Name: Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu In vitro MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin, ribozom bağlı doğan polipeptitleri izole ederek mRNA üzerindeki translasyonel duraklama bölgelerini nasıl belirleyeceğinizi. SDS-PAGE ve otoradyografi ile analiz yaparak protein sentezi dinamiklerini inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0024 tarafından finanse edildi.

1. Şablon DNA hazırlanması ve in vitro transkripsiyonu sonucunda <ol><li> Ilgi genindeki T7 ve / veya örneğin SP6 transkripsiyonel promotörü altında klonlanmış edilir. </li><li> In vitro transkripsiyonu sonucunda için DNA ORF durdur kodonu ve / veya mRNA 3 &#39;end of aşağı kesme uygun sınırlama enzimi ile lineerleştirilebilir edilir. Bir agaroz jel elektroforez ile ilgili sınırlama sindirim ürünü çalıştırarak plazmid DNA tam doğrusallaştırma doğrulamak için gereklidir. </li><li> Lineerize plazmid vitro transkripsiyon reaksiyonunda kullanılmıştır. Şablon DNA, farklı konsantrasyonda in vitro transkripsiyonu sonucunda için gereken optimal DNA konsantrasyonu tespit etmek test edilebilir. Genellikle, Ambion Kullanıcı MEGAscript Yüksek verim Transkripsiyon Seti (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) ile, 1 mikrogram lineerleştirilebilir DNA mRNA 40-60 mikrogram verir. In vitro transkripsiyon olarak üreticinin talimat (Ambion / Life Technologies, Grand Islan takip yapılırd, NY). </li><li> In vitro transkripsiyonu sonucunda takiben mRNA üreticinin talimat (Ambion en MEGAscript yüksek verim Transkripsiyon Kit) uygun olarak lityum klorürle çökeltme ile arıtılır. </li><li> mRNA bütünlüğünü daha da akrilamid veya agaroz jel elektroforez tarafından doğrulanır. </li></ol> 2. In vitro Hücre Bedava Çeviri Aşağıdaki adımları izleyin R abbit R eticulocyte Lysate, RRL (Promega, Madison, WI) kullanılarak in vitro çeviri için: <ol><li> In vitro çeviri reaksiyon aşağıdaki üreticinin talimat 100 ul hazırlayın. Kısaca, nükleaz serbest su içinde 2 ul amino asit karışımı eksi metiyonin (1 mM), RNaz önleyici (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), radyoaktif 20 μCi [35S]-Metionin (MP Biomedicals 10 birim, ekleme ) OH, Solon, tavşan Retikülosit Lizat (Promega, Madison, WI) ve 70 ul. </li><li> Th inkübeSıcak için önceden reaksiyon için 5 dakika süreyle 30 ° C&#39;de e reaksiyon. 5 dakika boyunca 30 ° C&#39;de inkübe çevirisi ve reaksiyon için mRNA 2 ug ekleyin. </li><li> Buz üzerinde çeviri tepki koyarak reaksiyonu durdurun. </li></ol> 3. In vitro Çeviri Reaksiyonunda gelen Doğan Polipeptitler İzolasyonu <ol><li> Ribozom (polysome) bağlı olgunlaşmamış bir polipeptid izole etmek için, reaksiyon için 100 mM KCI, 10 mM 2 MgCI içeren 10 mM Tris-HCl tamponu, pH 7.6 içinde% 30 gliserol 4.5 ml üst katmanlar, 100,000 ve X g&#39;de santrifüje tabi tutulur 4 ° C de 1 saat süre ile, bir TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) içinde </li><li> Süpernatant daha dikkatli bir şekilde çıkarılır. </li><li> Olgunlaşmamış polipeptidlerin içeren polysomal pelet, 0.5 mg / ml bir ribonükleaz (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), ve daha inkübe içeren, 1 mM Tris-HCl tampon pH 7.6 küçük bir hacim (10-15 ul) içinde tekrar süspanse edilir 37, 30 dakika ° C. Sıraylapeptidil-tRNA ester bağı hidroliz geliştirmek için, NaOH 10 mM nihai bir konsantrasyona ilave edildi ve inkübasyon 30 dakika daha devam edilir. </li></ol> In vitro çeviri reaksiyon mRNA olmadan monte edilmiş ve aynı koşullarda (tarif edildiği gibi doğmakta olan peptidler izolasyonu takiben) altında yapılan büyük bir kontrol olarak hizmet verecek. Yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile ekstre tabi önce puromycin ile için reaksiyon (lar) tedavisinde ek bir kontrol olarak hizmet edebilir. 