Rat splenositlerin T Hücre Büyüme Faktörü hazırlanması

Merhaba, ben Christine Beaton. Irvine'deki California Üniversitesi Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'nde George Chen'in laboratuvarında yardımcı araştırmacıyım. Ve önümüzdeki iki gün içinde size T hücresi büyüme faktörü anlamına gelen TCGF'yi nasıl hazırlayacağınızı göstereceğim.

Bu nedenle, günlük hücre kültürümüz için, kültür ortamındaki sitokinlerin bileşimi hakkında kesin bir bilgiye ihtiyaç duymadığımızda, kullandığımız şey, T hücrelerinin genişlemesine yardımcı olmak için gerekli sitokinleri içeren spl CY kültüründen S süpernatantı olan T hücresi büyüme faktörüdür. TCGF'yi hazırlama şeklimiz, sağlıklı Louis farelerini öldürdüğümüzde, dalaklarını aldığımızda, tek hücreli süspansiyon hazırladığımızda, kırmızı kan hücrelerinden onlarla birlikte kurtulduğumuzda ve sonra mono nükleer hücreleri a'da con carnaval ile uyaracağız, bu da T hücrelerini büyümeleri için gerekli tüm sitokinleri üretmeye teşvik edecek. TCGF'yi oluşturmak için hücreleri aktive etmemiz gerekiyor.

Yani bunu yapma şeklimiz, hücre kültürümüze korona A olarak kısaltılmış bir lektin konvel ekleyeceğiz. Yani a'daki konkunu hücre kültürümüze eklediğimizde, glikosile edilmiş T hücresi reseptör kompleksine bağlanacak ve aynı anda birkaç komplekse bağlanacak, kapatma dediğimiz şeyi yapacak. Yani toplanacak, hücrenin yüzeyindeki tüm reseptörlerden bir küme oluşturacak ve bu T lenfositlerinde bir aktivasyon sinyali indükleyecek.

Yani hücreler aktive olduktan sonra patlayacaklar. Yani büyüyecekler ve sonra sitokin salgılamaya başlayacaklar. Başlangıçta TCGF'nin esas olarak interlökin iki olduğunu düşündük, ancak şimdi durumun gerçekten böyle olmadığını biliyoruz.

Aynı zamanda interferon gama TNF alfa ve muhtemelen hücreleri 48 saat sonra canlı tutmak için gerekli olan çok küçük miktarlarda sitokinler içerir Kültürde, hücreler ihtiyacımız olan tüm sitokinleri üretmiştir. Bu yüzden hücreleri çıkaracağız ve hücreleri çıkardığımızda ve sadece süpernatanı elde ettiğimizde, snat'ta hala bir miktar serbest konalimiz var. Ve bu bir sorun olacak çünkü T hücresi büyüme faktörümüzü T hücresi hatlarının büyümesini sağlamak için gerçekten kullanmak istiyoruz.

Ve eğer konvelasyonu orada serbest bırakırsak, aktive olmalarını istemediğimizde hücreleri aktive edecektir. Bu sorunu aşmak için, yedikteki tüm serbest konklara bağlanacak fazla miktarda şeker ekleyeceğiz. Bu yüzden tamamen inaktive edilecek ve TCGF'yi kültüre eklediğimizde hücrelerdeki diğer glikosile reseptörlere bağlanmayacaktır.

Öyleyse başlayalım. Bu deneyin ilk adımı, ötenaziden hemen sonra fareden dalak çıkarmaktır. İşte hemen steril aletler kullanarak yapacağım şey bu.

Ve dalakları çıkardıktan sonra, onları antibiyotiklerle desteklenmiş PBS'ye koyacağım ve antibiyotik olarak penisilin ve streptomisin kullanacağım. Öyleyse başlayalım. Bu yüzden, kültürümde herhangi bir kirlenme olmadığından emin olmak için fareye% 70 etanol püskürtüyorum.

Ve sonra aletlerimi kullanarak, burada deride küçük bir kesik açacağım. Sonra kas tabakasını çıkarırım ve dalak tam burada belirir. Bu yüzden başka cımbız alıyorum, dalağı zarar vermeden nazikçe çekiyorum.

Bağ dokusunu bu şekilde çıkarıyorum. Şimdi bir dalağım var. Tabii ki, karın boşluğunun içindeki başka hiçbir şeye zarar vermemeye çok dikkat ediyorum çünkü bağırsaktaki herhangi bir hasar dalağımın hemen kirlenmesine yol açacak.

Ve sonra dalağımı PBS artı antibiyotik içeren bir tüpe aktaracağım. Ve bu tüpü buzun üzerinde tutuyorum. Şimdi üç farenin dalaklarını topladım.

Bu yüzden gidip bu dalaklardan tek hücreli bir süspansiyon hazırlamaya hazırız. Artık dalaklarım olduğuna göre, 70 mikron hücre eğiticileri kullanarak onlardan tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için onları bir doku kültürüne getirdim. Bu yüzden dalaktan tek hücreli süspansiyonu yapmak için birkaç şeye ihtiyacım olacak.

