Name: Düşük yoğunluklu Ultrason Kullanımı Yapışma bağımlı Sinyalleri indüksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin, düşük yoğunluklu ultrasonun fibroblastlarda fokal adezyon oluşumu ve Rac1 aktivasyonunu nasıl tetiklediğini. Bu yöntem, kronik yara iyileşmesi için terapötik stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Smith &amp; Nephew Birleşik Krallık Ltd MDB ve sponsorluk için Wellcome Trust hibe 088.419 tarafından desteklenmiştir

1. Matrix Ligand kaplama yüzeyler <ol><li> Ultrason bireysel olarak tabaklar veya 6-kuyucuklu plak olarak da, 3,5-cm kuyulara hücreleri için geçerli olacaktır. Doğrudan plastik üzerine biyokimyasal testlerde, ceket ligand. Immünfloresan için kaynatın cam MilliQ su ve her bir kuyunun dibine yerde 4 lamelleri üç kez lamelleri. </li><li> Cam yüzeyleri etkin ligand kaplama sağlamak için türevlendirilmiş olmalıdır. 1 mM PBS içinde sülfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester eritilir. Her oyuğa 2 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> PBS ile 3 defa türevlendirilmiş yüzeyleri yıkanır. </li><li> Coat ya türevlendirilmiş cam veya integrin bağ ile işlenmemiş plastik. Her oyuğa + ve Mg + 2 Ca 2 içeren PBS içinde çözülmüş 10 ug / ml integrin ligand9 2 ml, uygulanır ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe </li><li> ° C&#39;de 13 dakika süreyle 85 PBS içinde çözülmüş% 1 BSA, ısıtarak BSA monoparticulate hazırlayın. Izin vermeksoğutmak ve daha sonra 0.45 mikron filtre geçmesine. </li><li> 30 dakika boyunca monoparticulate BSA ile ligand-kaplı yüzeylerde ve blok PBS ile 3 kez yıka. </li></ol> 2. Hücreler hazırlanması <ol><li> Deney boyunca matris ortamı kontrol etmek için, protein sentezi 25 ug / ml sikloheksimid ila% 80 2 saat boyunca konfluent fibroblastlann ilavesi ile bloke edilmesi gerekir. </li><li> PBS ile sikloheksimid tedavi edilen hücreler durulayın ve 0.5 mg / ml tripsin / EDTA kullanılarak kültür şişelerinde terketmez. </li><li> 5 dakika boyunca 500 kat g&#39;de santrifüj ile hasat müstakil hücreleri. </li><li> DMEM/25 mM HEPES içinde Pastör pipetiyle hücreler, 25 ug / ml sikloheksimid. </li><li> Bir haemocytometer kullanarak süspansiyon hücre yoğunluğu sayın ve 105 ml-1 ye tamamlanır. </li><li> Yüzey integrin kurtarmak için 20 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> PBS ile ligand kaplı, BSA ile bloke kuyuları 3 kere yıkayın. </li><li> Her oyuğuna hücre süspansiyonu tohumu 2 ml. </li><li> Allo37 de 2 saat boyunca yaymak için w hücreleri ° C&#39;de,% 5 CO2. </li></ol> 3. Ultrason Stimülasyon <ol><li> 37 ° C&#39;ye ultrason verici dizi ve kaplin jel Isınma </li><li> Her emitör için jel kaplin bir bezelye büyüklüğünde damla uygulayın. </li><li> Her verici bir ultrason göstergesi diyot detektör kullanarak işlevsel olduğunu test edin. </li><li> Emetör dizi kuyular yerleştirin. 37 üzere bir dizi dönmek ° C&#39;de, 10 dakika boyunca dengelemek için% 5 CO2 ve izin sıcaklığına. </li><li> Ultrason sinyal açın. </li><li> Ultrason sinyal terapötik rejiminin taklit eden, 20 dakika sonra devre dışı kalır. Kısa stimülasyon kez gerekiyorsa, tabak zaman noktaları, uygun bir dizi çıkarılmalıdır. Tüm durumlarda kullanmak negatif kontrol olarak plakalar unstimulated. </li></ol> 4. İmmünofloresan tarafından Odak Yapışma Analizi <ol><li> Fokal adezyon analizi için, 20 dakikalık ultrason sinyali uygulamakve daha sonra yapı ° C&#39;de,% 5 CO2 37 hücreleri tarafından muhafaza daha ileri bir 40 dakika daha geliştirmek için olanak sağlar. </li><li> Medya aspire ve PBS ile 2 ml% 4 paraformaldehit uygulayarak hücreleri düzeltin. Oda sıcaklığında 14 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Paraformaldehit aspire ve kesme kuvvetlerinin oluşumunu engellemek Kuyunun kenarına yavaşça aşağı PBS uygulayarak, üç kere PBS ile yıkayın. </li><li> 3.5 cm de sonraki immünofloresan boyama için 24-iyi levhaya her coverslip aktarın. </li><li> 24 kuyu herbirine 0.5 ml PBS içerisinde 0.1 M glisin uygulanarak kalıntı paraformaldehit Quench. Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Aspirat glisin ve PBS ile üç kere durulanır. </li><li> 0.5 ml% 0.5 Triton X-PBS içinde 100 (w / v) uygulamak suretiyle hücrelerin Permeabilise. Oda sıcaklığında 4 saat boyunca inkübe. </li><li> Aspirat Triton X-100 ve PBS ile üç kere durulanır. </li><li> 0.5 ml% 3 (w / v) PBS içinde BSA uygulanarak bloke eder. 4 &amp; d gece inkübeörneğin; C. </li><li> Leke vinculin-BSA ihtiva eden blok içinde 1:400 seyreltilmiş hVIN-1 antikoru ile fokal yapışması. Oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilir. </li><li> PBS ile üç kere durulanır. </li><li> Fluorofor (DyLight 488)-konjuge sekonder antikor (1:200 seyreltilmiş) ve BSA blok TRITC-konjuge Phalloidin (1:200 seyreltilmiş) ile leke aktin uygulayın. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> PBS ve bir kez su ile üç kere durulanır. </li><li> Altın mountant Prolong kullanarak ters konumda bir cam slayt üzerine monte edin. </li></ol> 5.. Pull-down Tahlil tarafından Rac1 Aktivasyon Kantitasyonu <ol><li> Rac1 aktivasyon analizi için, 37 hücreleri için 20 dakikalık bir ultrason sinyali uygulamak ° C&#39;de,% 5 CO2. 20 dakikadan daha uzun bir tepki süresi değerlendirilirken, 20 dakika için ultrason sinyal uygulanır ve 37 ° C&#39;de muhafaza hücreleri,% 5 yanıtı geliştirmek için izin vermek üzere geri kalan süre CO 2. </li><li> Aspirat medya ve yerini iyibuz üzerinde s. 2 ml soğuk PBS ve aspirat ile kuyu durulayın. Sağlanması herhangi bir rezidüel PBS ayrıntılı aspirasyon ardından 1 dakika boyunca hareket ettirildiğinde kuyu bırakarak ile uzaklaştırılır. </li><li> Oyuk başına 35 ul lizis tamponu (% 10 gliserol, 20 mM Hepes pH 7.4, 140 mM NaCl,% 1 NP40,% 0.5 sodyum deoksikolat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × tam proteaz inhibitörü) ile buz üzerinde hücreleri Lyse. Bu örnekte, 6 kuyu hücre lizatı 210 ul üretmek için bir zaman noktası başına kullanılır. Daha fazla veya daha az kuyu kullanılabilir ancak toplam lizat hacmi toplam gerektiğini ~ 200 ul. </li><li> Hücre kazıyıcı ile iyice Pençe hücrelerin tam hücre parçalama sağlamak ve kuyular terk havuzuna lizat izin vermek için 1 dakika yatırılabilir. </li><li> Pelet hücresel enkaz 4 ° C&#39;de 2 dakika 21000 bir buz 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp (aynı tedavi rejimi havuzu lizatları) ve spin × g Lizat aktarın. </li><li> Lizis tampon 130 ul ile 25 ul PAK-glut içeren 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüpler buz soğuk lizatın 180 ul transferathione agaroz boncuk 10. Sonraki jel ayrılması için -20 ° C&#39;de kalan ham lizat tutun. </li><li> 4 azından 40 dakika süreyle tüpler döndürerek PAK-glutation agaroz boncukları aktif Rac1 yakalamak ° C. </li><li> Hasat agaroz boncuk 2000 santrifüj ile konjugatlarda × g 1 dakika boyunca 4 ° C&#39;de </li><li> Yıkama boncuk, her yıkamadan sonra 2000x g atarak süpernatan santrifüj ile boncuk hasat, 500 ul lizis tamponu ile üç kez konjugatlarda. Dikkatli bir şekilde 200 ul pipet yardımıyla kalan lizis yıkama tamponu çıkarın. </li><li> 5 dakika için bir titreme ısı blok üzerinde 85 ile 35 ul SDS-PAGE yükleme tamponu ve inkübe ° C ekleyerek her bir örnek Zehir. 1 dakika için 21000 × g de santrifüj boncuk çıkarın. </li><li> SDS-PAGE ile boncuk eluat çözümleme, Rac1 için nitroselüloz ve prob transfer. