Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu In vitro MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı bir translasyon sisteminde transle edilen bir mRNA için ana translasyonel duraksama bölgelerini belirlemek ve konumlandırmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili genin T seven transkripsiyonel promotör kontrolü altında klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından mRNA transkribe edilir ve saflaştırılır.

Ardından, sentezlenen proteinleri ve yeni oluşan polipeptidleri işaretlemek amacıyla mRNA ve radyoaktif amino asitlerin varlığında in vitro translasyon gerçekleştirilir. Son olarak, polisomlar sedimentasyon hızı santrifüjü kullanılarak izole edilir ve izole edilen yeni sentez zincirleri jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Nihayetinde, Tristine SDS page ve otoradyografi ile farklı uzunluktaki yeni oluşan polipeptidleri gösteren sonuçlar elde edilebilir; bu da ilgili mRNA boyunca duraklama bölgelerinin varlığını gösterir.

Bu tekniğin, mikro-kokal nükleus koruma analizi gibi mevcut yöntemlerimize göre temel avantajı, son derece basit, hızlı ve verimli olması ve belirli bir hücre sistemi içindeki herhangi bir mRNA boyunca ana translasyon sonrası bölgelerinin belirlenmesine ve tanımlanmasına olanak tanımasıdır. Bu yöntem; kodon kullanımı, tRNA bolluğu ve/veya mRNA ikincil yapısı gibi faktörlerin translasyon kinetiğini nasıl etkilediği gibi, translasyon ve translasyonel protein katlanması alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem ayrıca, translasyon kinetiği ile kod translasyonel protein katlanma yolundaki temel basamaklar arasındaki ilişkileri anlamamıza daha fazla katkı sağlayabilir.

Bu tekniğin doğurguları, büyük ölçüde ribozom üzerindeki translasyon sırasında ko-translasyonel olarak gerçekleştiğine inanılan in vivo protein katlanma sürecinin anlaşılmasına kadar uzanmaktadır; ancak mevcut çalışma, ticari olarak temin edilen hücre özütü kullanılarak gamma-kristalin proteinin hücre dışı translasyonunu içermektedir. Bu teknik, herhangi bir hücresel kaynaktan hazırlanan translasyon kapasiteli özüt kullanılarak, potansiyel olarak herhangi bir proteindeki translasyonel IDE'lerin belirlenmesi için de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, protokolün iki kritik adımında zorluk yaşayabilirler.

Birincisi, yeni sentezlenen polipeptidlerin çoğunluğunun ribozoma bağlı kalmasını sağlayacak şekilde, translasyon reaksiyonunun yürütülmesi için gereken toplam sürenin belirlenmesidir. İkincisi ise, yeni sentezlenen polipeptidlerin çoğunluğunu ayrıştırmak için uygun bir sistem bulmaktır; sistem seçimi, incelenen proteinin boyutuna bağlıdır. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, seksenli yılların ortalarında globinin COT translasyon katlanması için önerilen modelle ilişkili olarak, globin moleküllerinin translasyon kinetiğine bakmaya karar verdiğimizde ortaya çıkmıştır.

Globin translasyonundaki tekdüzelik eksikliği, ilk olarak 1974 yılında PRO ve Maurice tarafından globin NAS ve zincirlerinin boyut dışlama CLO kromatografisi kullanılarak fark edilmiştir. Ancak, analizleri istenen hassasiyete sahip değildi; Pro ve Maurice, globin translasyonu sırasında dört ana translasyon güç merkezi gözlemlediler. Sonrasında, analizlerimiz yaklaşık 10 ek güç merkezinin ortaya çıkarılmasını sağlamış ve translasyonel globin katlanmasının ayrıntılı bir modelinin oluşturulmasına imkan tanımıştır. Burada açıklanan teknik, polizom izolasyonunu ve yeni sentezlenen polipeptidin Tris-SDS-PAGE jeli kullanılarak analizini içerdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşımaktadır.

Yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bu iki adım da kritik öneme sahiptir. Projeli gösteren kişi Myelo laboratuvarından bir lisansüstü öğrencisi olacaktır. Messenger RNA'nın in vitro transkripsiyonu için; uygun bir restriksiyon enzimi kullanılarak T7 ve/veya SP6 promotörü altına klonlanmış olan ilgilenilen bir gen ile başlayın; DNA şablonunu stop kodonunun aşağısından ve/veya mRNA 3' ucundan lineerize edin.

DNA'nın tamamen lineerleştiğini doğrulamak için restriksiyon sindiriminden bir örnek alarak agaroz jel elektroforezi yapın. Optimum DNA kalıp konsantrasyonu belirlendikten sonra, üretici talimatlarına uygun olarak bir transkripsiyon kiti kullanarak in vitro haberci RNA transkripsiyonu gerçekleştirin. Ardından, mRNA'yı saflaştırmak için lityum klorür çöktürme yöntemini kullanın.

