Name: Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi In Vitro Kan Beyin Bariyeri Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Öğrenin, fare beyninden mikrovasküler endotelyal hücre izolasyonu ve ölümsüzleştirme yöntemini. Bu protokol, kan-beyin bariyeri modelleri oluşturarak nöroinflamatuar hastalıkların tedavi değerlendirmelerine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma hibe sayısı FO 315/4-1 ve DFG SFB 688 altında Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG tarafından desteklenmiştir.

1. Beyin mikrodamar İzolasyonu <ol><li> Her hazırlanması için iki cinsiyetten beş-on yenidoğan farelerin (3-5 günlük) kullanın. </li><li> Lokal IACUC / veteriner önerilerine uygun olarak, bir fare Euthanize, hemen beyin kaldırmak ve aşağıdaki çözeltisi içeren bir Petri kabı içine devri: 15 mM Hepes (pH 7.4), 153 mM NaCI, 5.6 mM KCI, 2.3 mM CaCI2 x 2 2H O, 2,6 mM MgCl2 x 6H 2 O,% 1 (w / v) BSA (bundan sonra tampon A olarak anılacaktır). </li><li> Aksi belirtilmedikçe, tüm izolasyon prosedürler laminer akış başlık altında oda sıcaklığında (RT), (22-24 ° C) sıcaklıkta yapılmalıdır. Tampon içinde, beyincik ve kılcal fragmanlarının giderme sonra, beyin (beyincik ve beyin sapı olmadan beyin) kesin bir steril bir bisturi ile. Doku kadar parçaladı pipet ve aşağı hiçbir kümeleri görünür kadar bir 10 ml pipet kullanarak. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de 50 ml Falcon tüp ve santrifüj içine süspansiyon aktarın. </li></ol> Not: zarları beyin dokusu yüzeyinde ince, şeffaf bir membran gibi tespit edilebilir. Bunlar dikkatle steril forseps ile temizlenebilir. <ol start="4"><li> Süpernatantı atın. </li><li> 4.5 ml tampon içinde çözülür pelet A% 0.75 1,5 ml (w / v) ile kolajenaz / dispase (Roche) ve 37 dakika 45 ° C su banyosu içinde (bazen sallama) için inkübe edilir. </li><li> Bu arada, kolajen IV (0.1 mg / 50 mM asetik asit içerisinde çözülmüş mi) ile kaplama dört kuyu ile 12 oyuklu plakalar hazırlanır. 1 saat boyunca bağlı kalmanıza olanak sağlar. </li><li> 15 ml buz gibi soğuk tampon A süspanse iyice pelet ilavesi ile sindirim durdurun. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> Miyelin kaldırmak için, 4 ° C&#39;de 20 dakika süre ile 1000 x g 10 ml% 25 (w / v) BSA (Sigma, saflık&gt;% 98) ve santrifüj eklemek % 25 BSA, 1 x PBS (PAA Laboratories) içinde çözüldü ve 0.2 um f süzülmesi gerekmektedirilter). </li><li> Süpernatant dikkatlice atın, 10 ml Tampon A pelet çözülür ve yeni bir Falcon tüp transfer. </li><li> RT az 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. Elde edilen pelet, endotel hücreleri içerir. </li><li> PBS ile iki kez IV kollajen kaplı 12-plaka yıkayın. </li><li> Iki kuyular, her bir kuyucuğa 2 ml içine 4 ml büyüme ortamı (DMEM% 10 FCS, 50U/ml penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin içeren) ve plaka, hücre süspansiyonu içinde pellet yeniden süspanse edin. 37. az 45 dakika için 4 ug / ml ile inkübe bir nihai konsantrasyon ° bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde C puromisin ekleyin. Bu adım, hızla yapışması hücrelerin çıkarılmasını sağlar Not:. Puromisin 24 saat boyunca ilave edilir. Sadece beyin EC diğer hücre türleri için puromisin 14 toksiktir, metabolize olabilir. </li><li> Iki taze kuyular (bu kuyulardan AK fraksiyonu içeren) içine adım 1.14 dışı yapıştırılmış hücreleri içeren 2 ml orta aktarın. Ste gelen yapıştırılır hücreleri ile kuyu doldurunp 2 ml taze orta (bu kuyulardan diğer hücre türleri, örneğin fibroblastlar, astrositler içerir ve paralel büyüdü ve morfolojisinin karşılaştırmalar için de kullanılabilir) ile 1.14. </li><li> Ertesi gün orta değiştirin. </li></ol> 2. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde ölümsüzleştiren <ol><li> GP + E-86 Neo (GPENeo) 15, fibroblastlar, salgılayan,% 10 ısı ile aktifliği giderilmiş FCS, 50U/ml penisilin / streptomisin, ve 2 mg / ml G418 (ihtiva eden DMEM ortamı içinde Polyoma orta T onkogen ile bir replikasyon-eksikliği virüs yetiştirmek . jelatin kaplı şişeler içinde PAA Laboratories) Not: Polyoma orta T onkogen transfeksiyondan 4-6 hafta kültüre endotel hücrelerinin morfolojisi olan bir tek tabaka, homojen olmayan bir yol açan-ECS EC üzerinde bir büyüme avantajı neden olur. GPENeo piyasada mevcut değildir ve (özgün yayınlar için 4,16 bakınız) paylaşılan ortak malzeme olarak elde edilebilir. </li><li> Için virüs içeren bir ortamda kullanmak<html> ölümsüzlük, 24 saat boyunca G418 serbest ortamda GPENeo hücreleri yetiştirmek. </li><li> GPEneo süpernatan, 10 ml çıkarın ve 8 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona Polybrene (hexadimethrine bromür) (Sigma) eklenir, hücre parçaları ortadan kaldırmak için filtre aracılığıyla steril 0.45 mikron. </li><li> Bölüm 1 &#39;de hazırlanan EC kültürlerden büyüme ortamı çıkarın ve kuyulara GPEneo süpernatan / Polybrene karışım 2 ml ekleyin. Bir taze GPEneo Polybrene / süpernatant karışımının kullanılması ile bir sonraki gün tekrarlayın Not:. Polybrene viral partiküller) ile enfeksiyon kolaylaştırmak için hücre duvarı içinde gözenekler yapmak için kullanılır. </li><li> GPEneo süpernatant / Polybrene karışım ertesi gün çıkarın, PBS ile iki kere yıkayın hücrelerini ve her 3 günde bir değiştirilmesi büyüme ortamında hücreleri korumak. Izdiham üzerine, kollajen IV kaplı plakalar üzerinde hücrelerinin 01:02 bölün. </li><li> Tipik olarak, istikrarlı serebral endotel (cEND) hücre hatları 4-5 hafta sonra alınmalıdır. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde yetiştirilmesi <ol><li> 10 ml önceden ısıtılmış ortam ile 15 ml Falcon-su banyosu içinde ve transfer cryoaliquot gelen hücreleri çözülme. </li><li> RT az 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> Ortamı çıkarın (kaplama için hücre yoğunluğu en az 1x 10 4 hücre / ml olmalıdır) önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile kollajen IV kaplamalı T 25 cm 2 hücre kültürü şişesi içinde pelet aktarın. </li><li> Ertesi gün orta değiştirin ve hücrelerin birleştiği ulaştıktan sonra (genellikle 5 gün sonra) hücreleri bölme. </li></ol> 4. CEND-hücrelerinin Yarma (Not: Yarma sadece haftada bir kez Yapılmalıdır, 1:4 daha yüksek Yarma kaçının). <ol><li> , Orta kaldır PBS ile hücreleri yıkayın. </li><li> 37 inkübe sıcak tripsin-EDTA çözeltisi (PAA Laboratories) (T 75 cm 2 balon), 3 ml ekleyin ° C ve hücre tabakası (genellikle 5 ila 15 dakika içinde) lana kadar bekleyin. </li><li> 5 ml o eklemef büyüme, orta ve aşağı yukarı pipetle, ve IV kaplı şişesi yeni kollajen transfer. </li></ol> 5. CEND-hücrelerinin dondurulması <ol><li> Adım 4&#39;te tarif edildiği gibi hücre süspansiyonu elde edilir </li><li> RT az 5 dakika boyunca 250 xg&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> 6 ml dondurma ortamına (% 95 büyüme ortamı,% 5 DMSO) içinde hücre peleti (1 T 75 cm2 şişeye elde edildi) yeniden süspanse edin. </li><li> . One kriyo-kısım T 25 cm 2 balon üzerine numaralı seribaşı olabilir: Dört 1.5 ml&#39;lik kriyo-alikotları Not içine hücre süspansiyonu bölün. </li><li> Sıvı azot buharında sıcaklık altında kriyo-alikotları saklayın. </li></ol> 450 ml DMEM,% 10 FCS, 10 ml L-glutamin,% 2 MEM-Kit,% 2 NEAA, 10 ml sodyum piruvat, 50 U / ml penisilin / streptomisin: büyüme ortamı cEND 6. Temsilcisi Sonuçlar CEND ve cerebEND hücrelerin endotel a immunostainings ile karakterize edildind BBB transendothelial elektriksel direnci (Teer) ve geçirgenlik ölçümleri ile yanı sıra markers. CEND ve cerebEND izdiham büyüme inhibisyonu sergilenen sıkışık uzamış hücre mono tabakaları ile beyin EC primer kültürlerinde, benzer bir morfoloji vardı. Hücreleri gibi immunofloresan (Şekil 3) 4,5 ile gösterildiği gibi hücre-hücre birleşme lokalize Claudin-5, occludin ve VE-cadherin proteinlerin kadar, algılanabilir bir seviyeleri ifade edilmiştir. Serum azaltılmış ortamda kültüre cEND hücreleri Teer bir artışa (Ωcm 2 150 dan% 2 serum varlığında 500 Ωcm 2 ila% 10 serum varlığında) hidrokortizon ilave potansiyalize edildi (800 Ωcm yol açmıştır 2) veya insülin (1.000 Ωcm 2) 4. 