Steril aletlere, bir çift forseps ve bir makasa ihtiyacım var. Sonra Petri kabında steril bir mil şırınganın pistonu var. Dalaklarımı PBS artı antibiyotiklere koyacağım.

Ve başka bir Petri kabına, 10 mililitre PBS artı antibiyotik içine 70 mikron hücre süzgeci koydum. Bu yüzden ilk adım, dalakların temiz olduğundan emin olmaktır çünkü burada gördüğünüz gibi, hala küçük konjonktürel doku parçaları var ve onları çıkaracağım çünkü hücre süzgecini çok hızlı tıkayacaklar. Bunun için, istemediğim şeyi kesip Petri kabının kapağına atıyorum.

Şimdi dalaklarım çoğunlukla temiz, bu yüzden dalakları tek tek alacağım, hücre eğiticisine koyacağım ve küçük parçalar halinde keseceğim ve üç ple'yi de karıştırıyorum. Bir sonraki adım, tek hücreli bir süspansiyon yapmaktır. Tabii ki her şeyi istediğim için, hücre eğiticisine hiç dokunmuyorum ve dalak parçalarımı hücre eğiticisinden geçirmek için steril bir mil şırınganın pistonunu kullanıyorum.

Ve hücre eğiticisinin dışında gördüğünüz gibi, tek hücreli bir süspansiyon yapılıyor. Bu yüzden ilk kez hala bazı küçük dalak parçalarım var, ama zaten tek hücreli süspansiyonu çıkaracağım. Zaten buz üzerinde sakladığım 50 mil'lik bir tüpe aktardım.

Ve hücre süzgecimi 10 mil daha PBS ve antibiyotikle dolduracağım. Bu yüzden PBS'imden yaklaşık 10 mil daha antibiyotikli alıyorum, çok kesin olarak 10 dakika olmak zorunda değil, sadece yıkıyoruz. Hücre süzgecine koydum ve sonra aynı prosedürü kullanıyorum.

Şırınga pistonuma geri dönüyorum ve ocid'e biraz daha bastırıyorum. Yani tabii ki hiçbir zaman her şeyi elde edemezsiniz çünkü hücre süzgecinde kalacak olan konjonktürel doku ve çıkaramadığım küçük yağ parçaları var. Ancak hücre süzgeci için dalağınızın çoğunu almalısınız.

Ve sonra daha önce yaptığım şeyi aynen tekrarlıyorum. Tek hücreli süspansiyonumu alacağım ve aynı dişe ekleyeceğim. Şimdiye kadar, hücre tarayıcısında ekrandan neredeyse hiçbir şey kalmadı ve çıkan PBS çok daha net Ve bir kez daha yıkayacağım ve şimdiye kadar hücrelerin çoğunu dışarı çıkarmış olmalıyız.

Şimdi tek hücreli PLE sitel süspansiyonuma sahibim ve onları basitçe paletlemek için döndüreceğim. Yani sekiz ila 10 dakika eğirmek yeterli olacaktır. Şimdi PLE sitelerimizi küçülttüğümüz için güzel bir paletimiz var.

Şimdi yapacağım şey süpernatanttan kurtulmak ve sonra kırmızı kan hücrelerini yalan söylemeye gidiyorum. Bu yüzden miyositleri askıya alacağım ve amonyum klorüre gideceğim. Yani bu bir SU, oh noktası 15 molar amonyum klorür çözeltisi ve dalak başına beş mililitre kullanacağım.

Üç dalağım olduğu için, 15 mililitre amonyum klorür kullanacağım ve bunu buz üzerinde yapacağım. Eritrositleri yatmak için, üç dakika boyunca nazikçe yukarı ve aşağı sıkacağım. Tamam, bu çekimi burada daha yüksek pozlama ile kullanacağız.

Şimdi üç dakika boyunca elektrositleri analiz ettim. Tüpümü PBS ile dolduracağım ya da siz de medium kullanabilirsiniz. Bu, çözeltinin ozmolaritesini hücreler için normal aralığa geri getirmek içindir.

Ve hücreleri daha önce yaptığım gibi sekiz ila 10 dakika boyunca döndüreceğim ve onları topaklayacağım. Ve sonra onları aynı PBS'yi antibiyotiklerle iki kez yıkayacağım. Şimdi elektrositleri boyutlandırdıktan sonra hücrelere yayıyoruz ve endişelenmeyin, elektrositlerin yüzde yüz salınımını asla elde edemeyiz.

Böylece palet hala kırmızı olacak, ancak süpernatan daha net olacaktır. Ve şimdi süpernatanı boşaltacağım, paleti kıracağım, 50 mil'e kadar biraz PBS ekleyeceğim, aşağı çevireceğim ve bu adımı bir kez daha tekrarlayacağım, böylece iki yıkama yapacağım Ve sonra kendimi sayabileceğim. Miyositleri iki kez yıkadım ve sonra onları kültür ortamında askıya aldım ve sitometrenizi kullanarak saydım.

