Name: Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin, enfekte hücrelerin kromatininden viral ribonükleoprotein komplekslerini (VRNP) saflaştırma yöntemini. Bu protokol, influenza virüsü biyolojisini ve viral RNA sentez mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar RWSN PB2-Strep virüs için Nada Naffakh ve Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) teşekkür etmek istiyorum.

<html> Protokolünün şematik akış şeması Şek. 1 ve reaktifleri bir tablo aşağıda sunulmuştur. 1. Enfeksiyon (16 - 24 saat) <ol><li> Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM)-yüksek bunlar ertesi gün (yaklaşık 5 x 10 hücre 8) yaklaşık% 80 konfluent ulaşacak örneğin glikoz, orta, 5 mm 150 plastik hücre kültür tabaklarında HeLa hücreleri tohumu. Bu hücreler% 100 birbirine karışmış ulaşamamaktadır olması önemlidir. </li><li> Ertesi gün, içine Strep-etiketli grip virüsü stoku seyreltik fosfat-tamponlu salin (PBS) içeren% 0.3 bovin (BSA) 3 arasında bir enfeksiyon çokluğu için serum albümini. </li><li> Hücrelerinden büyüme medyumu kaldırmak, bir kez PBS ile yıkanır ve 10 ml PBS hücrelere virüs içeren ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> DMEM-yüksek glukoz ile enfeksiyon orta değiştirin ve 37 inkübasyon devam ° C </li></ol>&quot;&gt; Inkübasyon süresi (Tartışma bakınız) üzerinde çalışma yapılacak olan enfeksiyon faz bağlıdır. 2. Subselüler Fraksiyonu (3 saat) <ol><li> Soğuk PBS ile bir defa yıkanır ve ardından hücreler bir lastik sıyırıcı ve 50 ml konik tüpe transferi ile soğuk PBS içerisinde askıya hücreleri. </li><li> 1000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca bir masa üstü santrifüj ile ve daha sonra pelet hücreler PBS aspire. </li><li> 10 ml soğuk sükroz tampon içinde Pastör pipetiyle hücre peleti (10 mM Hepes pH 7.9, 10 mM KCI, 2 mM Mg asetat (MgOAc), 3 mM CaCl2, 340 mM sukroz, 1 mM ditiyotreitol (DTT),% 1 proteaz inhibitörü karışımı) . Süspansiyon sonra, hücre kümeleri bozmak için bir 10 ml plastik pipet serum takılı bir 200 ul pipet aracılığıyla hücrelere geçerler. </li><li> Buz üzerinde 10 dk inkübe edin. Yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon periyodik ters. </li><li> 15 sn için yüksek hızda% 0.5 ve girdaplı bir son konsantrasyon elde etmek Nonidet P-40 (NP-40) eklenir. Derhal bir masa üstü centrifu içinde 4 ° C&#39;de 3.500 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjge. </li><li> 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu sitoplazmik bölümüdür. Pelet orijinal hücre peleti daha küçük ve daha beyaz olmalıdır. Bütün fraksiyonlar 4 ° C&#39;de en az 4 saat boyunca saklanabilir </li><li> Adım 2,5 gibi 5 ml soğuk sükroz tampon, tekrar santrifüj ile pelet yıkanır ve süpernatant atılır. </li><li> 1.5 ml soğuk nucleoplasmic ekstraksiyon tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 150 mM KOAc, 1,5 mM MgCl2,% 0.1 NP-40, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı) içinde pelet (çekirdekler içeren) tekrar süspansiyon. </li><li> Bir dar havaneli ile soğutulmuş, tamamen cam 4 ml Dounce Homojenizatör transfer ve 20 vuruş ile çekirdekleri homojenize. Homojenizasyon sırasında köpük kaçının. Direnci yaklaşık 10 vuruş sonrası artırmalıdır. Verimli homojenleştirme bir faz kontrast mikroskop altında teyit edilebilir. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü homojenize çekirdekleri aktarın ve 4 dönen bir tekerlek üzerinde 20 dk inkübe °C. </li><li> 10 dakika süre ile 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 16,000 x g&#39;de santrifüje. </li><li> 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu nucleoplasmic bölümüdür. </li><li> 1.5 ml sindirim tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı, 100 U / ml Benzonase (RNA analizi için, 20 U / ml RNase ile ikame in Pastör pipetiyle pelet içermeyen Dnaz i)) 37 ön ° C&#39;a ısıtılmış ve 37 &#39;de 10 dakika inkübe ° C. </li><li> 5 M NaCl 42 ul (150 mM NaCl nihai konsantrasyon) ekleyin ve 4 de 20 dakika daha inkübe ° C. </li><li> 10 dakika süre ile 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 16,000 x g&#39;de santrifüje. </li><li> 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu ch150 bölümüdür. </li><li> Pastör pipetiyle pelet 1.5 ml soğuk yüksek tuz tamponu (50 mM Hepes pH 7.9, 500 mM NaCI, 1.5 mM MgCl2,% 0.1 NP-40, 1 mM DTT,% 1 proteaz inhibitörü karışımı) ve buz üstünde 20 dakika inkübe edilir. </li><li> 16.000 az x g &lt;santrifüjleyin/ Em&gt; 10 dakika süre ile 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içerisinde. </li><li> 4 at süpernatan ve mağaza çıkarın ° C Bu ch500 bölümüdür. </li></ol> 3. Strep-etiket Arıtma (2 saat) <ol><li> Sitoplazmik fraksiyon (150 mM NaCl nihai konsantrasyon) ile 5 M NaCl 300 ul ekleyin. </li><li> 15 ml konik tüp fraksiyon başına paketlenmiş Strep-Tactin Sepharose boncuk kısım 100 