Name: Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Öğrenin, civciv orta beyninde in ovo elektroporasyon yöntemiyle dopaminerjik nöron gelişiminde gen fonksiyonunu nasıl çalışılır. Bu teknik, nöral progenitörlere hedefli gen aktarımı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz pCAG-mCherry inşa sağlamak için Dr Takahiko Matsuda teşekkür ederim. YCM Schweppe Vakfı&#39;ndan bir Kariyer Geliştirme Ödülü ve Whitehall Foundation&#39;ın tarafından desteklenmektedir.

1. (Değil video) Hazırlık Tedarik <ol><li> 1X PBS içinde Penisilin / Streptomisin (Kalem / Strep) taze bir 1X seyreltme hazırlayın. En fazla 50 ml gereklidir. 0.22 um bir şırınga filtresi ile filtreleme. </li><li> Istenilen plazmid yapıları birleştirerek enjeksiyon yapıları hazırlayın. Biz, ~ 10 ul&#39;lik bir son hacim için uygun olan stokiyometri pCAG-bayrak vektör içinde hepsi yapıları koydu. Ayrıca, pCAG-GFP 14 ya pCAG-mCherry izleme elektroporasyon verimliliği ve electroporated hücreleri için ilave edilmelidir. Bu deney için pCAG-mCherry kullanın. Son olarak, embriyonik chick midbrains içine enjeksiyon verim görselleştirme% 0.05 nihai bir konsantrasyon plazmid DNA karışımı içine 0,22 um-süzüldü Fast Green boya ekleyin. </li></ol> 2. Yumurta Hazırlama (video) <ol><li> HH aşaması 11 embriyo elde etmek için, yumurta 100 inkübe edilmesi gerekir ° F (37.8 ° C)% 25-40 nem ile döllenme sonra yaklaşık 41 saat boyunca. Yerve onların tarafında yumurta bir kalemle çizgi ile her üst işaretleyin. Bir önceden ısıtılmış, nemlendirilmiş inkübatörde tepsiler yerleştirin. Yavaşça için inkübatör platformları dönüm işlevini ayarlayarak yumurta sallayın &quot;Otomatik&quot;. Nem ve su seviyesi her 24 saatte bir kontrol edin. </li><li> Sağ deney başlamadan önce, kuluçka yumurta çıkarıp oda sıcaklığında bekletin. Bu gelişme yavaşlatmak ve kalkınma üzerinde önlemek için yardımcı olacaktır. </li><li> % 70 etanol ile her yumurta yüzeyi temizleyin ve bir Kimwipe ile silin. </li><li> Seloteyip iki adet 4 cm al ve kalemle çizgi üzerinde büyük bir dikdörtgen yapmak için yumurta bunları yan yana sopa. Yumurta karşı bant Pürüzsüz. Penceresi yapılacaktır yerdir. Bant pencere açık kesildiğinde kapalı düşmesini kabuğu küçük parçalar önleyecektir. </li><li> 10 ml şırınga ve 18 ½ yumurta albümin üzerinden 5 ml çizmek için iğne kullanın. Rahatsız etmek gibi kabuğu delip sonra sarısı uzak iğne açıalbümin çıkarırken ya da embriyo zarar verebilir. Yumurtalar arasındaki% 70 etanol ile iğne temizleyin, ancak iğne sonraki yumurtaya delerek önce kuru olduğundan emin olun. </li></ol> 3. Cam Enjeksiyon İğnesi Hazırlama (video) <ol><li> Enjeksiyon iğne aşağıdaki ayarları kullanarak yapılan bir Kahverengi Mikropipet Çektirme (Sutter Enstrüman Model P-97) / Flaming: Isı 670, Pull 120, Vel 40, Zaman 165. Dünya Precision Instruments (API) 4 inç 1.0 mm cam kılcal ince duvarlı (API TW100F-4) iğneler hale getirmek için kullanılır. </li><li> Bir P10 pipet ve uzun ucu kapiller yükleme pipet (Eppendorf 5.242.956,003) kullanarak çekti cam iğne yükleyin. Enjekte edilecek kaç yumurta bağlı olarak, 5-10 uL yükleyin. Hava kabarcıklarının yokluğu plazmid çözeltisi sürekli bir sütun oluşturarak, yavaş cam iğne doldurun. </li><li> Mikromanipülatör (Narishige mm3) ve Picospritzer III mikroenjektör bağlı iğne tutucuya yüklenen iğne yerleştirin. Bir dissecti altında iğne görüntülemekmikroskop ve yeşil sıvı durur noktada iğne kırpın. Daha iyi iğne görselleştirmek için karanlık bir arka plan kullanmanıza yardımcı olur. Kırparak Uygun iğne uygulaması ile birlikte geliyor. </li></ol> 4. Ortabeyin / Nöral Tüp Enjeksiyon (video) <ol><li> Yumurta bir 2-2.5 cm çapında pencere kesmek için bahar makas kullanın. Albümin çizerken yapılan önceki iğne deliğinden pencereyi başlatın ve kesmek gibi elinizde yumurta döndürün. Yumurtalar arasındaki% 70 etanol içinde doymuş bir Kimwipe ile makas kapalı temiz emin olun. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu altında civciv embriyosu görüntüle. Bu gözler yetiştirmek için gerekli olabilir. Bu civciv embriyo altında PBS 0.22 um-filtre% 20 Türkiye mürekkep enjekte edilerek embriyo görselleştirmek için yardımcı olabilir. Bununla birlikte, mümkünse de sağkalım azaltma eğilimdedir olarak, bu basamak, kaçınılmalıdır olduğunu bulduk. </li><li> Embriyo iğne yoluna paralel olarak konumlandırılmış eğer Enjeksiyon uzak iğne başı, en iyi çalışır.Yavaşça delip Ortabeyin-arka beyin kavşağına 45 derecelik bir açıyla nöral tüp. Sadece ön beyin ve arka beyin bölgeye önemli difüzyon olmadan, plazmid DNA ve Fast Green boya ile Ortabeyin temsil nöral vezikül doldurmak için çok önemlidir. 