Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi In Vitro Kan Beyin Bariyeri Modeli

Bu prosedürün genel amacı, homojenize edilmiş ölümsüzleştirilmiş beyin endotel hücresi kültürü elde etmektir. Bu, öncelikle neonatal farelerden beyinlerin izole edilmesi ve tek hücreli süspansiyon elde edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hücrelerin polyoma middle T antijeni ile ölümsüzleştirilmesidir.

Ardından, homojen bir endotelyal monokatman oluşana kadar hücreler yaklaşık dört hafta boyunca büyütülür. Son adım, immün boyama, Western blot ve Q-Q-P-C-R gibi teknikler kullanılarak yeni hücre hattının karakterize edilmesidir. Bu tekniğin etkileri, preklinik tedavi değerlendirmeleri yapılabildiği ve patofizyolojiye dair içgörüler elde edilebildiği için nöroenflamatuar veya iskemik beyin hastalıklarının tedavisine kadar uzanmaktadır.

Prosedürü, laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Elaine Salvador uygulamalı olarak gösterecektir. Tampon A içeren bir Petri kabına aktarılan üç ila beş günlük neonatal bir farenin beyni çıkarıldıktan sonra, laminar akışlı kabinde çalışırken her bir hazırlık için beş ila 10 fare beyni gereklidir. Her beyinden serebellumu, beyin sapını, meningesleri ve kapiler fragmanları temizleyin.

Ardından serebrumları, tampon A içeren ikinci bir Petri kabına aktarın. Serebrumları küçük parçalara ayırmak için steril bir bistüri kullanın ve ardından, artık topak kalmayana kadar doku ve tamponu aspire etmek ve püskürtmek için 10 milliliterlik bir pipet kullanın. Bu aşamada, beyin dokusunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 ×g'de santrifüjledikten sonra süspansiyonu 50 milliliterlik bir santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatantı atın ve peleti, 1,5 milliliter %0,75 ağırlık/hacim ile birlikte 4,5 milliliter tampon A içinde çözün.

Kollagenaz işlemini gerçekleştirin. Dokuyu ve kollagenaz çözeltisini, ara sıra çalkalayarak 37 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika boyunca inkübe edin. Bu sırada, 12 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğunu 0,1 mg/mL'lik steril bir çözelti ile kaplayarak doku kültürü plakalarını hazırlayın.

Kollajen ve 50 millimolar asetik asit, kollajenin oda sıcaklığında bir saat boyunca kuyucuklara tutunmasını sağlar. 45 dakikalık inkübasyon süresi dolduğunda, 15 milliliters tampon A ekleyerek beyin dokusunun sindirimini durdurun ve peleti bu çözelti içinde iyice resüspande edin. Ardından 250 times G hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın.

Ardından, preparattan myelini uzaklaştırmak için dokuya 10 mililitre steril, ağırlık başına hacimce %25 B, s, A ve PBS ekleyin ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 1000 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, süpernatantı dikkatlice dökün ve ardından peleti 15 mililitre tampon A içinde çözüp taze bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın; oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 ×g'de tekrar santrifüjleyin. Bu sırada, kolajen IV kaplı plakayı PBS ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, kuyucuklardan ikisini boş bırakın ve diğer iki kuyucuğa iki mililitre büyüme besiyeri ekleyin. Süpernatantı attıktan sonra, esas olarak endotel hücrelerden oluşan hücre peletini, mililitre başına dört mikrogram puramisin içeren dört mililitre büyüme besiyeri ile yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunun ikişer mililitresini boş olan kolajen kaplı iki kuyucuğun her birine ekleyin; hızla yapışan endotel dışı hücreleri öldürmek için 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. Ardından, hücre içermeyen iki kuyucuktaki büyüme besiyerini aspire ederek atın.

Ardından, endotelyal hücre fraksiyonunu içeren ve yapışmamış hücrelerin bulunduğu medyumu bu iki kuyucuğa aktarın. Önceki kuyucukları iki mililitre taze medyum ile yeniden doldurun. Bu kuyucuklar fibroblastlar ve astrositler gibi diğer hücre tiplerini içerir; bunlar paralel olarak büyütülebilir ve morfoloji karşılaştırmaları için kullanılabilir.

Hücreleri ertesi güne kadar doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. Taze besiyeri ile değiştirerek, polyoma middle T onkogenine sahip replikasyon yeteneği kısıtlı bir virüs salgılayan GPE neo fibroblastlarını GPE neo besiyeri içeren jelatin kaplı flasklarda kültüre edin. Polyoma middle T onkogeni transfeksiyonu, endotel hücrelerin endotel olmayan hücrelere göre büyüme avantajı kazanmasını sağlayarak endotel morfolojisine sahip homojen bir hücre monotabakasına yol açar. Dört ila altı haftalık kültürden sonra, GPE neo hücreleri ticari olarak mevcut değildir ve paylaşılan kamu malzemesi olarak temin edilebilir.