ul. </li><li> Karıştırmak ve bir masa üstü, 1.000 x g hızında 5 dakika santrifüj tüpü, invert boncuklara Strep yıkama tamponu ile 10 hacim (20 mM Hepes pH 7.9, 150 mM NaCl (ch500 numuneler için 500 mM NaCl), 1 mM EDTA) ekleyin santrifüj. </li><li> , Süpernatant atın iki kez adımı 3.3 tekrarlayın ve sonra Strep yıkama tamponu eşit hacmi boncuk pelletini. </li><li> Her bir fraksiyon (nuceloplasmic için 1.5 ml&#39;lik tüplere mikrosantrifüj, ch150 ve ch500 fraksiyonlar ve sitoplazmik fraksiyon için bir 15 ml konik tüpe) ile yıkanmış, Strep-Tactin boncuk bulamacın 200 ul ekleyin. </li><li> Döndürmek4 at tüpleri 1s ° dönen bir tekerlek üzerinde C. </li><li> Tüpler 4 az 1000 x g&#39;de 1 dk ° C&#39;de santrifüje Süpernatant atın. </li><li> Her tüpe 1 ml soğuk Strep yıkama tamponu ekleyin. 15 ml tüp (sitoplazmik fraksiyonu) 1.5 ml tüp boncuk aktarın. 4 de, tüm tüpler 1 dk ° C, adım 3,7 gibi sonra santrifüj yıkanır. Iki kez bu yıkama işlemi tekrarlayın. </li><li> Son yıkama adımdan sonra, düz bir pipet kullanarak yıkama tamponu tüm izlerini silmek. 100 ul yıkama tamponu (Strep yıkama tamponu 2.5 mM desthiobiotin içeren) ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> Buz üzerinde 15 dk inkübe edin. Yavaşça tüplerin alt dokunarak bazen boncuk karıştırın. </li><li> Santrifüj tüpünde 4 az 1000 x g&#39;de 1 dk ° C de mikrosantrifüj. Süpernatant içeren Yıkanan Strep-etiketli vRNPs toplayın. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Fraksiyonasyon etkinliğinin en antib kullanılarak parçalandı lizatlarının Western blot analizi ile karar verilirSubselüler belirteçler (Şekil 2) için belirli bir odies. Spesifik olarak, başarılı bir çekirdek içi fraksiyonasyon nucleoplasmic içinde çok az veya hiç hücresel RNA polimeraz II (Pol II), ya da çözünebilen Nükleer fraksiyonu 4, ve en çok 150 mM NaCl 5 ile ekstre edilmelidir göstermelidir. Pol II&#39;nin bir dejenerasyonu da tekrarlanabilir literatürde 6 ile tutarlıdır enfekte olmamış hücrelere, kıyasla influenza virüs ile enfekte olmuş hücrelerin içinde gözlenmiştir. Şekil bir sitoplazmik eluat için gösterildiği gibi vRNPs saflaştırılması iyi, gümüş veya Coomassie boyama tarafından değerlendirilecektir. 3. Bizim deneyimlerimize göre, en Strep-PB2 tam şekillendirilmiş vRNP bir parçası olarak, yani biraz çözünür polimeraz yakalanır arınmışsa. Gümüş veya Coomassie boyama tarafından gözlemlenen PA/PB1/PB2 oranı: Bu yüksek NP yansır. Birkaç yerde RNases (örneğin, RNaz A gibi) dissosiyatif olarak böyle bir şekilde çatlatma viral RNA&#39;nın bilinmektedir olarak daha düşük bir oran, RNases ile tampon kirlenme anlaşılacağıNP multimerleri 7 polimeraz yedik. İlginçtir, sadece Benzonase tedavisi, viral RNA sindirmek için yeterli iken, vRNP proteinlerin stokiyometrik oranları üzerinde hiçbir etkiye sahip olduğu görülmektedir. Bu fenomeni açıklamak değil de, biz bu Benzonase düşündüren diğer RNases (veriler gösterilmemiştir) ile sindirim sonrası vRNPs bozulması bazı önemli yapısal RNA bölgeleri bozulmadan bırakabilir gözlenmiştir. Sitoplazma ve nükleoplazmanın (nükleaz sindirim yapılmadan) gelen vRNPs saflaştırılması sonra, yüksek molekül ağırlıkları az 8 sönük ama farklı bantlar 8 grip genom segment tahmin molekül ağırlıkları karşılık gümüş boyama, (ref bakın. 3 ile takip edilebilir ). 9 saat, enfeksiyondan sonraki her fraksiyonda arındırılan vRNPs nispi miktarları Şekil &#39;de gösterilmiştir. 4. VRNPs dağılımı erken zaman noktalarında ch150 fraksiyonunda güçlü birikimi ile, enfeksiyon boyunca değişir veGeç zaman noktalarında nükleoplazmanın ve sitoplazma artmış birikimi. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Subselüler fraksiyonlama Şekil 1. Akış çizelgesi. Ref uyarlanmıştır. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Influenza virüsü ile enfekte hücrelerden Subselüler fraksiyonları Western blot analizi. 10 9 HeLa hücrelerinde hücre içi fraksiyon önce 9 saat influenza virüs suşu WSN ile enfekte edildi. Toplam protein Eşit miktarlarda her kulvarın yüklenen ve gösterilen antikorlar kullanılarak analiz edildi. RNA polimeraz II (Pol II) C-terminal alanı (hypophosphorylated bandı en önemli olduğu), her türlü tanır klonu 8WG16 kullanılarak tespit edildi. Ref uyarlanmıştır. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3.VRNPs saf gümüş leke analizi. HeLa hücreleri RWSN (negatif kontrol olarak) veya sitoplazmik fraksiyondan Strep saflaştırma takiben 9 saat boyunca RWSN-PB2-Strep ile enfekte edilmiştir. Asterisk RNaz sindirim sonra görünmez bantları ifade eder. Ref uyarlanmıştır. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. Farklı hücresel fraksiyonları arınmış vRNPs Gümüş leke analizi. 10 9 HeLa hücrelerinde 9 RWSN PB2-Strep veya RWSN ile enfekte olan h Subselüler fraksiyon ve Strep arıtma izledi. Her fraksiyonu eluat Eşit miktarlarda yüklendi. Ref uyarlanmıştır. 3.