25 ms Picospritzer mikroenjektör süresini set ile enjekte başlayın; bu iğne kırparak bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Genel olarak, 10-50 ms arasında kullanılacak. </li></ol> 5.. Elektroporasyon (video) <ol><li> Enjeksiyon iğnesi alın. Yer embriyo üzerinde yumurta PBS çözüm 1X Kalem / Strep 3 damla. </li><li> BTX EMC830 elektroporatörün ayarlarını da kontrol edin: <table border="1"><tbody><tr><td> GERİLİM: </td><td> 20 V </td></tr><tr><td> PULSE UZUNLUĞU: </td><td> 25 ms </td></tr><tr><td> # BAKLİYAT: </td><td> 3 </td></tr><tr><td> ARALIK: </td><td> 500 ms </td></tr><tr><td> POLARİTESİ: </td><td&gt; PARAMETRİK </td></tr></tbody></table></li><li> İki ayrı 3 mm elektrotlar arasındaki orta oturan embriyonik Ortabeyin ile, sinirsel tüpün alt aynı yatay bir seviyede 2 mm uzunluğunda L-şekilli platin elektrotlar yerleştirin. Nöral tüp alt ile elektrotlar hizalama ventral orta beynin verimli elektroporasyon için önemlidir. Orta beyin özel elektroporasyon başarmak için, kısa 2 mm uzunluğunda uçları ile iki ısmarlama platin L şeklinde elektrotlar ile orijinal BTX elektrotlar yerini aldı. Bu platin elektrot çapı 0.5mm platin teller (Alfa Aesar) yapılır. Bu platin elektrot yeterli uzunlukta çok ön beyin veya arka beyin bölgelerinin hedef olmadan uzun yaklaşık 0.9 mm olup, bir sahne 11 civciv embriyo, bir orta beyin fazlasını kapsamaktadır. BTX ayak pedalı bir kez basın. Hava kabarcıkları her başarılı elektroporasyon ile elektrot etrafında oluşturulmuş edilmelidir. Dikkatlice yumurtadan elektrotlar ve elektrikli silin% 70 etanol kaplı Kimwipe ile kapalı niteliğindeki dizelerde. Embriyo üzerinde yumurta 1X Kalem / Strep çözüm, başka bir 3 damla yerleştirin. </li><li> Şeffaf koli bandı x 5 cm parça 5 cm ile pencereyi kapatın. Iyi ve yumurta mühür yumurta içeriğini bant ile temas olmadığından emin olun. </li></ol> 6. Inkübe ve Hasat <ol><li> Inkübatör geri yumurta yerleştirin. Inkübatör platformların dönüm kapalı olduğundan emin olun. İstenen HH aşaması 23 elde edilene kadar, yumurtalar inkübe. </li><li> Hasat canlı embriyo ve her bir durum için ortak PBS dolu Petri içine yerleştirin. Ekran mCherry ifade ile yalnızca embriyolar tutarak, bir floresan diseksiyon mikroskop altında embriyo biçilir. </li><li> 24-iyi çanak bireysel kuyulara embriyo transferi. Taze yapılmış% 2 paraformaldehid (PFA) ile 1 mL, her sıra doldurmak ve 4 2-3 saat sabitlemek için izin ° C. </li><li> 10 dakika PBS içerisinde her biri için sabit bir embriyo üç kez yıkanır. Yer embriyolar sırayla in% 15 ve dengelenir kadar% 30 sakkaroz. Embriyolar ilk sakkaroz uçuyorlar, ama denge üzerine batar. </li><li> Her embriyo için mCherry ifade desen ve düzeyde notlar alarak, bir floresan diseksiyon mikroskop altında embriyo kontrol edin. OCT her embriyo Embed. Bu şekilde sonraki analizlerde (Şekil 1) için en uygun orta beyin kesitleri oluşturmak için şark embriyo çok önemlidir. </li><li> Leica CM3050S kriyostat kullanan 18 mikron kalınlığında orta beyin kesitler hazırlayın. Uygun hücre tipi işaretleri ile immünboyama tarafından orta beyin gelişimi ve dopaminerjik hücre farklılaşması analiz edin. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Embriyonik chick Ortabeyin electroporating ve analiz şematik bir temsilini Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Başarılı bir şekilde enjekte edilir ve electroporated civciv embriyolarının, mCherry ifadesi daha da geliştirilmesi sonra orta beyin bölgesinde görünür olmalıdır ( <strong&gt; Şekil 2A, B, C). MCherry diğer ortak electroporated genlerin ifadesi ile korele olduğunu varsayarsak, uygun mCherry ifade sergileyen embriyolar daha sonra sabit ve daha fazla çalışma (Şekil 2B) için orta beyin cryosections hazırlamak için gömülü olabilir. Genel olarak, ventral ortabeyin sinirsel progenitörlerin yaklaşık% 50 etkili bir şekilde yukarıda protokolü ile transfekte edilebilir. Electroporated nöral progenitörlerin dopaminerjik kaderin özellikleri mCherry eş yerelleştirme tarafından muayene edilebilir, örneğin Tirozin hidroksilaz (TH) (Şekil 3) dopaminerjik nöron işaretleri ile, gen Bayrak etiketli. Ventral orta beyindeki progenitör etki desenlendirme farklı progenitör alanı işaretleri ile eş immnostaining cryosections tarafından incelenebilir. Yetersiz mCherry ifade ektopik genlerin olasılıkla verimli ifade olmadığını göstermektedir. Bu koşul altında Embriyolar ileri çalışmalar için kullanılmamalıdır. Benzer