Ardından, saflığını doğrulamak için akrilamid veya agaroz jel elektroforezi kullanın. Nükleaz içermeyen su içerisinde; metiyonin hariç 1 mM amino asit karışımı, 10 ünite RNA inhibitörü, 20 µCi radyoaktif 35 S metiyonin ve tavşan retikülosit lizatı ekleyerek 100 µL'lik bir in vitro translasyon reaksiyonu hazırlayın. Daha sonra, reaksiyonu 30 °C'de beş dakika inkübe ederek ön ısıtma yapın.

Ardından iki µg mRNA ekleyin ve reaksiyonu durdurmak için 30 °C'de beş dakika inkübe edin, ribozomlara bağlı yeni sentezlenen polipeptitleri izole etmek için buz üzerine yerleştirin. Translasyon reaksiyonunu, potasyum klorür ve magnezyum klorür içeren pH 7.6 %30 gliserol Tris HCl üzerine katmanlayarak TLA 110 rotor santrifüj ile 4 °C'de bir saat boyunca 100.000 ×g'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın, ardından yeni sentezlenen polipeptitleri içeren polisomal peleti, 0,5 mg/mL ribonükleaz A içeren küçük bir hacim 1 mM Tris HCl tamponu (pH 7.6) içinde yeniden süspanse edin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Peptit ve tRNA ester bağının hidrolizini artırmak için, reaksiyona 10 millimolar nihai konsantrasyonda sodyum hidroksit ekleyin ve 30 dakika daha inkübe edin. Oluşan polipeptitleri tris-tris SDS-PAGE ile ayrıştırın, ardından jelleri sabitleyin ve kurutun. Oluşan polipeptitlerin tespiti için jelleri önce otoradyografiye, ardından fosfor görüntülemeye tabi tutun.

tRNA havuzundaki değişikliklerin tetiklediği değişmiş ribozom hareketi, translasyon sırasında biriken yeni sentezlenen polipeptitlerin boyut dağılımının yanı sıra, buradaki duraklama süresini yansıtan bağıl yoğunluklarının da değişmesine yol açmalıdır. Gamma B kristalin proteini için yeni sentezlenen polipeptitler izole edilmiş ve Tristine SDS page ile ayrıştırılmıştır. RRL ve e coli sistemlerindeki polipeptitlerin farklı uzunlukları ve yoğunlukları, bu iki sistemde ribozomların mRNA boyunca hareketinin farklı translasyon kinetikleri izlediğini göstermektedir.

Örneğin, tavşan retikülosit lizat sisteminde bulunmayan, e coli lizatındaki belirgin 17.7 kilodalton bandına dikkat edin. Gamma B kristalini, memeli sistemlerinde yaygın olan ancak e coli'de son derece nadir olduğu ve yavaş çevrildiği bilinen tandem arginin kodonlarını barındırmaktadır; bu durum, burada gösterildiği gibi, söz konusu bandın ribozomun bu tandem nadir kodonlarda duraklamasından kaynaklandığını göstermektedir.

mRNA yokluğunda herhangi bir bant gözlemlenemez ve purmycin uygulaması, yeni sentezlenen zincirlerin çoğunu polizomdan uzaklaştırır. Ayrıca, uzun süreli purmycin uygulaması tüm yeni sentezlenen zincirleri uzaklaştırarak, gözlemlenen polipeptit ürünlerinin polizomla birlikte çöken MRP'ler değil, ribozoma bağlı yeni sentezlenen zincirler olduğunu doğrular. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem bir ila iki günde tamamlanabilir. Prosedürün süresi temel olarak santrifüj adımının ve yeni sentezlenen peptit jel elektroforezi adımının süresine bağlıdır.

Bu prosedürü uygularken, inkübasyon süresi sonunda translasyon reaksiyonunun derhal durdurulması önemlidir. Yeni sentezlenen polipeptidin ribozomdan ayrılmasını önlemek için, herhangi bir aşamada RNA'ların bulunmamasına dikkat edilmesi kritik önem taşımaktadır. RNA kontaminasyonu, ekstraktın translasyon verimliliğini etkileyebilir ve bu prosedürün ardından yeni sentezlenen polipeptidin ribozomdan ayrılmasına yol açabilir.

Örneğin, mRNA bağlayıcı proteinlerin belirli bir mesaj üzerindeki ribozom hareketinin verimliliği üzerindeki etkileri gibi diğer hedefler de yöntemin geliştirilmesinin ardından test edilebilir. Bu teknik, protein katlanması alanındaki araştırmacıların, translasyonel protein katlanmasında nadir kodların varlığından kaynaklanan translasyon duraksamasının rolünü incelemelerinin önünü açmıştır. Bu teknik, daha önce bir mesaj üzerindeki ribozom hareketi ve translasyonel protein katlanması üzerinde kodon substitüsyonlarının rolünü test etmek için kullanılmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, ribozoma bağlı yeni sentezlenen polipeptitleri izole ederek, sunulan mRNA'nın translasyonel güç bölgelerini nasıl tanımlayacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktif izotoplar ve örneğin [S]35 metiyonin gibi işaretli amino asitlerle çalışmanın özel önlemler gerektirdiğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken bunun her zaman göz önünde bulundurulması gerektiğini unutmayın.