<ol><li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li>
<li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329(2005).</li>
<li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187(2011).</li>
<li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell%3A+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li>
<li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460(2009).</li>
<li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li>
<li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427(2010).</li>
<li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li>
<li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma%2C+MOPC+315%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889(1974).</li>
<li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30(2010).</li>
<li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618(2011).</li>
<li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879(2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Birçok çalışmada son zamanlarda bireysel protein ya da grip virüsü enfeksiyonu 8 katılan hücresel ağları tespit ederken, bu etkileşimlerin çoğunluğunun fonksiyonel önemi belirsizdir. Grip virüsü RNA sentezi ve çekirdeğinde 9 karmaşık biofiziksel ve biyokimyasal doğaya kromatin bazlı fonksiyonların mutlak bağımlılığı göz önüne alındığında, yeni teknikler bu fonksiyonları aydınlatmak için gerekli olacaktır. VRNPs bir afinite saflaştırma ile birleştiğinde biz burada mevcut çekirdek içi fraksiyon, daha...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM-yüksek glukoz </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü Mix G </td><td> Serva </td><td> 39101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nükleaz </td><td> Novagen </td><td> 71206 </td><td> 25 U / ml </td></tr><tr><td> DNaz I, RNaz-free </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U / ml </td></tr><tr><td> Homojenizatör Dounce </td><td> Wheaton </td><td> 432-1271 </td><td> &quot;B&quot; havaneli yazın kullanın </td></tr><tr><td> Strep-Tactin Sepharose </td><td> IBA GmbH </td><td> 2-1201-025 </td><td> % 50 süspansiyon sütun biçiminde de kullanılabilir </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBAGmbH </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

