kriyo kesitleri hazırlanır. Örnekler, başarılı bir şekilde enjekte edilmiş ve elektroporasyonlu civciv embriyolarında tirozin hidroksilaz gibi orta beyin belirteçleri ile immüno-boyama ile analiz edilir. M kiraz ekspresyonu tipik olarak, bir enjeksiyon markörü olarak m kiraz ekspresyonu kullanılarak daha fazla gelişmeden sonra orta beyin bölgesinde görülebilir.
Uygun m kiraz ekspresyonu sergileyen embriyolar daha sonra sabitlenir, gömülür ve orta beyin kriyo bölümlerini hazırlamak için yönlendirilir. Burada, elektroporasyonlu nöral progenitörlerde dopaminerjik kaderin spesifikasyonu, m kirazının ve bayrak etiketli genin dopaminerjik nöron belirteci tirozin hidroksilaz ile kolokalizasyonu ile incelenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA yapılarının özellikle orta beyin bölgesine nasıl enjekte edileceği ve küçük özel yapım elektrotlar kullanılarak elektroporasyonun nasıl belirleneceği de dahil olmak üzere, embriyonik orta beyin dopaminerjik nöron progenitörlerine gen ekspresyonunun bölgesel olarak nasıl kısıtlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
RNI aracılı kilitleme veya rapor genlerine bağlı güçlendiricilerin ekspresyonu gibi diğer yöntemler, sinir sisteminin belirli bölgelerinde ve hücre tiplerinde gen fonksiyonunu ve gen regülasyonunu incelemek için performans gösterebilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, embriyonik tavuk orta beyinde plazmid DNA'nın in ovo elektroporasyonu yöntemiyle dopaminerjik nöron farklılaşması üzerindeki gen ekspresyonu etkilerini araştırmak için bir yöntem göstermektedir. Teknik, genlerin sinir progenitörlerine hedefli teslimini sağlayarak orta beyin gelişimi çalışmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Gen Düzenlemesi
Arka Plan
- Orta beyin dopaminerjik nöronları, çeşitli beyin işlevleri için kritik öneme sahiptir.
- Bunların gelişimini anlamak, nörolojik bozukluklar hakkında içgörüler sağlayabilir.
- In ovo elektroporasyon, gelişmekte olan embriyolara DNA tanıtmak için kullanılan bir tekniktir.
- Bu yöntem, belirli beyin bölgelerinde gen ekspresyonu çalışmalarını geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında gen işlevini değerlendirmek.
- Nöronal farklılaşmada rol oynayan genlerin düzenlenmesini değerlendirmek.
- Orta beyin gelişimini incelemek için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Tavuk embriyolarının orta beynine plazmid DNA'nın enjeksiyonu.
- Gen teslimini kolaylaştırmak için özel elektrotlar kullanarak elektroporasyon.
- Gelişimin belirli aşamalarında embriyoların hasat edilmesi.
- Farklılaşmayı değerlendirmek için dopaminerjik nöron belirteçleri için immünosüsleme.
Ana Sonuçlar
- Orta beyin sinir progenitörlerinde genlerin başarılı ekspresyonu.
- İmmünosüsleme yoluyla dopaminerjik nöron farklılaşmasının gözlemlenmesi.
- Zar-spesifik elektroporasyon avantajlarının gösterilmesi.
- Orta beyin gelişiminde spesifik genlerin rolü hakkında içgörüler.
Sonuçlar
- In ovo elektroporasyon yöntemi, gen ekspresyonu çalışmaları için etkilidir.
- Bu yaklaşım, dopaminerjik nöron gelişiminin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
- Gelecekteki çalışmalar bu tekniği çeşitli genetik araştırmalar için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables targeted gene expression in embryonic chick midbrain dopaminergic progenitors, supporting mechanistic de-risking of therapeutic targets in neurodevelopmental disorders. By allowing region-specific gain- and loss-of-function studies, it enhances predictive confidence in early target validation. The approach provides a disease-relevant system for evaluating gene function prior to lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing gene function in dopaminergic neuron differentiation pathways.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct observation of tyrosine hydroxylase-positive neuron maturation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking gene modulation to dopaminergic fate specification in a vertebrate model.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening via mCherry-positive progenitor identification.
- Quantitative Output: Generates measurable immunostaining readouts for dopaminergic differentiation efficiency.
- Platform Reuse: Supports scalable application across nervous system regions for fate mapping and gene regulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human midbrain dopaminergic development relevant to Parkinson's disease and schizophrenia mechanisms.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by establishing causal gene-phenotype relationships.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria through reproducible differentiation phenotypes in electroporated progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
The technique integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing in dopaminergic development prior to assay development and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking of targets influencing neural progenitor fate.
- Screening: Delivers assay-ready systems with standardized, reproducible transfection in midbrain neural progenitors.
- Analytics: Provides quantitative immunostaining outputs (e.g., tyrosine hydroxylase co-localization) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work via disease-relevant dopaminergic neuron differentiation readouts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for regional gene expression studies across nervous system subsystems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of dopaminergic differentiation.
- Operational Value: Standardization via regionally restricted electroporation and mCherry expression tracking.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neurodevelopmental targets.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on gene effects in a validated dopaminergic neuron model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic chick embryo handling and microsurgical techniques.
- Dependent on custom L-shaped platinum electrodes and precise electroporator settings.
- Necessitates standardized fixation, sectioning, and immunostaining protocols for reproducible analysis.
- Adaptation to other neural regions requires re-optimization of injection sites and electrode placement.
- Practical limitations include embryo viability constraints and signal-to-noise in deep tissue imaging.