şekilde, embriyolardeneysel işlemin sonuna kadar ayakta kalmadı veri toplama ve analiz için kullanılamaz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig1.jpg" /> Şekil 1. Ovo elektroporasyon deneyde embriyonik civciv Ortabeyin çizimi. HH aşamada 11 embriyonik civciv embriyo (A) enjeksiyon işlemi görselleştirmek için hızlı yeşil karışık ilgi genler ile birlikte pCAG-mCherry ile enjekte edilir. DNA yapıları ile dolu sonra midbrains bir kare dalga elektroporatörün ile electroporated edilir. İstenen HH aşamada 23 ulaşılana kadar embriyolar daha inkübe edilir. Sonra mCherry pozitif embriyolar, hasat sabit ve gömülü (B) vardır. Orta beyin cryosections Şekil 1B beyaz çizgi ile gösterilen uçak kesim ile hazırlanmış ve bu Tirozin hidroksilaz (TH) (C) gibi orta beyin işaretleri ile immünboyama ile analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig1large.jpg" target="_blank">tıklayınız</a>büyük rakam görüntülemek için. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig2.jpg" /> Şekil 2,. Embriyonik chick Ortabeyin gelen cryosections hazırlanması. 41 saat inkübasyondan sonra, mCherry ve faiz genleri ifade HH aşamada 23 civciv embriyosu, PFA ile sabit sakaroz ile tedavi ve cryosectioning için OCT gömülü, (A, B ve C) hasat edilir. Chick embriyosu dikkatle Ortabeyin bölümlerin hazırlanması sağlamak üzere yönlendirilmektedir. Orta beyin bölümleri elde etmek için tipik bir embriyo morfolojisi ve kesme düzlemi (D) gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4017/4017fig3.jpg" /> Şekil 3. Electroporated Ortabeyin kesitler. MCherry ifade düzeyi yüksek olan embriyolardan Cryosections (A) antibod ile hazırlanan ve boyananilgi Bayrağı etiketli geni (B) ve orta beyin dopaminerjik nöron işaretleyici TH (C) kabul ler. PCAG-mCherry ve pCAG-Bayrak boş vektör kontrolü görevi ile electroporated Embriyonik midbrains. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4017/4017fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Wightman, R. M., Robinson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+changes+in+mesolimbic+dopamine+and+their+association+with+%27reward%27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'.</a> J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).</li>
<li>Kelley, A. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroscience+of+natural+rewards%3A+relevance+to+addictive+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs.</a> J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).</li>
<li>Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathophysiology+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular pathophysiology of Parkinson's disease.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).</li>
<li>Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine%2C+depression+and+antidepressants%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dopamine, depression and antidepressants.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).</li>
<li>Sesack, S. R., Carr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+prefrontal+cortex+inputs+to+dopamine+cells%3A+implications+for+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia.</a> Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).</li>
<li>Ang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development.</a> Development. 133, 3499-3506 (2006).</li>
<li>Andersson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intrinsic+determinants+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons.</a> Cell. 124, 393-405 (2006).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Series+of+Normal+Stages+in+the+Development+of+the+Chick+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo.</a> J. Morphol. 88, 49(1951).</li>
<li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellairs%2C+R+%22The+atlas+of+chick+development%22">The atlas of chick development</a>. , 2nd edn, Elsevier. (2005).</li>
<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
<li>Momose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li>
<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Nishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+in+vivo+gene+transfer+using+intraarterial+plasmid+DNA+injection+following+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation.</a> Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408(2007).</li>
<li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39, 73-78 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar, ifşa etmek, potansiyel hiçbir çıkar çatışmaları var.