21 gün için serum azaltılmış bir ortamda kültürlenen cEND tek katmanlarını olan 900 Ωcm 2 (Şekil 4) Teer. Teer bir montaj kullanılarak ölçüldüiçeren akım geçen ve gerilim ölçme elektrotları (Dünya Hassas Aletler). Karşılaştırma için, birincil mikrovasküler beyin EC Ωcm 2 ve piyasada satılan bir fare hücre hattı bEnd.3 Abbot 2005 ve Toth ve ark görmek son değerlendirme için 100-140 Ωcm 2 (of Teer değerleri vardı 200-600 arasında Teer değerleri rapor edilmiştir ark., 2011 17,18). Buna ek olarak, 4 saat boyunca bu gibi şarjlı olmayan moleküler kütleleri 4, 10, 70 ve 500 kDa FITC-dekstran, veya% 2 FCS türev ortam içinde cEND bir tek tabaka boyunca fluoresein (300 Da) gibi makromoleküller, ve geçiş azalmıştır % 10 FCS içeren büyüme ortamında tutulan kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında: paracellular akı FITC-dekstran 10 ve 70 kDa için% 26, floresein kontrol hücrelerin% 30 düşürüldü ve akı FITC için kontrol hücrelerin% 4,5 &#39;e düşmüştür -dextrtan 500 kDa. Değerleri Teer benzer şekilde, geçirgenlik gluc varlığında kültüre hücrelerinde düşük olduğu görüldüocorticoids (GC) 4. Daha sonraki çalışmalarda, biz glukokortikoid hedef gen, occludin, Claudin-5 ve beyin damar endoteli 4,7,9 bölgesindeki VE-cadherin belirlenmiştir. GC tedavi, bu proteinlerin ekspresyonunda bir artışa ve hücre iskeleti ile VE-cadherin yeniden düzenlenmesine yol açtı. Sıkı kavşak proteinlerin occludin ve Claudin-5 doğrudan GC-aracılı yönetmelik kendi promotor bölgelerinde 4,7,19 GC yanıt elemanları aracılığıyla görünür. Ayrıca, Claudin-5 vasküler endotel 10 bir roman östrojen hedef olarak tespit edilmiştir. Endotel disfonksiyonu altında yatan pek çok farklı hastalıklar. Oksijen / glikoz yoksunluğu (OGD) koşullar altında cEND kültüre. OGD GC ve proteazom inhibitörü bortezomib 12 ile kombine tedavi sonrası tekrar oluşturulabilmektedir BBB fonksiyonunun bozulmasına yol açtı. OGD koşullarda glukoz alımını güçlü bir artışa yol açmıştır ve glikoz Taşıma ifadesindemk801, NMDA-reseptörü 13 bir rekabetçi olmayan inhibitör ilavesiyle zayıflatılmış olabilir cerebEND içinde ters. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Şekil 1. Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cEND) izolasyon bir hafta sonra. Işık mikroskopisi resim morfolojisi 6x (A) ve 15x (B) büyütme altında alınmıştır. Endotel hücreleri ada oluşan koloniler görebilir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Şekil 2. Izolasyon ve ölümsüzlük sonra beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cEND) Morfoloji bir ay. Işık mikroskobu fotoğrafları 15x büyütme altında alınmıştır. Bir birleşik, homojen endotel hücre monolayer görülebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Şekil 3,. Ölümsüzleştirdi beyin microvascular endotel hücreleri ekspres Claudin-5, occludin ve VE-kaderin. CEND hücreleri kollajen IV kaplı lamelleri yetişen ve Claudin-5 karşı antikorlar (A), occludin (B) ve VE-kaderin (C) ile boyandı. Görüntüler 40x büyütme altında bir Zeiss Axioscop2 mikroskop kullanılarak alınmıştır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Şekil 4. CEND monolayer. CEND arasında transendothelial elektriksel direncinin ölçülmesi (Teer) IV kollajen kaplı transwell filtreler (gözenek boyutu 0,4 mikron) üzerinde yetiştirilmiştir. Izdiham ulaştıktan sonra, hücreler,% 2 FCS ihtiva eden ortam içinde muhafaza edildi. Teer akım geçen ve gerilim ölçme elektrotları içeren bir derleme kullanarak 7, 14 ve 21 gün sonra ölçüldü.