Beklendiği gibi. Üç dalaktan yaklaşık 600 milyon hücre elde ettim, bu beklenen bir şey çünkü bir dalak normalde bize 200 ila 250 milyon hücre veriyor. Şimdi yapacağım şey, %10 fetal kal serum ile takviye edilmiş besiyerimde hücrelerimi değirmen başına 2 milyon olacak şekilde tohumlayacağım.

Ve bu ortama, hücreleri uyarmak için her değirmen A için iki mikrogram ekleyeceğim. Ve bundan sonra hücreleri 48 saat boyunca inkübatöre koyacağım. Hücreler 48 saattir kuluçka makinesindeler ve size göstereceğim gibi, oldukça iyi büyüdüler.

Orta turuncuya döndü. Bu yüzden artık TCGF için hazırlıklarımızı tamamlamaya hazırız. Hatırlayacağınız gibi, hücreleri aktive etmek için hücre süspansiyonuma bir con carnaval ekledim.

Yani a'daki con karnaval lektindir. T hücresinin tüm reseptörlerindeki şekerleri bağlayacak ve tüm bu hücreleri yapay olarak aktive edecek. Şu anda sahip olduğumuz sorun şu ki, S süpernatanı hücresinde hala bazı kon karnavallara sahibiz.

Ve hücreleri genişletmek için diğer T hücre kültürlerinde bir snat kullanacağımız için, bu hücre kültürlerinde mevcut olan karnavalın olmasını istemiyoruz. Bu yüzden ondan kurtulmak için, yapacağım şey, bir araya gelen fazla şeker eklemek ve bu da burada gösterilen metil alfa D siti. Ve bu şekerin fazlasını ekleyeceğim, tamamen çözeceğim.

Kalan tüm konik donanmayı bir araya getirecek ve bu yapıldıktan sonra, hücre süpernatantlarımı steril filtreleyeceğim ve önümüzdeki birkaç hafta veya ay içinde kullanmak üzere Ali sıvılarını donduracağım. Öyleyse bu son adım için başlayalım. Bu yüzden hücre kültürü süpernatanımı 50 millik tüplere ekliyorum ki hücrelerden kurtulmak için onları döndürebileyim.

Bu yüzden gerektiği kadar tüp dolduruyorum ve bunu kültür başlığında yapmıyorum, yapabilirim, ama sonunda kendi çözümümü filtrelemek için herhangi bir yola ihtiyacım olduğu için, steril olmayan şekeri ekliyorum, bunu sadece tezgahta yapıyorum. Bu daha kolay. Şimdi tüm hücrelerimi ve süpernatanı 50 mil şahin tüplerime döktüm.

Bu yüzden onları santrifüje getireceğim ve yaklaşık 10 dakika döndüreceğim. Ve onları döndürmenin tek nedeni, hücreleri topaklamaktır, böylece net süpernatantlara sahip olurum. Hücreler şimdi yayıldı, bu yüzden süpernatan açık ve toplamak istediğim şey buydu.

Bu yüzden tüm süpernatanı 150 santimetre karelik temiz bir şişeye toplayacağım. Ve bu şişeye şekeri ekleyeceğim. Bu yüzden hücreler dönerken, ml süpernatan başına 15 miligram eklemek için yeterince şeker tarttım.

Tamamen bırakacağım, çözülmesine izin vereceğim ve ondan sonra süpernatantımı steril olarak filtreleyeceğim. Şimdi şekeri ml süpernatan başına 15 miligram ekleyeceğim. Kapağı geri taktım ve steril koşullarda çalışmadığım için kapağın içine yemek girip girmemesi önemli değil, bu yüzden şekerin tamamı eriyene kadar karıştırıyorum.

Bu oldukça hızlı olmalı. Evet, şekerin tamamı artık çözüldü. Bu yüzden tek yapmam gereken steril filtrenin süpernatan olması ve sonra onu alikot edeceğim.

Bu yüzden normalde eksi 20 derecede sakladığım 10 ila 15 mil alikot yaparım. Bunun gibi alikotlar birkaç ay saklanabilir. TCGF'nizi buzdolabında da saklayabilirsiniz, ancak daha sonra önümüzdeki 10 ila 15 gün içinde kullanırdım.

Son iki gün boyunca, size T hücresi büyüme faktörünü nasıl hazırlayacağınızı gösterdim ve bu süpernatantın yapımı çok basit ve hazırlanması çok ucuz. Bu nedenle, pahalı sitokin kokteylleri satın almak zorunda kalmadan kültürdeki T hücre hatlarımızı korumak için laboratuvarda çok sık kullanıyoruz. Deneylerinizde iyi şanslar.