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokolü biz vinculin-leke indüksiyon tarifed odak yapışıklıklar ve ultrason ile Rac1 aktivite. Fokal adezyon deney için, başlangıç ​​pozisyonu α 5 β 1-integrin bir ligand yayılmış fibroblastlar ikinci bir fibronektin reseptörü, syndecan-4, sürece vinculin içeren yapışıklıklar (Şekil 3A) oluşturmak kalmamasıdır ilavesi ile uğraşan Çözünür ligandı (Şekil 3B) 3,4. Bununla birlikte, ultrason ile stimülasyon olduğunu ultrason stimülasyon fibronektin bağımlı sinyal yolağı 5 belirli bileşenleri yerini alabilir gösteren syndecan-4 (Şekil 3C) katılımını aynı ölçüde fokal adezyon oluşumunu indükler. Bu protokol ile önemli bir engeli uyarıcı olmaksızın fokal adezyon oluşumunu yok ediyor. Sikloheksimid protein sentezinin inhibisyonu Eksik otomatik uyarmak için hücreleri için yeterlidir matriks birikimi sağlayacaktır. Hücrelerinin aşırı kalabalık da düşük seviyeli fokal yapışma oluşumunu bir yol açabilirn ve hücre-hücre ve hücre-matriks kişiler arasında çapraz olarak ultrason yanıtı zayıf, tek bir uyarıcı izole etmek için tasarlanmış bir deney zorlaştıracaktır. Temel analiz bir gelişme olarak biz syndecan-4 (Şekil 4) eksik fibroblastlar ile tekrar aynı deneyi, göstermektedir. Bu fibroblastlar hala ultrason (Şekil 4C) yanıt, ama syndecan-4 ligand (Şekil 4B) yanıt vermek için başarısız. - / - Sdc4 kullanarak deney fibroblastlar bu ultrason aslında belirli fibronektin reseptörleri için ihtiyaç atlayabilir gösterir ve basit bir protokol sinyal yolu hakkındaki ek bilgileri elde etmek için nasıl geliştirilebilir göstermektedir. Biyokimyasal deney için biz ultrason Del Pozo ve ark. 10 tarafından anlatılan yöntemin bir adaptasyon olan bir açılan testi kullanılarak, Rac1 aktivasyonuna neden olabilir göstermektedir. Aktif Rac1 0, 10, 30 ve ini sonra 60 dakika Yağışultrason stimülasyon tiation temel (Şekil 5) dönmeden önce, 10-30 dakika Rac1 aktivite pik ortaya koymaktadır. Vinculin için ham lizatları Blotting zaman noktaları arasındaki eşdeğer yükleme sağlar. Sonuç syndecan-4 3 nişan tarafından Rac1 aktivasyonu benzer, ancak fibronektin tarafından aktivasyon biraz daha uzun süreli olduğunu. Bu nedenle 8-10 tekrarlar genellikle önemli veri elde edilmesi için gereklidir. Rac1 aktivasyonu fokal adezyon oluşumuna hücrelerin bağlılık sorumludur ve doğmakta olan fokal adezyon Rac1 aktivasyonu ile örtüşen, 10-30 dakika oluşturmaya başlar. Bir kez başlatılan, bu adezyon Şekil 3 ve 4&#39;te gösterildiği gibi, büyük yapışma plaklar içine olgun devam edecektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Şekil 1. Ultrason dalga formu. Ultrason aralıklı 1,5 MHz sinyali oluşur düşük genlikli (30 mW / cm &lt;nedeniyle&gt; 2 sup, mekansal ortalama, zamansal ortalama) hiçbir ısıtma etkisi vardır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Şekil 2. Hazırlanması ve ultrason ile hücrelerin uyarılması için iş akışı şematik gösterimi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Şekil 3. Fibroblastlarda fokal adezyon Ultrason indüksiyon. Fibroblastların syndecan-4-bağlayıcı fibronektin fragmanı (B) veya ultrason (C) stimülasyon önce fibronektin integrin bağlayıcı parçası (A) üzerine yayıldı. 60 dakikalık uyarının ardından, hücreler tespit edildi vinculin ve aktin için boyanıp Epifloresans tarafından görüntülendi. Bar = 10 mikron. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Şekil 4. Syndecan-4 yoksun fibroblastlar fokal adezyon Ultrason indüksiyon. <em&gt; Sdc4 - / - fibroblastlar syndecan-4-bağlayıcı fibronektin fragmanı (B) veya ultrason (C) stimülasyon önce fibronektin integrin bağlayıcı parçası (A) üzerine yayıldı. 60 dakikalık uyarının ardından, hücreler tespit edildi vinculin ve aktin için boyanıp Epifloresans tarafından görüntülendi. - / - Sdc4 rağmen fibroblastların fibronektin-duyarsız olduğunu, ultrason hala ultrason matris reseptör nişan atlar gösteren, fokal adezyon bağlı. Bar = 10 mikron. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Şekil 5. Ultrason ile Rac1 aktivasyonu. Hücreler zaman noktası başına kullanılan 6 kuyuları olan 0, 10, 30 ve 60 dakika süreyle uyarıldı. Bir Rac1 açılan testi zaman dersten örneklerinde GTP-Rac1 mevcut miktarı bir western blot (üstteki resim) anti-Rac1 antikor ile inkübasyon tarafından görüntülendi. Bant yoğunluğu (8-10 ortalama nüsha) Kantitasyonu Rac1 bir artış ortaya koymaktadırctivity 60 dakika (grafik) de taban seviyelere dönmeden önce, 10 ve 30 dakika ultrason sinyal kaynaklanan. Hata çubukları sem temsil