4. Tris-trişin SDS PAGE üzerine Doğan ekleşimlerin çözümleniyor <ol><li> Izole doğmakta olan polipeptidler giderilmiş ve Tris-trişin SDS-PAGE analiz edilir. Materyalin miktarı protein etiketleme, protein çevirisi ve diğerleri parametreleri üzerindeki etkinliğini verimi üzerinde olacak bağımlı jel üzerinde, yüklenen dikkat ediniz. Yüklenen materyalin miktarı bes izin verecek şekilde ampirik olarak ayarlanması gerekmektedirt görselleştirme ve bireysel doğmakta olan polipeptid zincirlerinin ayrılması. </li><li> Elektroforez jeller sabitlenir sonra, vakum jel kullanılarak Dyer ve otoradyografi tabi kurutuldu. Doğmakta olan polipeptidlerin dağılımı phosphoimaging kullanarak gözlenmiştir. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Sığır Gamma-B kristalen yanı E. olduğu gibi Tavşan Retikülosit Lysate tercüme edildi coli S30 Ekstrakt Sistemi (Promega, Madison, WI) olgunlaşmamış bir polipeptid zincirleri izole edilmesi, ardından. Şekil 1 ribozom bağlı olgunlaşmamış zincirlerinin izolasyonu dahil adımları tasvir etmektedir. TRNAs (dolayı organizmalar arasında kodon yanlılığı farklılıklar önemli ölçüde memeli farklı (RRL) ve prokaryotik (E. coli) sistemleri olarak da bilinir) çevirisi yani repertuarı çevre değişiyor eğer Bu çalışmada amaç, test oldu mRNA üzerinde ribozom hareketi değiştirmek ve çeviri duraklama sitelerin dağılımı etkileyebilir.Altered ribozom hareketi çeviri yanı sıra onların göreceli yoğunlukları sırasında toplanan olgunlaşmamış polipeptidlerin boyutlarda dağılımında değişikliklere yol açacaktır. Bantların Bağıl yoğunluğu duraklama süresini yansıtmaktadır. Doğmakta olan polipeptidlerin izole edilmiş ve% 16.5 T,% 6 C Tris-trişin SDS PAGE (Şekil 2) çözüldü. Gamma-B kristalen bir 20 kDa bir proteindir. RRL ve E. içinde, özdeş olmayan uzunlukları ve yoğunlukları doğmakta polipeptidlerin gözlem coli sistemleri, bu iki sistemlerinde mRNA boyunca ribozom hareketi için farklı kinetik aşağıdaki olduğunu gösterir. Örneğin, E. 17.7 kDa arasında belirgin bir bant gözlenen Bu E&#39;de çevrildiğinde mRNA 3&#39;-ucu bölgesi (gama B kristalen bir kodlama C-ucu bölgesi), ek bir duraklama translasyon sitesi olduğunu düşündürmektedir RRL sisteminde coli lizat değil, coli sistemi. Biz unutmayın Gamma-B kristalen limanlar tandem Arg kodonlar (AGG 1Memeli sistemlerinde sık sık, fakat E&#39;de çok nadir ve yavaşça çevrilmelidir bilinmektedir ve 53 AGA 154) coli. E. biriken bir roman doğmakta olan peptid coli sistemi (~ 17.7 kDa Şekil 2.2) muhtemelen bu tandem nadir kodonlar az duraklatarak Ribozom neden olur. Hiçbir bantları mRNA yokluğunda (Şekil 2.3) gözlendi ve bu puromycin tedavi polysomes (Şekil 2.3) den doğmakta zincirlerinin en kaldırır olabilir unutmayın. Puromycin (&gt; 15 dk) ile uzun süreli tedavi tüm doğmakta olan zincirleri (veriler gösterilmemiştir) kaldırır. Bu