Embriyonik civciv orta beyin ve ovo elektroporasyon de düşük maliyet ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişiminde gen fonksiyonlarının in vivo çalışma gerçekleştirmek için transgenik veya bayıltıcı hayvanların nesli hızlı bir alternatif sunuyor. Embriyonik orta beyin-spesifik DNA enjeksiyonu ile birlikte kısa 2 mm L şeklinde uzun bir platin elektrot kullanarak orta beyin dopaminerjik nöron progenitörlerin ilgi geninin etkin ifadesi ulaşmak için anahtardır. Buna ek olarak, HH doğru aşamalı 11 c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Döllenmiş tavuk yumurtası </td><td> Charles River Laboratuvarları </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kuluçka </td><td> GQF İmalat </td><td> 1502 Sporcu </td><td></td></tr><tr><td> BTX Elektroporatör </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Elektrotlar </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0162 L-şekilli genetrodes </td><td> ECM830 elektroporatörün ile kullanım için </td></tr><tr><td> Platin iridyum tel </td><td> Alfa Aesar </td><td> # 10056 </td><td> 0,5 mm çaplı 2 mm uzun elektrotlar yapmak için </td></tr><tr><td> Cam kılcal tüp </td><td> Dünya Hassas Çalgı </td><td> TW100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader pipet </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956.003 </td><td></td></tr><tr><td> Çini mürekkebi </td><td> Staples </td><td></td><td> Kullanmadan önce 20% süzmek </td></tr><tr><td> Mikroenjektör </td><td> Parker Otomasyon, Parker Hannifin İşbirliği </td><td> Picospritzer III </td><td></td></tr><tr><td> Floresan diseksiyon mikroskobu </td><td> Leica </td><td> MZ16F </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet çektirmenin </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> D-97 </td><td></td></tr></tbody></table>