<ol><li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113(2011).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937(2008).</li>
<li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872(2005).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475(2005).</li>
<li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37(2006).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413(2006).</li>
<li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19(2009).</li>
<li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937(2007).</li>
<li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139(2008).</li>
<li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298(2010).</li>
<li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293(2010).</li>
<li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081(2011).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen%2Fglucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44(2012).</li>
<li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279(2005).</li>
<li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203(2002).</li>
<li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+of+the+blood-brain+barrier%3A+incomplete+presentation+of+protein+%28auto-%29antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757(1990).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5(2005).</li>
<li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+CNS+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107(2011).</li>
<li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39(2008).</li>
<li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125(1994).</li>
<li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100(1994).</li>
<li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327(2001).</li>
<li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521(1990).</li>
<li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101(1994).</li>
<li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435(1990).</li>
<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315(2010).</li>
<li>Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkaper%2C+SD+%22Methods+in+Neurosciences%22">Methods in Neurosciences</a>. Conn, M. 2, 1303(1990).</li>
<li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin%2C+an+endothelial+anticoagulant+protein%2C+is+absent+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362(1986).</li>
<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada tarif edilen prosedür vasküler endotelyum fonksiyon olarak belirli değişiklikler incelemek için çeşitli fare suşlarının yanı sıra farklı knock-out fare suşları AK haplarına reçetesiz mikrovasküler izolasyonu için de kullanılabilir. Ölümsüzleşme için bir yöntem olarak, mürin polyomavirus, Polyoma orta T antijen onkoprotein ile dönüşüm kullanılır. Bu, in vivo ve in vitro 20,21,22 hızla olgunlaşmamış endotel hücreleri dönüştürür. Literatürde tanımlanan EC arasında ölümsüzleşme diğer yöntemler, örneğin SV40 büyük Simian Virüs Vacuolating T antijen 40 23, adenovirüs E1 gen ürün 24 ya da insan telomeraz 3&#39;ün katalitik alt birimi aşırı ekspresyonu ile ölümsüzleşme içerir. PymT ile ölümsüzleşme kısa bir süre içinde neonatal fareden homojen bir AT kültürü elde olanak mürin olgunlaşmamış EC için spesifiktir. Ölümsüzleşme hücreleri ve inci özelliklerini değiştirirölümsüzleştirilmiş hücre hatları ile elde edilen sonuçlar e birincil hücreler ile birlikte ya da fareler, in vivo deneyler ile ya da karşılaştırılması gerekmektedir. PymT ölümsüzleştirdi AT ürokinaz tipi plazminojen aktivatörü artan üretiminden kaynaklanan fibrinolitik aktivite yüksek düzeyde ifade açıklanan ve plazminojen aktivatör inhibitörleri 25 üretimi azalmıştır. PymT Doğrudan karşılaştırma vitro BBB modellerinde hem de T hücre adezyonu çalışmalarında 26 için uygun olduğunu ortaya ilköğretim bEND5 hücre hattı, AK haplarına reçetesiz ölümsüzleştirdi. Tarif edilen prosedüre göre tespit hücre hatları hücreler yaşlanma sırasında bu özellikleri kaybederse, bbb ve EC kavşak proteinlerin yüksek ekspresyonu ile bariyer