gözlenen polipeptid ürünler yerine polysomes ile cosedimenting mRNPs daha ribozom ilgili doğmakta olan zincirleri, olduğunu onaylar. Yukarıda bahsedildiği gibi, kodon önyargı organizmanın gibi doku özgüdür. Temsili örnek, burada açıklandığı şekilde tRNAs / kodon çeviri yani repertuarı ortamı değiştirerek gösterirönyargı mRNA boyunca ribozomunun değiştirilmiş bir harekete neden olabilir. Besbelli, bu basit tekniği sadece mRNA boyunca öteleme duraklama sitelerinin kimlik izin veremeyiz, ama aynı zamanda farklı sistemler arasında çeviri duraklama sitelerin hızlı karşılaştırma izin verir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" /> Şekil 1.. Şematik ribozom bağlı olgunlaşmamış polipeptidlerin yalıtılmasının yer adımları açıklayan. Sığır Gamma-B kristalen ORF sırası (528 baz çifti) pBSKS içinde aşağı T7 promotörünün klonlandı +. In vitro transkripsiyonu sonucunda için DNA EcoRI ile işleme tabi tutulmasıyla lineerleştirilebilir edildi. Lineerize şablon in vitro transkripsiyonu sonucunda için kullanılmıştır. DNA şablonu T7 promotor aşağı Gamma-B kristalen gen transkripsiyonun T7 RNA polimeraz tarafından tanınır. mRNA lityum klorür çöktürme yöntemi kullanılarak saflaştırıldı. MRNA arıtılmış vitro çeviri için kullanılır. Ardındanİnkübasyondan sonra, reaksiyon için% 30 gliserol çözeltisi üstüne katmanlı ve 4, 1 saat boyunca santrifüje tabi tutulur ribozom bağlı olgunlaşmamış polipeptidlerin izole etmek için 100,000 x g ° C&#39;de. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" /> Şekil 2. Tavşan Retikülosit Lysate (RRL) ve E. tercüme Sığır Gamma-B kristalen doğmakta polipeptidlerin İzolasyonu Lizat coli. 2 ug mRNA RRL veya E. içeren 100 ul reaksiyon içinde karıştırılmıştır 5 dakika süreyle 20 μCi [35S]-metionin ve 30 ° C&#39;de olan üreticinin talimatlarına uygun olarak coli S30 Ekstrakt Sistemi (Promega, Madison, WI). Aşağıdaki reaksiyon için inkübasyon 100 mM KCI, 10 mM 2 MgCI içeren, 10 mM Tris-HCl tamponu, pH 7.6 içinde% 30 gliserol 4.5 ml üstüne katmanlı ve 4 ° C&#39;de 100,000 ve X g&#39;de 1 saat boyunca santrifüj edildi Bir TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA). Izole polyribosome pelet resu olduA (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) NaOH (olarak protokolü bölümünde açıklandığı) içinde gerçekleştirilmiş ve ardından 0.5 mg / ml ribonükleaz içeren, 1 mM Tris-HCl, pH 7.6 ile 20 ul içerisinde harcanan. Doğan polipeptidlerin% 16.5 T,% 6 C Tris-trişin SDS PAGE jel çözüldü. Jel, kurutulur ve otoradyografi için maruz bırakıldı. Maruziyet sonrasında jel GE Healthcare&#39;in Typhoon Görüntüleme Tarayıcı ile taranmıştır. Şekil 2.1 çeviri reaksiyonları iki farklı sistem (RRL ve E. coli) yapılır sonra izole ve çözülmesi doğmakta polipeptidlerin ile jel gösterir. Şekil 2.2 jel Görüntü Quant TL ile analiz edildi . çeviri sonrasında SDS PAGE izole ve çözülmesi doğmakta polipeptidlerin: V2005 yazılım ve iki sistem biriken doğmakta polipeptidlerin molekül ağırlığı ve yoğunluğu kolayca analiz ve mukayese edilebilir olduğunu göstermek için burada örnek olarak kullanılan Şekil 2.3 kontroller iki set gösterir reaksiyonlar monte edilmiştirReaksiyon santrifüjleme tabi tutuldu ve daha önce mRNA ve / veya sonra olmadan için reaksiyonlara puromycin (5 dakika, nihai kons. 1 mM) ile muamele edildi.