<ol><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li>
<li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li>
<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li>
<li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li>
<li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li>
<li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li>
<li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive%2C+low-intensity+pulsed+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li>
<li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific%2C+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter%2C+prospective%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li>
<li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li>
<li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII%2FIIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li>
</ol>

Andrew Harrison Smith &amp; Nephew Birleşik Krallık Sınırlı bir çalışanıdır.

Bu protokolde, normalde insan hastalara uygulanan bir tedaviye hücresi bazlı Deneylerde kullanılan edilmesini sağlayacak yöntemi açıklanmaktadır. Nihai hedefi tedavisi rafine böylece ultrason eylem moleküler mekanizması anlamaktır. Bu protokol, biz bir model hücre sistemi olarak fare embriyonik fibroblast (MEFS) kullanır, ancak ultrason da birincil insan sünnet derisi fibroblastlarında 5, mezenkimal kök hücre, osteoblast ve kondrosit 6 etkili olduğu tespit edilmiştir edilmiştir. Bir örnek olarak test biyokimyasal Rac1 aktivasyon kullanan, ancak aynı derecede protein yöntemi fosforilasyon ya immünopresipitasyon protein kompleksleri oluşumu düzenlemesi test etmek için kullanılabilir. Immünofloresan Örneğin biz fokal adezyon oluşumu üzerine etkisi ultrason gösteren, ancak herhangi bir molekül dağılımının yeniden incelenebilir. Örneğin, bir prote arasında colocalisation, plazma zarına sitosolik faktörlerin alım test edebilirkaçakçılığı veziküllerde bileşenlerini veya mitotik iğ organizasyon ultrason etkilerini incelemek. Şimdiye kadar kendimizi kollajen üzerine, ya da büyüme faktörleri varlığında ultrason karmaşık bir ortamda hücre davranışlarını nasıl etkilediği konusunda bir resim oluşturmak için test edilebilir hücreleri üzerinde ultrason etkisi ile, fibronektin-bağımlı yolların test sınırlı olduğunu daha yakından bir in vivo durum benzer. Daha büyük bir zorluk verici varlığı ultrason Mevcut ek teknik engeller ışık yolu ve titreşim engelleme time-lapse görüntüleme, ultrason kullanarak etkisini test etmek olacaktır. Ancak, tedavi uygulaması günlük stimülasyon sadece 20 dakika gerektirdiği gerçeğine stimülasyon bir patlama sonrası hücre davranışı o analizi de verimli olabileceğini düşündürmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> sülfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> Su içinde çözülmüş 25 mM stokları -20 ° C&#39;de saklanabilir </td></tr><tr><td> 6-de doku kültürü plakası </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Diğer şirketlerden Plastik zayıf kat edebilirsiniz </td></tr><tr><td> 13-mm cam coverslip </td><td> Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> Diğer şirketlerden Cam zayıf kat edebilirsiniz </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Mg, Ca 2 + 2 + </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K integrin ligandı (fibronektin fragmanı) </td><td> Açıklaması ve ön Construct9, 11 &#39;de elde edilmesine </td><td></td><td> Alternatif matris ligandlar diğer yolları sorgulamak için kullanılabilir </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Suda 10mg/ml stok olarak saklanabilir </td></tr><tr><td> DMEM/25 mM HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Eksojen 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultrason kaplin jel </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS göstergesi </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-konjuge anti-fare </td><td> Stratech Scientific </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-etiketli Phalloidin &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Altın antifade reaktif Prolong </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> tam proteaz inhibitörü (EDTA ücretsiz) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> Tabletten oluşan 100 × stok -20 ° C&#39;de saklandı </td></tr><tr><td> PAK-glutatyon agaroz boncuk </td><td> 10 açıklama ve hazırlık Construct </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Balıkçı </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo Bilimsel </td><td> BI8181 </td><td> 7.4 1M stok ve pH olun </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Balıkçı </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum deoksikolat </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