dopaminerjik nöron geliştirme gen fonksiyonunun Çalışılması için chick orta beyin içinde ovo elektroporasyon yılında

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Ventral orta beyin kontrolü hareketi bulunan dopaminerjik nöronlar, duygusal davranış ve ödül mekanizmaları 1-3. Ventral orta beyin dopaminerjik nöronların disfonksiyon, Parkinson hastalığı, şizofreni, depresyon, demans ve 1-5 rol oynar. Böylece, orta beyin dopaminerjik nöron farklılaşma yönetmelik okuyan orta beyin gelişimi ve nöral progenitör kaderi özellikleri düzenleyen mekanizmalar çok önemli ipuçları sadece sağlamaz, ama aynı zamanda insan nörolojik bozukluklar çeşitli tedavisi için yeni tedavi stratejileri geliştirmelerine yardımcı olur. Dopaminerjik nöronların embriyonik ventral orta beyin içinde, ventriküler zon döşeyen sinirsel öncü hücrelerden ayırt. Sinir progenitörlerin gelişimi gen ifadesi programları 6,7 tarafından kontrol edilir. Burada (th Hamburger Hamilton (HH) evre 11 Ortabeyin özellikle genleri ifade elektroporasyon kullanan teknikleri raporirteen Somitlerin, 42 saat) civciv embriyolarının 8,9. Civciv embriyo gelişimi dış sonraki gelişim zaman noktalarında 10-13 belirlenen etkileri ile özgün embriyonik aşamalarında uygun deneysel manipülasyonlar, sağlar. Erken evre HH 13 (ondokuz Somitlerin, 48 saat) daha Chick embriyonik nöral tüp sinir sisteminin farklı hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahiptirler multipotent nöral progenitörlerin oluşur. Bir CMV organizatörü ve bir civciv β-aktin artırıcı hem de içeren pCAG vektör, Bayrak veya embriyonik civciv nöral tüp 14 diğer epitop etiketli yapıları sağlam bir ifade verir. Bu yazıda, DNA embriyonik Ortabeyin bölgeye özel olarak inşa ve nasıl küçük ısmarlama elektrotlar ile elektroporasyon saptamak için nasıl enjekte dahil embriyonik orta beyin dopaminerjik nöron ataları, bölgesel açıdan kısıtlı gen elde etmek için özel önlemler üzerinde durulmuştur. C AnaliziDaha sonraki aşamalarda hödük Ortabeyin plazmid vektör aracılı kazanç fonksiyon-ve orta beyin gelişimi kaybı fonksiyon-çalışmaları için in vivo sistemde mükemmel bir sağlar. Deneysel sistem modifikasyonu kaderi haritalama analizi gerçekleştirmek için ve gen ifadesinin düzenlenmesinde araştırmak için sinir sisteminin diğer bölümlerine tahlil uzatabilir.