GPE Neo Fiberblast hücreleri 24 saat boyunca büyütüldükten sonra, besiyerinden 10 mililitre çıkarın ve nihai konsantrasyonu sekiz mikrogram/mililitre olacak şekilde steril poly brain çözeltisi ekleyin. Hücresel fragmanları uzaklaştırmak için süpernatant karışımı 0,45 mikronluk bir filtreden geçirin. Şimdi endotel hücre kültürlerindeki besiyerini aspire edin ve gece boyunca inkübe ettikten sonra kuyucuklara iki mililitre süpernatant poly brain karışımı ekleyin.

Bu prosedürü ertesi gün, süpernatan poli beyin karışımının taze bir alikotu ile tekrarlayın. Süpernatan poli beyin karışımını uzaklaştırın. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve ardından taze büyüme medyumu ekleyin.

Hücreler konfluen hale gelene kadar her üç günde bir büyüme ortamını değiştirmeye devam edin, ardından hücreleri kollajen kaplı plakalara bir veya iki kez pasajlayın. Stabil serebral endotelyal hücre hatları tipik olarak dört ila beş haftalık ardışık kültürden sonra elde edilir.

Homojen bir endotelyal monokatman tüm kuyucuğu doldurduğunda. Stabil hücre hatları elde edildikten sonra, hücreleri kolajen IV kaplı doku kültürü flasklarına aktarın; hücreleri trypsin EDTA ile üç mililitre tripsin kullanarak ve hücre tabakası dağılana kadar 37 °C'de beş ila 15 dakika inkübe ederek haftada birden fazla olmayacak şekilde pasajlayın. Beş mililitre besiyeri ekledikten sonra yeni flasklara ekim yapın ve 1:4'ten daha yüksek pasaj oranlarından kaçının.

Konfluens bir T 75 flask elde etmek için yeterli hücre olduğunda, daha sonra kullanılmak üzere hücrelerin kriyoprezervasyon tüpleri hazırlanabilir. Bunun için, hücreleri daha önce olduğu gibi tripsin ile hasat edin, ardından hücre süspansiyonunu 250 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, hücre peletini altı mililitre dondurma ortamında resüspande edin, ardından hücre süspansiyonunun 1,5 mililitresini dört adet kriyotüpe pipetleyin.

Kriyoviyalleri, izopropanol ile doldurulmuş bir Nalgene dondurma kabına yerleştirin ve bir gün boyunca -80 °C'de bekletin. Son olarak, kriyoviyalleri sıvı azot altında saklayın. Hücrelerin bulunduğu kriyokadı bir su banyosunda çözdürün ve ardından 10 mL büyüme ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Besiyerini 37 °C'ye önceden ısıtın ve tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 ×g hızında santrifüjleyin. Besiyerini aspire ettikten sonra peleti uygun bir hacim büyüme besiyerinde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonunu, önceden ısıtılmış büyüme besiyeri ile birlikte kollajen IV kaplı bir T 25 hücre kültürü flaskına aktarın.

Plakaya ekim için hücre yoğunluğu mililitre başına en az 1 × 10⁴ hücre olmalıdır. Ertesi gün besiyerini değiştirin ve hücreler yaklaşık beş gün sonra konfluensa ulaştığında, daha önceki gibi pasajlamaya devam edin; hücreler hazır olduğunda sonraki deneyleriniz için istediğiniz yoğunlukta ekim yapın. C end hücreleri, endotelyal ve kan-beyin bariyeri markerlarının immün boyaması ile karakterize edilmiştir.

Bu görüntü, C ve hücrelerinin morfolojisini ve clain five için immün boyamasını göstermektedir. C ve hücreleri, büyüme inhibisyonu sergileyen, sıkıca paketlenmiş uzamış hücrelerden oluşan tek tabakalara sahip beyin ECS primer kültürlerine benzer bir morfolojiye sahiptir. Net konfluensle, hücreler tespit edilebilir düzeylerde clain eksprese etmiştir.

Burada C CN hücreleri, occludin'e karşı bir antikor ile immün boyanmıştır. İmmünofloresan boyama ile tekrar gösterildiği üzere, burada hücre hücre bağlantılarında yerelleşen VE cadherin proteinlerinin ekspresyonunu görüyoruz. Transendotelyal elektriksel direnç, akım geçiren ve voltaj ölçen elektrotlar içeren bir düzenek kullanılarak ölçülmüştür.

Bu şekilde, C end hücrelerinin trans endotelyal elektriksel direncinin, kültürdeki gelişiminden sonra zamanla arttığı görülmektedir. Bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların fare modelinde serebrovasküler bozuklukları incelemelerine olanak sağlamıştır.