özelliklerini korumak için düşük geçiş sayısını da kullanılabilir. Böylece bariyer özellikleri kaybından sonra, yeni bir hücre çizgisinin hazırlanması dikkate alınmalıdır. Hücre kaplama yoğunluğu bu hücre proliferasyonu için kritik olduğu gibi, EC için yüksek olmalıdır. Bu da ölümsüzleştirilmiş EC bakımı gibi izolasyon prosedürü sırasında dikkate alınmalıdır. Her yeni hücre hattı olan bariyer özellikleri ve diğer hücre türleri ile olası kirleticiler için test edilmelidir. AK monolayers oligodendrosit, astrositler ve perisitlere 4,27 ile kontaminasyon dışlamak için primer antikor olarak anti-galactocerebroside, anti-glial fibriler asidik protein ve anti-düz kas antijeni ile lekeli olabilir. Meningal damar tarafından kontaminasyona ekarte etmek için, trombomodülin ifadesi beynin 28 hariç tüm vasküler yataklarda ifade edildiği, test edilebilir. İlginçtir, beynin farklı bölgelerinde izole ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hatları pro-inflamatuar uyaranlara kendi bariyer özellikleri ve duyarlılıkları farklıdır. Bir örnek olarak, beyin cEND ve serebellar cerebEND hücre çizgileri 4,5 söz edilebilir. CerebEND karşılaştırıldığında gösterdi, başlıca bileşenler sıkı birleşim Claudin-1 ve occludin daha düşük seviyelerde ifade cEND için. Bununla birlikte, Claudin-3 ve -12 seviyeleri cerebEND daha yüksek bulunmuştur. CerebEND hücrelerin bariyer fonksiyonunun cEND hücrelerinin bariyer özellikleri 5 mi daha TNFa iltihaplı aracı ile tedavi altında, çok daha fazla acı. Inflamatuar uyaranlara Yükseköğretim serebellar açığı, multipl skleroz hastalarında ve ensefalomiyelit 29 otoimmün onun hayvan modelinde deneysel in vivo olarak görülebilir. Bu ilginç bulgu beyin içine hedefleme gelecek ilaç geliştirilmesi için, üretim ve beynin farklı bölgelerinde için in vitro model içinde bireysel karakterize gerektiğini göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Saflık&gt;% 98 </td></tr><tr><td> kollajen IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 mM asetik asit içerisinde 50 ug / ml </td></tr><tr><td> Kollajenaz / dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Fötal Buzağı Serumu (FCS) </td><td> PAA Laboratuvarlar </td><td> A15110-1333 </td><td> nihai konsantrasyon% 10 ısı ile inaktive edilmiş (30 dakika, 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Depolama: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamin </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Depolama: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-piruvat </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomisin (G418) </td><td> PAA Laboratuvarlar </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Sigara esansiyel amino asitler (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> 4 at Depolama ° C </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Depolama: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Fosfat salin (PBS) tamponlu </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine bromür) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> PBS içinde 0.8 mg / ml, -20 ° C&#39;de saklama </td></tr><tr><td> Puromisin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> % 0.05, PBS içinde% 0.02 EDTA </td></tr></tbody></table>

bir olarak ölümsüzleştirdi murin beyin mikrovasküler endotel hücre hattı Üretimi<em&gt; in vitro</em&gt; kan beyin bariyeri modeli

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epitel ve endotel hücreleri (EC) dış ve iç ortamdan dokusunun korunmasına paracellular bariyerler inşa ediyoruz. AK oluşan kan-beyin bariyeri (KBB), astrosit sonu ayaklar, perisitten ve bazal membran beyin parankimi korunması ve homeostazı sorumludur. Vitro BBB modellerinde BBB yapısı ve fonksiyonunu araştırmaya ortak araçlardır Hücresel düzeyde. Vitro BBB modelleri farklı önemli bir kısmı bugüne kadar farklı laboratuarlarda araştırma için kurulmuştur. Genellikle, hücrelerin, inek, domuz, sıçan veya fare beyin dokusu (Wilhelm ve diğerleri tarafından gözden ayrıntılı olarak tartışılmıştır. 