düşük yoğunluklu ultrason kullanımı yapışma bağımlı sinyalleri indüksiyonu

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Çok hücreli organizmalarda, hücrenin davranış hücre dışı matriks ile etkileşimi tarafından dikte edilir. Hücre migrasyonu ve proliferasyonu düzenlenmesinden, sekresyon ve hatta farklılaşma matriks-nişan aralığı Sonuçları. Bu, karmaşık işlemlerin her yatan sinyalleri hücrenin yüzeyi üzerinde hücre dışı matris reseptörlerinin moleküler etkileşimin ortaya çıkar. İntegrinler prototipik reseptörleri ve mekanik bir hücre dışı matris ve hücre iskeleti arasındaki bağlantı, hem de yapışma bağımlı bir sinyalleşme cascades bazı başlatıcı sağlamaktır. Ancak, ek transmembran reseptörleri aşağı integrin kendisi ve sinyallerini düzenleyen integrinler yanında çalışmasını giderek daha belirgin hale gelmektedir. Bu örneklerden en zarif fibronektine adezyonu sırasında α 5 β 1-integrin ile işbirliği transmembran proteoglikan, syndecan-4 vardır. In vivo modellerde demonstrsyndecan-4-yoksun farelerde verimsiz fibroblast göçü 1,2 nedeniyle şifa geriliği sergilemek gibi, syndecan-4 sinyal önemini yedik. Vahşi tip hayvanlar, bir yara doğru fibroblastların göçü hasarlı kılcal damarlardan sızıntı ve yaralı dokularda makrofajlar tarafından yatırıldığına dair fibronektin görünümünü tarafından tetiklenir. Bu nedenle fibronektin bağımlı sinyal geliştirmek ve onarım işlemleri hızlandırabilir stratejileri keşfetmek büyük ilgi var. Fibronektin bağlı sinyal integrin-aracılı ve syndecan-4-aracılı bileşenleri rekombinant fibronektin parçaları ile birlikte uyaran hücreleri tarafından ayrılabilir. Integrin angajman hücre yapışması için gerekli olmasına rağmen, belirli fibronektin-bağımlı sinyallerden syndecan-4 düzenlenir. Syndecan-4 etkinleştirir Rac1 çıkıntılı sinyali 3, fokal integrin dağıtılması 1 gibi vinculin gibi hücre iskeleti moleküllerinin tetikler işe alım, nedenadezyon 4, ve böylece yönsel göçü 3 indüklemektedir. Biz bu sinyalleri aktive etmek için alternatif stratejiler için baktım ve düşük yoğunlukta kesikli ultrason (LIPUS) syndecan-4 nişan 5 etkilerini taklit bulduk. Bu protokolü biz 1 kHz (Şekil 1) darbeli 30 mW / cm 2, 1.5 MHz ultrason, Rac1 aktivasyonu ve fokal adezyon oluşumunu uyarmak için kültür fibroblastlar (Şekil 2) uygulanabilir hangi yöntemi açıklar. Bu parametrelerin kombinasyonu klinik kemik onarımı 6 hızlandırılması için en etkili olduğu tespit edilmiştir olarak ultrason uyarılması, 20 dakikalık bir süre için uygulanır. Yöntemi syndecan-4 angajman olmadan α 5 β 1-integrin, meşgul rekombinant fibronektin parçaları kullanır ve fibroblastlar tarafından ek matriks birikimi engellemek için sikloheksimid protein sentezini inhibe gerektirir., Olumlu etkisi otamir mekanizmaları f ultrason de 7,8 belgelendi, kültür ve ultrason moleküler etkisi anlayarak biz klinik sonuçları iyileştirmek için tedavi tekniği geliştirmek gerekir.

Bu protokol, fokal adezyon oluşumu ve transmembran reseptör matrisi, syndecan-4 nişan taklit ederek Rac1 aktivasyon sürücüler düşük yoğunlukta kesikli ultrason ile kültüre fibroblast stimülasyonu açıklar. Bu yaklaşım, böylece tedavinin arıtma için fırsatlar sağlayarak, hücresel düzeyde başarılı bir klinik tekniğin soruşturma sağlar.