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem tarif<em&gt; Ovo içinde</emEmbriyonik civciv ventral orta beyin dopaminerjik nöron ataları içine plazmid DNA yapıları&gt; elektroporasyon. Bu teknik, orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron farklılaşma farklı yönlerini incelemek için ilgi genlerin etkili ifade elde etmek için kullanılabilir.

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Ventral orta beyinde yer alan dopaminerjik nöronlar; hareketi, duygusal davranışı ve ödül mekanizmalarını kontrol eder1-3. Ventral orta beynin disfonksiyonu...

Bu deney, ekzojen gen ekspresyonunun orta beyin gelişimi ve dopaminerjik nöron farklılaşması üzerindeki etkisini incelemek için civciv orta beyninin in ovo elektroporasyonunu göstermektedir. İlk olarak, ekzojen DNA'yı gelişmekte olan orta beyin vezikülüne spesifik olarak hedeflemek amacıyla, hamburger Hamilton evre 11 civciv embriyolarının orta beynine istenen plazmit DNA enjekte edin. Ardından, özel yapım küçük elektrotlar kullanarak, ekzojen DNA'yı spesifik olarak orta beyin nöral progenitörlerine iletmek için orta beyin vezikülüne elektroporasyon uygulayın.Ardından, orta beyinde iyi M cherry ekspresyonu gösteren 23. evre embriyoları hasat edin ve optimal orta beyin transvers kesitlerini hazırlayın. Sonuç olarak, tirozin hidroksilaz gibi dopaminerjik nöron belirteçleri için yapılan immün boyama analizi, ilgili genlerin ekspresyonu ile indüklenen nöral progenitörlerin olgun dopaminerjik nöronlara farklılaşmasını gösterebilir. Bu tekniğin mevcut diğer in ovo elektroporasyon yöntemlerine göre temel avantajı, mirin dopaminerjik nöron farklılaşmasını incelemek için membran spesifik elektroporasyon sağlayabilmesidir.Bu yöntem orta beyin gelişimi hakkında bilgi sağlayabilse de, kader haritalama analizi yapmak ve gen ekspresyonunun düzenlenmesini incelemek amacıyla sinir sisteminin diğer bölümlerine de uygulanabilir. Hamburger-Hamilton evre 11 embriyoları elde etmek için, her döllenmiş yumurtayı yan tarafına konumlandırın ve üst kısmını kurşun kalemle işaretleyin. Ardından tepsileri, önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir inkübatördeki sallayıcıya yerleştirin.Döllenmeden 41 saat sonra, her 24 saatte bir nemi ve su seviyesini kontrol edin. Yumurtaları inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığında saklayın. Her bir yumurtanın yüzeyini %70 etanol ile temizleyin ve kurulayın.Şimdi, kalemle çizilen çizginin üzerine büyük bir dikdörtgen oluşturacak şekilde iki adet dört santimetrelik şeffaf bandı bir yumurtaya yan yana yerleştirin. Bandı yumurtaya iyice yapıştırarak, 18 gauge iğne takılmış 10 mililitrelik bir şırınga ile pencereyi çerçeveleyin. Embriyoyu rahatsız etmemek veya ona zarar vermemek için iğneyi sarıdan uzağa doğru eğerek yumurta kabuğunu delin.Yumurtadan beş mililitre albümin çekin. İğneyi %70 ethanol ile temizleyin. Bir sonraki yumurtayı delmeden önce iğneyi kurulayın.Alevli kahverengi mikro pipet çekicisi için ayarları girin. Ardından, ince duvarlı kapiler tüpleri P 10 pipet kullanarak enjeksiyon iğnelerine dönüştürün. Uzun uçlu bir kapiler pipet ucuna 5 ila 10 µL plazmid çözeltisi çekin.Ardından, cam iğneyi hava kabarcığı içermeyen sürekli bir sütun halinde yavaşça doldurun. Doldurulmuş iğneyi mikro manipülatöre ve mikro enjektöre bağlı olan iğne tutucusuna yerleştirin. Şimdi, iğneyi daha iyi görebilmek için karanlık bir arka plan kullanarak, bir diseksiyon mikroskobu altında, yeşil sıvının durduğu noktadan yaylı makasla iğneyi kesin.