1) &#39;den elde edilmiştir. İnsan doku örnekleri laboratuarlarda veya şirketler 2,3 kısıtlı sayıda kullanılabilir. Primer hücre hazırlıklar zaman alıcıdır ve AK kültürlerin partiden partiye farklılık da, kurulması AK lin ölümsüzleştirdies bilimsel ilgi odağıdır. Burada, yenidoğan fare beyin bir ölümsüzleştirdi beyin mikrovasküler AK hattı kurulması için bir yöntem mevcut. Biz reaktifler ve çözümler kullanılan prosedürü adım adım listesi açıklanmaktadır. Bizim laboratuvar tarafından kurulan yöntemi dört ila beş hafta içinde homojen ölümsüzleştirdi endotelyal hücre hattının izolasyonu sağlar. Beyin mikrovasküler endotel hücre hatları cEND 4 olarak adlandırılan (serebral korteks) ve 5 (serebellar korteks) cerebEND, Förster laboratuvarda bu prosedüre göre izole edildi ve etkili BBB farklı fizyolojik ve patolojik süreçlerin açıklanması için kullanılmıştır. CEND ve cerebEND kullanarak biz bu hücrelerin glukokortikoid 4,6-9 yanıt ve gibi TNF 5,8 gibi pro-infammatory mediatörlerin yanı östrojen tedavisi 10 olduğunu göstermiştir. Ayrıca, biz birden sc patoloji inceledikyi amaçladık 11 ve AT-düzeyde hipoksi 12,13. CEND ve cerebEND hatları lenfositler veya kanser hücreleri ile AK farklı uyaranlara veya etkileşim EC ve BBB, hücresel cevaplarının yapısı ve işlevi incelemek için iyi bir araç olarak kabul edilebilir.

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Epitel ve endotel hücreler (EC), dokuyu dış ve iç ortamdan koruyan parasellüler bariyerler oluştururlar. ...

Bu prosedürün genel amacı, homojenize edilmiş ölümsüzleştirilmiş beyin endotel hücresi kültürü elde etmektir. Bu işlem, öncelikle neonatal farelerden beyinlerin izole edilmesi ve tek hücre süspansiyonu elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin polyoma middle T antijeni ile ölümsüzleştirilmesidir.Ardından hücreler, homojen bir endotelyal tek tabaka oluşana kadar yaklaşık dört hafta boyunca büyütülür. Son adım, yeni hücre hattının immün boyama, Western blot ve Q-Q-P-C-R gibi teknikler kullanılarak karakterize edilmesidir. Bu tekniğin etkileri, preklinik tedavi değerlendirmeleri yapılabildiği ve patofizyoloji hakkında bilgiler elde edilebildiği için nöroinflamatuar veya iskemik beyin bozukluklarının tedavisine kadar uzanmaktadır.Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Elaine Salvador uygulamalı olarak gösterecektir. Buffer A içeren bir Petri kabına aktarılan üç ila beş günlük neonatal bir fareden beyin çıkarıldıktan sonra, laminer akışlı kabinde çalışırken her bir preparasyon için beş ila 10 fare beynine ihtiyaç duyulur. Her beyinden serebellumu, beyin sapını, meningesleri ve kapiler fragmanları temizleyin.Ardından serebrumları, tampon A içeren ikinci bir Petri kabına aktarın. Serebrumları küçük parçalara ayırmak için steril bir skalpel kullanın ve ardından topaklanma kalmayana kadar dokuyu ve tamponu aspire edip dışarı atmak için 10 milliliter pipet kullanın. Bu aşamada, beyin dokusunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 ×g hızında santrifüj ettikten sonra süspansiyonu 50 milliliter santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatantı atın ve peleti 4,5 milliliters tampon A ile 1,5 milliliters %0,75 w/v çözeltide çözün.Kollajenaz ekleyin. Dokuyu ve kollajenaz çözeltisini, ara ara çalkalayarak 37 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika inkübe edin. Bu sırada, 12 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğunu 0,1 mg/mL'lik steril bir çözelti ile kaplayarak doku kültürü plakalarını hazırlayın.Kollajen ve 50 millimolar asetik asit, kollajenin oda sıcaklığında bir saat boyunca kuyucuklara yapışmasını sağlar. 