Düşük yoğunluklu Ultrason Kullanımı Yapışma bağımlı Sinyalleri indüksiyonu

Çok hücreli organizmalarda hücre davranışı, hücre dışı matrisle olan etkileşimlerle belirlenir. Matris etkileşiminin sonuçları ... ile ... arasında değişmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, düşük yoğunluklu darbeli ultrasonun veya liposonun hücre migrasyonunu etkilediği ve böylece doku onarımını hızlandırdığı moleküler mekanizmaları anlamaktır. Bu, öncelikle hücrelerin, de novo protein ekspresyonunu ve dolayısıyla hücrelerin oto-stimülasyonunu önlemek için iki saat boyunca sikloheksimid ile işlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, ayrıştırılmış hücrelerin, dikkatle tanımlanmış bir matriks ligandı ile kaplanmış yüzeylere iki saat boyunca yayılmasıdır.Üçüncü adım, hücre kültür plakalarını ultrason yayıcılarına jel ile bağlayarak hücreleri ultrasonla stimüle etmektir. Sonuçlar, hücrelerin cullin ve aktin için boyanması yoluyla ultrason stimülasyonuna bağlı fokal adezyon oluşumundaki değişiklikleri ve aktif RAC1 pull-down deneyi ve ardından gelen western blotting aracılığıyla RAC1 aktivasyonundaki zamansal değişiklikleri gösterebilir. Bu yöntem, hücrelerin fiziksel manipülasyonu büyüme faktörleri veya fibronektin gibi kimyasal stimülilerin yerini tutabilir mi gibi adezyon sinyalizasyonu alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir.Peki, bu fiziksel manipülasyon hücre göçünü nasıl başlatır? Bu tekniğin doğurguları, ultrasonun hücre davranışını nasıl etkilediğini anlayarak, yaşlılar veya diyabetik hastalar gibi yara iyileşmesi kusurları olan bireylerde yara kapanmasını hızlandırmak için tedavileri geliştirebileceğimizden dolayı kronik yaraların tedavisine kadar uzanmaktadır. Biyokimyasal analizler için, plastik 3.5 santimetre plakaların kuyucuklarını doğrudan integrin ligandı ile kaplayın.İmmünofloresans için cam lamelleri milli Q su ile üç kez kaynatın. Ardından her bir 3,5 santimetrelik plakaya dört adet lamel yerleştirin; ligand kaplamasının verimli olmasını sağlamak için her bir kuyucuğa 2 mL 1 mM sulfa MBS ekleyerek cam lamelleri derivatize edin. Reaksiyonun oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ilerlemesine izin verin, ardından derivatize edilmiş yüzeyleri PBS ile üç kez yıkayın. Son olarak, derivatize edilmiş camı 2 mL integrin ligandı ile kaplayın.Ligandı her bir kuyucuğa ekleyin ve plakları dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin; ertesi gün, PBS içinde çözünmüş %1 BSA'yı 13 dakika boyunca 85 derece Celsius'ya ısıtarak mono partiküler BSA hazırlayın. Soğumaya bırakın ve ardından 0,45 mikronluk bir filtreden geçirin. İlk olarak, ligand kaplı yüzeyleri üç kez PBS ile yıkayın ve ikinci olarak yüzeyleri hazırlanan mono partiküler BSA ile 30 dakika boyunca bloke edin.Deney boyunca matriks ortamını kontrol etmek için, %80 konfluensli fibroblastlara iki saat boyunca mililitre başına 25 mikrogram sikloheksimid eklenerek protein sentezi bloke edilmelidir. Sikloheksimid ile işlem görmüş hücreleri PBS ile yıkayın, hücreleri sayın ve hücreleri peletleyin. Hücreleri, bir hemositometre yardımıyla mililitre başına 10.000 hücre nihai konsantrasyonunda A-D-M-E-M solüsyonu içinde yeniden süspanse edin.Şimdi, yeniden süspande edilen hücreleri 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, her bir kuyuya iki mililitre hücre süspansiyonu ekmeden önce plakaları PBS ile üç kez durulayın. Hücrelerin 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında iki saat boyunca yayılmasına izin verin; ultrason yayıcı diziyi ve kuplaj jelini ısıtarak başlayın.Isıtma işlemi tamamlandıktan sonra, her bir yayıcıya bezelye tanesi büyüklüğünde kuplaj jeli uygulayarak her bir yayıcının işlevsel olup olmadığını test edin. Bir ultrason indikatör diyot dedektörü kullanarak, jelin yayıcıyı dedektöre bağlamasını sağlayın. Yayıcı işlevselse, DDE ışık verecektir.Cihaz sabit ayarlara sahiptir ve 1 kHz frekansında darbeli 1,5 megahertz ultrasonu, santimetrekare başına 30 milliwatt yoğunlukla iletecektir. Cihaz 20 dakika sonra otomatik olarak devre dışı kalacaktır. Kuyucukları