<ol><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli%2C+Bacillus+subtilis%2C+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Schizosaccharomyces+pombe%2C+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens%3B+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221(2006).</li>
<li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li>
<li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides%2C+evidence+for+pause+localization+sites%2C+and+a+cotranslational+protein-folding+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li>
<li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li>
<li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+translation+of+%CE%B3+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system%3A+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li>
<li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth%2C+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li>
<li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li>
<li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22silent%22+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498(2011).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

In vitro transkripsiyonu ve translasyon reaksiyonlarda kullanılan bileşenlerin tekrarlanabilir sonuçlar, kalite ve konsantrasyonu için kritiktir. Mevcut çalışmada dikkatli kullanılırsa, yüksek oranda tekrarlanabilir veri sağlamak ticari kitler ve özleri kullanmışlardır. Gerekirse Bununla birlikte, çeviri-yetkin özler, birinin tercih edilen hücre ile hazırlanabilir. MRNA Kalite çeviri etkileyebilir, bu nedenle in vitro çeviri sırasında kullanmadan önce mRNA&#39;ların bütünlüğünü test etmek için...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Kit Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Yüksek verim Transkripsiyon Kiti </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonükleaz İnhibitör </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Etiket </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonükleaz-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> Tavşan Retikülosit Lysate Sistemi, Nükleaz Tedavi </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> Doğrusal Şablonlar için E.coli S30 Özü Sistemi </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX ultrasantrifüjdeki </td></tr><tr><td> Depolama fosfor autoradiography </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 değişken modunu görüntüleme </td></tr><tr><td> Doğmakta olan polipeptid analizi için yazılım </td><td> GE Healthcare </td><td> Görüntü Quant TL, V2005 </td></tr></tbody></table>

ribozom bağlı doğan polipeptitler İzolasyonu<em&gt; in vitro</em&gt; mrna boyunca translasyonel duraklat siteleri belirleme

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Translasyonel uzama oranı non-üniform. ikincil yapı, kodon kullanım mRNA ve 1 görmek ilişkili proteinlerin inceleme için mesaj üzerinde ribozom hareketini değiştirebilir mRNA&#39;ya. Ancak, günümüzde yaygın eşanlamlı kodon kullanımı düzgün olmayan translasyonal uzama oranları 1 birincil nedeni olduğu kabul edilmektedir. Eşanlamlıdır kodonlar aynı frekansı ile kullanılmaz. Bir önyargı diğerleri 2 daha sık kullanılan bazı kodonlar ile eşanlamlı kodon kullanımı var. Kodon önyargı organizma gibi 2,3 spesifik bir dokudur. Dahası, kodon kullanımına sıklığı soydaş tRNAs 4 konsantrasyonları ile doğrudan orantılıdır. Böylece, sık kullanılan bir kodon daha sık bir kodon hızlı bir seyrek bir daha tercüme edilecektir ima ilgili tRNAs yüksek sayıda sahip olacak. Böylece, nadir kodonlar (potansiyel duraklama siteleri) zenginleştirilmiş mRNA üzerindeki bölgelerde kural olarak Messa üzerinde ribozom hareketi yavaşlatacakilgili boyutları 5-8 doğmakta peptidlerin ge ve neden birikimi. Bu duraklama siteler protein ekspresyonu fonksiyonel etkisi olabilir, mRNA stabilitesi