45 dakikalık inkübasyon süresi dolduğunda, 15 milliliters buffer A ekleyerek beyin dokusunun sindirimini durdurun ve peleti bu çözelti içinde tamamen süspande edin. Ardından 250 times G hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın.Hazırlıktan miyelin tabakasını uzaklaştırmak için dokuya 10 ml steril, ağırlık/hacimce %25 B, s, A ve PBS ekleyin ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 1000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve ardından peleti 15 ml tampon A içerisinde çözerek taze bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne aktarın; oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 ×g'de tekrar santrifüjleyin. Bu sırada, kollajen IV kaplı plakayı PBS ile iki kez yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, kuyucuklardan ikisini boş bırakın ve diğer iki kuyucuğa iki mililitre büyüme ortamı ekleyin. Süpernatantı attıktan sonra, ağırlıklı olarak endotel hücrelerden oluşan hücre peletini, mililitre başına dört mikrogram puramycin içeren dört mililitre büyüme ortamında yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunun ikişer mililitresini, kolajen kaplı iki boş kuyucuğun her birine ekleyerek, hızlıca yapışan endotel dışı hücreleri öldürmek için 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. Ardından, hücre içermeyen iki kuyucuktaki büyüme ortamını aspire ederek atın.Ardından, endotel hücre fraksiyonunu içeren, yapışmamış hücrelerin bulunduğu besiyerini bu iki kuyucuğa aktarın. Önceki kuyucukları iki mililitre taze besiyeri ile yeniden doldurun. Bu kuyucuklar fibroblastlar ve astrositler gibi diğer hücre tiplerini içerir; bunlar paralel olarak büyütülebilir ve morfoloji karşılaştırmaları için kullanılabilir.Hücreleri ertesi güne kadar doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Poliyoma orta T onkogenine sahip replikasyon yeteneği olmayan bir virüs salgılayan GPE neo fibroblastlarını, GPE neo med içeren jelatin kaplı flasklar içerisinde taze besiyeri ile değiştirerek kültüre edin. Poliyoma orta T onkogeni transfeksiyonu, endotelyal hücrelerin endotelyal olmayan hücrelere göre büyüme avantajı kazanmasını sağlayarak endotelyal morfolojiye sahip homojen bir hücre monokatmanı oluşmasına yol açar. Dört ila altı haftalık kültürden sonra, GPE neo hücreleri ticari olarak mevcut değildir ve paylaşılan kamu materyali olarak temin edilebilir.GPE Neo Fiberblast hücrelerini 24 saat boyunca büyüttükten sonra, medyadan 10 mililitre çıkarın ve son konsantrasyonu mililitre başına sekiz mikrogram olacak şekilde steril poly brain solüsyonu ekleyin. Hücresel fragmanları uzaklaştırmak için süpernatant karışımı 0,45 mikronluk bir filtreden geçirin. Ardından, endotel hücre kültürlerindeki medyayı aspire edin ve gece boyunca inkübe ettikten sonra kuyucuklara iki mililitre süpernatant poly brain karışımı ekleyin.Bu prosedürü ertesi gün, süpernatan poly beyin karışımının taze bir alikotu ile tekrarlayın. Süpernatan poly beyin karışımını uzaklaştırın. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve ardından taze büyüme medyumu ekleyin.Hücreler konflüent hale gelene kadar her üç günde bir büyüme ortamını değiştirmeye devam edin; ardından hücreleri kolajen ile kaplanmış plakalara bir veya iki kez pasajlayın. Stabil serebral endotelyal hücre hatları tipik olarak dört ila beş haftalık ardışık kültür sonrası elde edilir.Homojen bir endotel monokatman tüm kuyucuğu doldurduğunda. Stabil hücre hatları elde edildikten sonra, hücreleri kolajen IV kaplı doku kültürü flasklarına aktarın; hücreleri haftada birden fazla olmayacak şekilde, 3 ml tripsin EDTA ile ve hücre tabakası dağılana kadar 37 °C'de 5 ila 15 dakika inkübe ederek tripsinize edin. 5 ml besiyeri ekledikten sonra yeni flasklara ekim yapın, 1:4'ten daha yüksek bir ayırma oranından kaçının.Konfluent bir T 75 flask elde etmek için yeterli hücre sayısına ulaşıldığında, daha sonraki kullanımlar için hücre kriyotüpler hazırlanabilir. Bunun için hücreleri daha önce olduğu gibi tripsin ile toplayın, ardından hücre süspansiyonunu 250 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, hücre peletini altı mililitre dondurma ortamında yeniden süspande edin ve ardından hücre süspansiyonundan 1,5 mililitreyi dört adet kriyotüpe pipetleyin.Kriyoviyalleri izopropanol ile doldurulmuş bir Nalgene dondurma kabına yerleştirin ve bir gün boyunca -80 °C'de tutun. Son olarak, kriyoviyalleri sıvı azot altında saklayın. Hücrelerin bulunduğu kriyokuadı bir su banyosunda çözdürün ve ardından 10 mL büyüme ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.Besiyeri 37 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutulur ve tüp, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 ×g'de santrifüj edilir. Besiyeri aspire edildikten sonra, pelet uygun hacimdeki büyüme besiyerinde yeniden süspanse edilir. Hücre süspansiyonu, ön ısıtılmış büyüme besiyeri ile birlikte kolajen tip IV kaplı bir T 25 hücre kültür flaskına aktarılır.Ekim için hücre yoğunluğu mililitre başına en az 1x10⁴ hücre olmalıdır. Ertesi gün ortamı değiştirin ve hücreler yaklaşık beş gün sonra konfluense ulaştığında hücreleri daha önce olduğu gibi pasajlamaya devam edin; hazır olduklarında, sonraki deneyleriniz için istediğiniz yoğunlukta hücre ekimi yapın. C end hücreleri, endotelyal ve kan-beyin bariyeri belirteçlerinin immün boyaması ile karakterize edilmiştir.Bu görüntü, clain five için immün boyanan C and hücrelerinin morfolojisini göstermektedir. C and hücreleri, büyüme inhibisyonu sergileyen, sıkıca paketlenmiş uzamış hücrelerin tek tabakalarından oluşan beyin ECS primer kültürlerine benzer bir morfolojiye sahiptir. Net konflüans aşamasında, hücreler saptanabilir düzeylerde clain eksprese etmiştir.Burada C CN hücreleri, occludin antikoru ile immün boyanmıştır. İmmünofloresan boyama ile tekrar gösterildiği üzere, hücre-hücre bağlantılarında lokalize olan VE cadherin proteinlerinin ekspresyonu görülmektedir. Transendotelyal elektriksel direnç, akım geçiren ve voltaj ölçen elektrotlar içeren bir düzenek kullanılarak ölçülmüştür.Bu şekilden, C end hücrelerinin transendotelyal elektriksel direncinin, kültürdeki gelişiminden sonra zamanla arttığı görülebilir. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların bir fare modelinde serebrovasküler bozuklukları incelemesinin önünü açmıştır.

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan, kanı ve merkezi sinir sistemini (CNS) ayıran yüksek düzeyde düzenlenmiş bir bariyer oluşturan spesifik bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanır. Bu protokolde tartışıldığı gibi primer murin beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin izolasyonu, BBB'nin ayrıntılı in vitro çalışmalarını mümkün kılar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Burada, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim üzerine endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçlara odaklanarak, empedans hücre spektroskopisini kullanan kan-beyin bariyerinin in vitro bir murin modelini açıklıyoruz.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

İnsan kan-beyin bariyeri seçici hidrofilik moleküllerin ve patojenlerin beyne penetrasyon engeller. Menenjit ve postoperatif deliryum da dahil olmak üzere çeşitli patolojiler, kan-beyin bariyerinin artan geçirgenliği ile ilişkilidir. Burada, bariyer geçirgenliğini mikrobiyal geçiş le test etmek için bir endotel hücre kültür modelini tanımlıyoruz.

Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi

Kan-beyin bariyeri (BBB) sıkı beyin homeostazı düzenleyen bir çok hücreli nörovasküler birimdir. İnsan iPSC'leri ve çip üzerine organ teknolojilerini birleştirerek, hastalık modellemesi ve CNS ilaç penetrite tahminleri için uygun kişiselleştirilmiş bir BBB çipi ürettik. BBB çipinin üretimi ve işletimi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin ayırt edilmesiyle elde edilen beyin mikrovasküler endotel hücrelerini türetmek, genişletmek ve kriyoprezerserve etmek ve bir ex vivo modelde kan beyin bariyeri özelliklerini incelemek için uyarlanmış bir yöntemi detaylandırmaktadır.

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) neonatal fare beyin dokusundan izole edilmesi ve birincil kültürü için bir protokol sunulur; bu protokol kan-beyin bariyer fonksiyonunu fizyolojik ve patolojik koşullarda incelemek için sağlam bir in vitro model oluşturulur.

Fare Bin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin, fare beyninden mikrovasküler endotelyal hücre izolasyonu ve ölümsüzleştirme yöntemini. Bu protokol, kan-beyin bariyeri modelleri oluşturarak nöroinflamatuar hastalıkların tedavi değerlendirmelerine olanak tanır.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi

Daha fazla video keşfet