Önceki iğne deliğinden iki ila iki buçuk santimetre çapında bir pencere kesin. Albümini çekmek içindir. Kesme işlemi sırasında yumurtayı bir elinizde döndürün.Yumurtalar arasında makasları %70 etanol ile doyurulmuş bir kim wipe ile temizlemeyi unutmayın. Civciv embriyosunu bir diseksiyon mikroskobu altında incelemeye geçin. Gerekiyorsa, civciv embriyosunun altına PBS içinde 0,22 mikrometre filtrelenmiş %20 Hindistan mürekkebi enjekte ederek embriyoyu görünür hale getirin. Embriyoyu, başı iğneden uzak olacak şekilde, iğnenin yoluna paralel olarak konumlandırın.Neural tüpü, orta beyin ile arka beyin birleşim noktasından 45 derecelik bir açıyla yavaşça delin. Süresi 25 milisaniyeye ayarlanmış pico spritzer mikro enjektörler ile enjekte etmeye başlayın. İğnenin ucuna bağlı olarak süreyi ayarlayın ve sadece orta beyni temsil eden neural vezikülü fast green boyası içeren plazmid DNA ile doldurun.Enjeksiyon iğnesini geri çektikten sonra, embriyonun üzerine üç damla pen strep solüsyonu damlatın. Verimli elektroporasyon için B-T-X-E-M-C eight 30 elektroporatörünün ayarlarını doğrulayın. Ventral orta beyin pozisyonunda, özel yapım küçük L şeklinde platin elektrotları, embriyonik orta beyin iki elektrodun arasında merkezlenecek şekilde, nöral tüpün altı ile aynı yatay seviyeye yerleştirin.BTX ayak anahtarına bir kez basın ve elektrotların etrafında oluşan hava kabarcıklarını gözlemleyin. Her başarılı elektroporasyondan sonra elektrotları yumurtadan dikkatlice çıkarın ve elektrotları silin. %70 etanol ile ıslatılmış bir kimyasal temizleme bezi kullanarak, embriyo üzerine üç damla daha penisilin-streptomisin çözeltisi damlatın.Şimdi pencereyi beş santimetreye beş santimetrelik şeffaf paketleme bandı ile kapatın. Yumurta içeriğine dokunmadan yumurtayı iyice mühürleyin ve yumurtaları, döner tablalar kapalıyken tekrar inkübatöre yerleştirin. İstenilen evreye ulaşıldığında, yaşayan embriyoları her bir koşul için PBS dolu ortak bir Petri kabına toplayın.Ardından, floresan diseksiyon mikroskobu kullanılır. Toplanan embriyolar m cherry ekspresyonu açısından taranır ve pozitif embriyolar 24 kuyucuklu bir plağın ayrı kuyucuklarına aktarılır. Her kuyucuğa taze hazırlanmış 1 mL %2 paraformaldehit eklenir ve 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edilir.Fikse edilmiş embriyoları 3 kez PBS ile yıkayın; embriyolar dengeye gelip senkronize olana kadar %15 sakkaroz içinde bekletin. Dengeleme işlemini %30 sakkaroz ile tekrarlayın, ardından her bir embriyoyu OCT içine gömün; sonraki analizler için optimal orta beyin enine kesitleri elde edebilmek amacıyla embriyoları uygun şekilde yönlendirin.Embriyonik civciv orta beyin ovo elektroporasyon deneyi hh'de, aşağı yönlü analizler için kalın orta beyinden 18 mikron kalınlığında kriyostat kesitleri hazırlayın. Evre 11 civciv embriyolarına, m cherry floresan belirteç ve ilgi duyulan genlerden oluşan bir plazmid kokteyli ile enjeksiyon sürecini takip etmek için fast green boyalı bir izleyici enjekte edilir. Orta beyin elektroporasyonundan sonra embriyolar inkübasyona devam ettirilir ve m cherry pozitif embriyolar toplanıp, fikse edilip gömülür.Ardından orta beyin kriyoseksiyonları hazırlanır. Başarıyla enjeksiyon yapılan ve elektropore edilen civciv embriyoları, tirozin hidroksilaz gibi orta beyin belirteçleri ile immün boyama yöntemiyle analiz edilir. M cherry ekspresyonu, enjeksiyon belirteci olarak kullanıldığında, gelişimin devamını takiben tipik olarak orta beyin bölgesinde görünür hale gelir.Uygun m cherry ekspresyonu sergileyen embriyolar daha sonra fikse edilir, gömülür ve orta beyin kriyoseksiyonlarını hazırlamak için yönlendirilir. Burada, elektropore edilmiş nöral progenitorlerde dopaminerjik kaderin belirlenmesi, m cherry ve flag etiketli genin dopaminerjik nöron markörü tirozin hidroksilaz ile kolokalizasyonu aracılığıyla incelenir. Bu videoyu izledikten sonra, DNA konstrüktlarının spesifik olarak orta beyin bölgesine nasıl enjekte edileceği ve bu prosedürü takiben küçük, özel yapım elektrotlar kullanılarak elektroporasyonun nasıl noktasal olarak gerçekleştirileceği dahil olmak üzere, gen ekspresyonunun embriyonik orta beyin dopaminerjik nöron progenitorlerine bölgesel olarak nasıl kısıtlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.RNI aracılı kilitleme veya rapor genlerine bağlı güçlendiricilerin ekspresyonu gibi diğer yöntemler, sinir sisteminin spesifik bölgelerinde ve hücre tiplerinde gen fonksiyonunu ve gen düzenlemesini incelemek için kullanılabilir.