ve inceleme için protein katlanması 9&#39;a bakın. Gerçekten de, bu tür duraklama siteleri hafifletilmesi mRNA üzerinde ribozom hareketi değiştirebilir ve daha sonra co-translasyon (in vivo) protein katlama 1,7,10,11 etkinliğini etkileyebilir olduğu gösterilmiştir. Sonuçta o translasyonel uzama sırasında mRNA boyunca ribozomların hareketine kodon kullanım / tRNA içerik etkisi içine kapsamlı bilgiler edinmek için gerekli olan protein sentezinin sürecine birleşen hücre, in vivo protein katlanması süreci anlamak için . Burada çeşitli hücre içermeyen sistemlerde 6-8 tercüme belirli bir mRNA için büyük çevirisi duraklama yerleri bulmak için kullanılabilecek basit bir teknik açıklar. Bu prosedür, olgunlaşmamış polipeptidlerin accumulati izolasyonu dayanmaktadırbir hedef mRNA in vitro çeviri sırasında ribozomlar üzerinde ng. Mantığı düşük frekanslı kodonlar az, karşılık gelen boyutlarda olgunlaşmamış peptid artan miktarlarda ribozom sonuçların kalma süresi de artar. In vitro transkripsiyonu mRNA olarak radyoaktif olarak etiketlenmiş amino asitlerin varlığında in vitro translasyon reaksiyonlar için kullanılan olmasıdır doğmakta olan zincirlerinin algılanmasına izin vermek için. Ribozom bağlı olgunlaşmamış bir polipeptid kompleksleri izole etmek için, reaksiyon için santrifüjleme ardından% 30 gliserol çözeltisi üstüne katmanlı edilir. Polysomal pelet yılında Doğan polipeptidlerin daha ribonükleaz A ile tedavi edilen ve SDS PAGE ile çözümlenir. Bu teknik potansiyel olarak herhangi bir protein için kullanılan ve ribozom mRNA boyunca hareket ve büyük duraklama sitelerin tespiti analizi sağlar edilebilir. Ayrıca, bu protokol ribozom hareketi değiştirebilir ve böylece potansiyel olarak da inci değiştirebilir faktörleri ve koşulları incelemek için adapte edilebilire fonksiyon / proteinin konformasyon.

MRNA üzerindeki translasyonel duraklama siteleri tanımlamak için bir teknik tarif edilmiştir. Bu prosedür bir denatüre jel elektroforez ile olgunlaşmamış zincirlerinin boyutu analizi ve ardından bir hedef mRNA in vitro için, içerisinde sırasında ribozom üzerinde biriken olgunlaşmamış polipeptidlerin izolasyonu dayanmaktadır.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

Translasyonel uzama hızı tekdüze değildir. mRNA ikincil yapısı, kodon kullanımı ve mRNA ile ilişkili proteinler, ribozomun ... üzerindeki hareketini değiştirebilir.

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı bir translasyon sisteminde transle edilen bir mRNA'nın ana translasyonel duraklama bölgelerini tanımlamak ve konumlandırmaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili genin bir T7 transkripsiyonel promotör kontrolü altında klonlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından mRNA transkribe edilir ve saflaştırılır.Ardından, sentezlenen proteinleri ve yeni oluşan polipeptidleri işaretlemek için mRNA ve radyoaktif amino asitlerin varlığında in vitro translasyon gerçekleştirilir. Son olarak, polizomlar sedimantasyon hızı santrifüjasyonu kullanılarak izole edilir ve izole edilen yeni zincirler jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Nihayetinde, Tristine SDS page ve otoradyografi ile farklı uzunluktaki yeni polipeptidleri gösteren sonuçlar elde edilebilir; bu da ilgili mRNA boyunca duraklama bölgelerinin varlığını belirtir.Bu tekniğin, mikro kokal çekirdek koruma analizi gibi mevcut yöntemlerimize göre temel avantajı; son derece basit, hızlı ve verimli olması ve belirli bir hücre içi sistemdeki herhangi bir mRNA boyunca ana translasyon sonrası bölgelerin belirlenmesine ve tanımlanmasına olanak sağlamasıdır. Bu yöntem; kodon kullanımı, tRNA bolluğu ve/veya mRNA ikincil yapısı gibi faktörlerin translasyon kinetiğini nasıl etkilediği gibi, translasyon ve translasyonel protein katlanması alanındaki bazı temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem ayrıca, translasyon