yayıcı dizinin üzerine yerleştirin, diziyi inkübatöre geri koyun, sıcaklığın dengelenmesi için 10 dakika bekleyin ve güç kaynağından ultrason sinyalini açın.Ultrason sinyali 20 dakika sonra devre dışı kalacaktır. Daha kısa stimülasyon süreleri gerekiyorsa terapötik rejime uygun şekilde uygulama yapınız. Plakalar uygun zamanda diziden çıkarılabilir.Daha uzun stimülasyon süreleri için plakalar dizide bırakılmalı ve gelişmeye bırakılmalıdır. Yayıcı yeniden başlatılabilir, ancak bunu yaptığımızda ek bir fayda görmedik. Tüm durumlarda, stimüle edilmemiş plakalar negatif kontrol olarak kullanılmalıdır.Fokal adezyon oluşumunun analizi için, S kaplı lamellere 20 dakika boyunca ultrason sinyali uygulayın ve ardından bunları 37 °C'de 40 dakika daha inkübe edin. Bu işlem, fokal adezyonların gelişmesini sağlar. Ardından, besiyerini aspire ederek uzaklaştırın.İki mililitre fiksatör uygulayın ve 14 dakika bekleyin. Fiksatörü aspirasyon yoluyla uzaklaştırın ve hücreleri PBS ile dikkatlice üç kez yıkayın. PBS'yi kuyucuğun kenarı boyunca uygulayın ve solüsyonu nazikçe yayarak hücrelerin şişmesini sağlayın.Temizce durulandıktan sonra, her bir lamel 3,5 santimetrelik kuyucuktan, sonraki immünofloresan boyama işlemi için 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın. İstenen stimülasyon süresinin ardından, medyum vakumla çekilerek uzaklaştırın ve hücreleri buz üzerinde PBS ile durulayın; tercih ettiğiniz biyokimyasal analiz için uygun lizis tamponunda hücreleri lizleyin. Biz genellikle aktivasyonu efektör pull-down analizi ile analiz ediyoruz.Özellikle bu yöntem, herhangi bir sinyal yolağının biyokimyasal analizi için kullanılabilir. Bu protokolde, fokal adezyon deneyleri için ultrason ile vinky'nin indüksiyonunu, boyanmış fokal adezyonları ve RAC 1 aktivitesini tanımlıyoruz. Temel konum, alfa beş beta bir integrin ligandı üzerinde yayılan fibroblastların, çözünür ligand eklenmesiyle ikinci bir fibroin bağlayıcı reseptör syndicate dört devreye girene kadar finkel ve içeren adezyonlar oluşturmamasıdır.Buna karşın, ultrasonla stimülasyon, syncom four etkileşimiyle aynı düzeyde fokal adezyon oluşumunu indüklemektedir; bu durum, ultrason stimülasyonunun fibrin boyun bağımsızlığı sinyal yolunun belirli bileşenlerinin yerini alabileceğini göstermektedir. Temel assay'in bir gelişimi olarak, aynı deneyin INDICUM four eksikliği olan fibroblastlarla tekrarlanmış halini sunuyoruz. Bu fibroblastlar ultrasona hala yanıt vermekte ancak INDICUM four ligandına yanıt verememektedir.Bu durum, ultrasonun gerçekten belirli fiber ve andum reseptörlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırabildiğini göstermektedir. Biyokimyasal deney için, bir pull-down deneyi kullanarak ultrasonun RAC1 aktivasyonunu tetikleyebildiğini gösteriyoruz; ultrason stimülasyonunun başlangıcından 0, 10, 30 ve 60 dakika sonra aktif RAC1'in çöktürülmesi, RAC1 aktivitesinin baseline düzeyine dönmeden önce 10 ila 30 dakikada zirveye ulaştığını ortaya koymaktadır. Cullin için kullanılan kaba lizatlar, zaman noktaları arasında eşdeğer yükleme yapılmasını sağlar.Sonuç, sendika dördün etkileşimi ile RAC bir aktivasyonuna benzemektedir, ancak fibronektin ile aktivasyondan biraz daha uzun sürelidir. Bu nedenle, anlamlı veriler elde etmek için genellikle sekiz ila 10 tekrar gereklidir. Bu prosedürü uygularken, protein sentezini sikloheksimid ile tamamen bloke ederek ek uyaranları ortadan kaldırmak, deney sırasında kültür ortamının kontamine olmasını önlemek ve hücrelerin aşırı yoğunlaşarak hücre-hücre temaslarına yol açmasını engellemek önemlidir.Çizik yaralanma analizleri gibi diğer yöntemler, ultrasonun hücre göçünü nasıl başlattığı gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Mikro kabarcık Insonation azaltılmış zaman-ortalamalı akustik güçler tümör ablasyonu için umut vaat eden bir strateji yanı sıra, hedeflenen terapötik teslimat için. Bu çalışmanın amacı non-termal mikrovasküler ablasyon subkutan C6 gliomlar ve yükü teslim maksimize etmek için düşük görev döngüsü ultrason darbeli stratejileri ve nanocarriers geliştirmek.