in-ovo-electroporation-chick-midbrain-for-studying-gene-function

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Ovo elektroporasyon Civciv kuş embriyonun genetik manipülasyon sağlayan bir tekniktir. Bu tekniğin yaygın uygulamalar genlerin fonksiyonel analiz ve olası artırıcı unsurları içerir. Bu video HH 10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon göstermektedir. Enjeksiyon tekniği ve uygun yumurta taşıma tartışılmıştır.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl...

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Nöral tüp içinde gen ekspresyonunu bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde aşağı regüle olabilen göre bir yöntem tarif edilmektedir. Biz nasıl...

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında

Dış ifade beyin gelişiminde microRNA rolünü izah etmek için bir tekniktir. Ancak, ovo elektroporasyon kullanarak belirli alanları hedefleyen zordur. Burada, biz verimli bir şekilde seçici electroporate ventral ve dorsal orta beyin bölgeleri göstermek.

Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade

Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

İşitme organı işitmeye aracılık eder. Burada, gelişmekte olan tavuk işitme organında işitsel progenitör hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için optimize edilmiş modifiye edilmiş bir in ovo mikro-elektroporasyon yöntemi sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Öğrenin, civciv orta beyninde in ovo elektroporasyon yöntemiyle dopaminerjik nöron gelişiminde gen fonksiyonunu nasıl çalışılır. Bu teknik, nöral progenitörlere hedefli gen aktarımı sağlar.

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Daha fazla video keşfet