kinetiği ile kod translasyon protein katlanma yolundaki temel basamaklar arasındaki ilişkilerin anlaşılmasına daha fazla katkı sağlayabilir.Bu tekniğin önemi, protein katlanmasının büyük ölçüde ribozom üzerindeki translasyon sırasında ko-translasyonel olarak gerçekleştiğine inanılan in vivo sürecinin anlaşılmasına kadar uzanmaktadır; ancak mevcut çalışma, ticari olarak temin edilen hücre ekstraktı kullanılarak gamma bikristalin proteininin hücre dışı translasyonunu içermektedir. Bu teknik, herhangi bir hücresel kaynaktan hazırlanan translasyon yeteneğine sahip ekstraktlar kullanılarak, potansiyel olarak herhangi bir proteinle ilgili translasyonel IDE'lerin belirlenmesinde de uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, protokolün iki temel adımında zorluk yaşayacaklardır.Birincisi, yeni sentezlenen polipeptidlerin çoğunluğunun ribozoma bağlı kalmasını sağlayacak olan translasyon reaksiyonu için gereken toplam sürenin belirlenmesidir. İkincisi ise, yeni sentezlenen polipeptidlerin çoğunluğunu ayrıştırmak için uygun bir sistem bulmaktır; sistem seçimi, incelenen proteinin boyutuna bağlıdır. Bu yöntem fikri ilk olarak, seksenli yılların ortalarında, globinin eş zamanlı translasyon-katlanma (COT) önerilen modeliyle ilişkili olarak globin moleküllerinin translasyon kinetiğine bakmaya karar verdiğimizde ortaya çıkmıştır.Globin translasyonunun heterojenliği, 1974 yılında PRO ve Maurice tarafından globin NAS ve zincirlerinin boyut dışlama CLO kromatografisi kullanılarak ilk kez fark edilmiştir. Ancak, Pro ve Maurice'in analizleri istenen hassasiyete sahip değildi ve globin translasyonu sırasında dört ana translasyon duraklama bölgesi gözlemlenmiştir. Sonrasında, bizim analizimiz yaklaşık 10 ek duraklama bölgesinin ortaya çıkarılmasını sağlamış ve translasyonel globin katlanmasının ayrıntılı bir modelinin oluşturulmasına imkan tanımıştır. Burada açıklanan teknik, polizom izolasyonunu ve Tri S Ds page jeli kullanılarak yeni sentezlenen polipeptidlerin analizini içerdiğinden, bu yöntemin görsel demonstrasyonu kritik önem taşımaktadır.Her iki adım da yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Progel uygulaması, Myelo laboratuvarından bir lisansüstü öğrencisi tarafından gerçekleştirilecektir. Messenger RNA'nın in vitro transkripsiyonu için, uygun bir restriksiyon enzimi kullanılarak T7 ve/veya SP6 promotörü altına klonlanmış hedef bir gen ile başlayın; DNA kalıbını stop kodonunun aşağısından ve/veya mRNA 3' ucundan lineerize edin.DNA'nın tamamen lineerleştiğini doğrulamak için restriksiyon sindirim örneğine agaroz jel elektroforezi uygulanır. Optimum DNA kalıp konsantrasyonu belirlendikten sonra, üretici talimatlarına uygun olarak bir transkripsiyon kiti kullanarak haberci RNA'nın in vitro transkripsiyonu gerçekleştirilir. Ardından, mRNA'yı saflaştırmak için lityum klorür çöktürmesi yöntemi kullanılır.Ardından, saflığını doğrulamak için akrilamid veya agaroz jel elektroforezi kullanın. Nükleaz içermeyen su içinde; metiyonin hariç 1 mM amino asit karışımı, 10 ünite RNA inhibitörü, 20 µCi radyoaktif 35S metiyonin ve tavşan retikulosit lizatı ekleyerek 100 µL'lik bir in vitro translasyon reaksiyonu hazırlayın. Daha sonra reaksiyonu 30 °C'de beş dakika inkübe ederek ön ısıtma yapın.Ardından, reaksiyonu durdurmak için iki µg mRNA ekleyin ve 30 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin, ardından ribozomlara bağlı yeni sentezlenen polipeptidleri izole etmek için örneği buz üzerine yerleştirin. Translasyon reaksiyonunu, potasyum klorür ve magnezyum klorür içeren 4,5 mL %30 gliserol Tris-HCl pH 7.6 üzerine katmanlayın ve TLA 110 rotor santrifüj kullanarak 4 °C'de bir saat boyunca 100.000 ×g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve yeni sentezlenen polipeptidleri içeren polisomal peleti, 0,5 mg/mL ribonükleaz A içeren küçük bir hacim 1 