Kontrast Ultrason Gliomlar, Tedavi Hedeflenen İlaç-Rulman Nanopartikül Teslimat ve Mikrovasküler Ablasyon ile Fare

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

İnsan lösemi hücrelerinin seçici hasarı, lösemik ve normal hematopoetik hücrelerin hem kemoterapötik ön tedavisi ile hem de kemoterapötik ön tedavi olmadan düşük frekanslı ultrason uygulanmasının yeni bir yaklaşımıyla sağlanabilir.

Üretim ve Darbeli Düşük Frekanslı Ultrason Kantitatif Analiz neoplastik Hücreler Tedavi edilmeyen Sonic Duyarlılık belirleyin ve Tedavi için

Bu iletişim kuralı kavitasyon jel hayaletler, yakın kızılötesi lazer ışık ve yüksek yoğunluklu odaklı ultrason (HIFU) eşzamanlı maruz üzerinden kontrol edilebilir çekirdekleşme gösterir. Kavitasyon etkinlik HIFU görüntüleme ve/veya terapötik kullanımı arttırmak için daha sonra kullanılabilir.

Kavitasyon yüksek yoğunluklu arttırmak için Plazmonik altın nano tanecikleri üzerinden kontrol edilebilir çekirdekleşme ultrason uygulamaları odaklı

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Düşük yoğunluklu Geniş puls ultrason stimülasyon (LIPUS) yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile endojen veya mühendislik hücrelerinin non-invaziv mekanik uyarılması için bir yöntemi var. Bu makalede nasıl bir epi-floresan mikroskop LIPUS uygulanacağı ve akustik empedans uyuşmazlığı istenmeyen mekanik eserler önlemek için ultrason yol boyunca en aza indirmek nasıl açıklanır.

Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı

Sunulan deneysel protokol, başarılı ilaç dağıtımı ve/veya diğer biyoeffeksler için gerekli koşulların araştırılmasını sağlamak amacıyla bir hücre kültürü cihazında kavitasyon aktivitesinin gerçek zamanlı ölçümlerini yapmak için kullanılabilir.

Kavitasyon Gelişmiş Tedavi Çalışma

İki kabarcık arasındaki birleşme tekniğine dayanan tek, sıkışmış bir akustik kabarcığın şekil salınımlarını kontrol etmek için hızlı ve güvenilir bir teknik önerilmektedir. Kararlı durum, simetri kontrollü kabarcık şekli salınımları, kabarcık arayüzünün yakınında üretilen sıvı akışının analizine izin verir.

Akustik Levitasyon Sisteminde Küresel Olmayan Kabarcık Salınımları ile Mikroakışın İndüksiyonu

UV'ye yakın litografi ve çekiş kuvveti mikroskopisi, mikropatterned hidrojeller üzerindeki hücresel kuvvetleri ölçmek için birleştirilir. Tek hücrelerin hedeflenen ışık kaynaklı salınımı, aynı numune üzerinde yüksek sayıda ölçüm sağlar.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Kan-omurilik bariyerinin (BSCB) bozulması, mikrokabarcıkların intravenöz uygulaması ve düşük yoğunluklu odaklanmış ultrason (LIFU) uygulaması ile başarılı bir şekilde sağlanabilir. Bu protokol, ekipman kurulumu, mikro kabarcık enjeksiyonu, hedef lokalizasyonu ve BSCB bozulma görselleştirmesi dahil olmak üzere bir kemirgen modelinde LIFU kullanılarak BSCB'nin açılmasını detaylandırır.

Bir sıçan modelinde düşük yoğunluklu odaklanmış ultrason kullanılarak kan-omurilik bariyerinin bozulması

Bu protokol, uyanık farelerde omuriliğin ultrason stimülasyonu için özel olarak tasarlanmış bir ultrason dönüştürücü fiksasyon sistemini tanımlar. Yöntem, ultrason dönüştürücüsünün doğru konumlandırılmasını sağlamak için bir sabitleme sistemi kullanır ve aynı zamanda deney deneklerinin stimülasyon hassasiyetinden ödün vermeden serbestçe hareket etmesine izin verir.

Farelerde Omurilik Nöromodülasyonu için Ultrason Transdüserlerinin Fiksasyonu

Öğrenin, düşük yoğunluklu ultrasonun fibroblastlarda fokal adezyon oluşumu ve Rac1 aktivasyonunu nasıl tetiklediğini. Bu yöntem, kronik yara iyileşmesi için terapötik stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır.

Düşük yoğunluklu Ultrason Kullanımı Yapışma bağımlı Sinyalleri indüksiyonu

Daha fazla video keşfet