mM Tris-HCl pH 7.6 tamponunda yeniden süspande ederek 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Peptit TRNA ester bağının hidrolizini artırmak için, reaksiyona 10 milimolar son konsantrasyonda sodyum hidroksit ekleyin ve 30 dakika daha inkübe edin. Yeni sentezlenen polipeptitleri tris tri SDS page ile ayırın, ardından jelleri sabitleyip kurutun. Yeni sentezlenen polipeptitlerin tespiti için jellere önce otoradyografi, ardından fosfor imajlama uygulayın.tRNA havuzundaki değişikliklerin tetiklediği değişmiş ribozom hareketi, translasyon sırasında biriken yeni sentezlenen polipeptitlerin boyut dağılımında ve buradaki duraklamanın süresini yansıtan bağıl yoğunluklarında değişikliklere yol açmalıdır. Gamma B kristalin proteini için yeni sentezlenen polipeptitler izole edilmiş ve Tristine SDS-PAGE ile ayrıştırılmıştır. RRL ve E. coli sistemlerindeki polipeptitlerin farklı uzunlukları ve yoğunlukları, bu iki sistemde ribozomların mRNA boyunca hareketinin farklı translasyon kinetikleri izlediğini göstermektedir.Örneğin, rabbit reticulocyte lizat sisteminde bulunmayan, e coli lizatındaki belirgin 17.7 kilodalton bandına dikkat edin. Gamma B crystalline, memeli sistemlerinde yaygın olan ancak e coli'de son derece nadir olduğu ve yavaş çevrildiği bilinen tandem arginin kodonlarını barındırır; bu durum, buradaki bandın ribozomun bu tandem nadir kodonlarda duraklamasından kaynaklandığını göstermektedir.mRNA yokluğunda herhangi bir bant gözlemlenemez ve purmycin işlemi polizomdan yeni sentezlenen zincirlerin çoğunu uzaklaştırır. Ayrıca, purmycin ile yapılan uzun süreli işlem, polizom ile birlikte çöken MRP'lerden ziyade, gözlemlenen polipeptit ürünlerinin ribozoma bağlı yeni sentezlenen zincirler olduğunu doğrulayarak tüm yeni sentezlenen zincirleri uzaklaştırır. Bu teknik ustalığında uzmanlaşıldığında, bir ila iki günde tamamlanabilir. Prosedürün süresi temel olarak santrifüjleme adımının ve yeni sentezlenen peptit jel elektroforezi adımının süresine bağlıdır.Bu prosedürü uygularken, inkübasyon süresinden hemen sonra translasyon reaksiyonunu durdurmak önemlidir. Yeni sentezlenen polipeptidin ribozomdan ayrılmasını önlemek için, herhangi bir adımda RNA'ların bulunmaması kritik önem taşır. RNA kontaminasyonu, ekstraktın translasyon verimliliğini etkileyebilir ve bu prosedür takip edildiğinde yeni sentezlenen polipeptidin ribozomdan ayrılmasına yol açabilir.Geliştirildikten sonra, örneğin mRNA bağlayan proteinlerin belirli bir mesaj üzerindeki ribozom hareketleliği üzerindeki etkileri gibi diğer hedefler de test edilebilir. Bu teknik, protein katlanması alanındaki araştırmacıların, translasyonel protein katlanmasında nadir kodların varlığı nedeniyle ortaya çıkan translasyon duraksamasının rolünü keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu teknik, daha önce bir mesaj üzerindeki ribozom hareketliliği ve translasyonel protein katlanması üzerinde kodon substitüsyonlarının rolünü test etmek için kullanılmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, ribozoma bağlı yeni sentezlenen polipeptitlerin izole edilerek, sunulan mRNA'daki translasyonel güç bölgelerinin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktif izotoplar ve örneğin [35S]metiyonin gibi işaretli amino asitlerle çalışmanın özel önlemler gerektirdiğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman dikkate alınması gerektiğini unutmayın.

isolation-ribosome-bound-nascent-polypeptides-vitro-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır...

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin, ribozom bağlı doğan polipeptitleri izole ederek mRNA üzerindeki translasyonel duraklama bölgelerini nasıl belirleyeceğinizi. SDS-PAGE ve otoradyografi ile analiz yaparak protein sentezi dinamiklerini inceleyin.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu

Daha fazla video keşfet