enfekte hücre kromatin gelen gribi ribonükleoprotein komplekslerinin affinity arıtma

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Tüm negatif dallı RNA virüsleri gibi, influenza virüs genomu tek zincirli genom nükleoprotein (NP) tarafından kapsül içine, ve oluşan trimeric polimeraz kompleksi ile ilişkili olduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNP), formunda paketlenmiş PA, PB1 ve PB2 alt birimlerinin. Bununla birlikte, çoğu RNA virüslerinin aksine, influenza virüs enfekte olmuş hücreler, çekirdeklerinde viral RNA&#39;nın sentezi gerçekleştirmek. İlginçtir, viral mRNA sentezi primer olarak hücresel öncesi mRNA&#39;ların kullanır ve bu süreç kromatin 1 gerçekleşir ileri sürülmektedir. Viral polimeraz ve konak RNA polimeraz II yanı sıra, NP ve ev sahibi arasındaki nükleozom arasındaki etkileşimlerin da 1,2 karakterize edilmiştir. Yakın zamanda, bir tek Strep-Tag kodlayan rekombinant influenza virüsünün üretimi genetik olarak viral polimeraz PB2 alt biriminin C-terminali (RWSN-PB2-Strep 3) kadar olan kaynaşmıştr nitelendirdi. Bu rekombinant virüsler enfekte olmuş hücreler arası vRNPs dahil olmak üzere PB2-içeren kompleksleri, bir saflaştırma izin verir. VRNPs saflaştırılmış elde etmek için, enfekte hücre kültürleri ve vRNPs bu hücreler elde lizatları arındırılan afinitesi vardır edilir. Ancak, bugüne kadar kullanılan parçalama işlemleri genel bir nükleaz varlığına rağmen, çoğu zaman sadece verimsiz kromatin bağlı materyali çıkarmak, bir adım deterjan lizis dayalı olarak yapılmıştır. Bizim ön çalışma nükleer vRNPs büyük bir kısmı geleneksel bir hücre parçalanması sırasında elde olmadığını düşündürmüştür ve bu nedenle afinite saflaştırılmış olamazdı. Bu ekstraksiyon verimini artırmak için, ve non-kromatin bağlı nükleer vRNPs gelen kromatin-bağlı ayırmak için, biz grip virüsü ile enfekte olmuş hücrelerde bir adım bilge Subselüler çıkarma protokolü uyarlanmıştır. Kısaca, bu prosedür ilk hücreden çekirdek ayırır ve daha sonra eriyen nükleer proteinler (burada &quot;nucleoplasmic&quot; fraksiyon olarak adlandırılır) ayıklar.Kalan çözünmeyen nükleer malzeme ardından Benzonase, iki tuz çıkarımı adımları takip belirsiz bir DNA / RNA nükleaz ile sindirilir: İlk 150 mM NaCl (&quot;ch150&quot; olarak adlandırılır) kullanılarak, daha sonra 500 mM NaCl (&quot;ch500&quot;) (Şekil 1 ). Bu tuz ekstraksiyon adımları 500 mM NaCl henüz hala yakınlık matrisi tagged vRNPs bağlayıcı izin nükleer vRNPs% 85&#39;inden çözünürleştirmek için yeterli olduğu konusunda bizim gözlemlerimize göre seçilmiştir. Enfekte olmuş hücrelerin hücre içi fraksiyonasyon sonra, her bir fraksiyondan afinite purify PB2-etiketli vRNPs mümkündür ve protein ve sırasıyla, Western blot ve astar uzantısı, RNA kullanılarak analiz bileşenler. Son zamanlarda, 500 mM NaCl (ch500) 3 ile ekstrakte kromatin fraksiyonu üzerine enfeksiyon sonrası geç noktaları sırasında bu vRNP ihracat kompleksleri şeklinde keşfetmek için bu yöntem kullanılmıştır.

Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Tüm negatif zincirli RNA virüslerinde olduğu gibi, influenza virüslerinin genomu, ...'nın bulunduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNP) şeklinde paketlenir.

Negatif zincirli RNA virüsleri. İnfluenza virüslerinin genomu, tek zincirli genomun nükleer protein tarafından kapsüllendiği ve PA, PB1 ve PB2 alt birimlerinden oluşan polimeraz kompleksi ile ilişkili olduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri veya VRNP'ler şeklinde paketlenir. Enfekte memeli hücrelerinden bozulmamış kompleksleri saflaştırmak için HeLa hücreleri, rekombinant strept-etiketli influenza virüsü ile inkübe edilir.Virüs hücrelere girdikten sonra, enfeksiyonu takiben çekirdeklerde viral RNA sentezlenir; hücreler bir deterjan kullanılarak parçalanır ve santrifüj ile salt-bazlı kromatin fraksiyonu protokolü kullanılarak sitoplazmik, nükleer ve kromatin fraksiyonlarına ayrılır. Son olarak, strept-etiketli VRP'ler her bir fraksiyondan afinite yöntemiyle saflaştırılır. Saflaştırılmış vRNP'lerin protein ve RNA kompozisyonunun gümüş boyama ile analizi, bu protokolün kullanılmasıyla kromatine sıkıca bağlı VRP'lerin bile bozulmadan izole edilebileceğini göstermektedir. Dolayısıyla, influenza virüsü ribonükleoprotein komplekslerinin afinite ile saflaştırılmasına yönelik standart yöntemlerle karşılaştırıldığında protokolümüzün temel avantajlarından biri, yöntemimiz sayesinde, influ

affinity-purification-influenza-virus-ribonucleoprotein-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Bu makalede, basit, kantitatif, sıvı faz afinitesi yakalama deneyi sunulmuştur. Bu bir yandan, diğer tarafta etiketli protein ve ikinci, etiketli protein (örn. poliovirus) arasındaki yakınlığı manyetik boncuk ve etiketli proteinlerin (örneğin nanobodies) arasındaki etkileşime dayanan güvenilir bir tekniktir.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

Kaynak: Lopez Jr., M. A., et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, nikel afinite kromatografisi kullanılarak polihistidin etiketli viral integrazın saflaştırılmasını göstermektedir. Protokol, integrazı nikel yüklü reçineye olan afinitesine göre seçici olarak izole etmek için imidazol gradyan elüsyonu kullanır.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak Viral İntegrazın Saflaştırılması

Kaynak: Gao, Y., et al. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (2021)Video, saflaştırılmış RNA içermeyen bir nukleoprotein-fosfoprotein kompleksinden virüse özgü nukleokapsidlerin in vitro montajını, boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırılmalarını ve monte edilen partiküller içindeki tam uzunluktaki viral RNA'nın doğrulanmasını göstermektedir.

Viral Nükleokapsid Benzeri Partiküllerin In Vitro Rekonstitüsyonu ve Purifikasyonu

Bu protokol oluşturulması ve vahşi tip ve insan INO80 kromatin yeniden şekillenme kompleks mutant versiyon saflaştırılması için bir yöntem tarif etmektedir. Epitop INO80 alt birimlerinin versiyonları kararlı biçimde HEK293 hücrelerinde ifade edilir ve alt birimlerinin kümelerini yoksun tam kompleksleri kompleksleri ve bağışıklık yakınlık kromatografisi ile etiketlenmiş.

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

Bu ko-immünopresipitasyon protokolü, influenza A virüsü nükleoproteini ile insan hücrelerindeki antiviral Mx1 proteini arasındaki etkileşimi incelemeye izin verir. Protokol, Mx1 ve influenza A virüsü nükleoproteininin başarılı bir şekilde birlikte immünopresipitasyonu için N-etilmaleimidin önemini vurgulamaktadır.

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Adenovirüs (Ad) ile enfekte olmuş insan hücrelerinden viral replikasyon kompartmanlarını (RC) izole etmek için yeni bir strateji sunuyoruz. Bu yaklaşım, viral genom replikasyonunu ve ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaların yanı sıra RC'de kurulan viral-konak etkileşimlerinin düzenlenmesine yardımcı olabilecek hücresiz bir sistemi temsil eder.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Virüsün konak hücrelere girişi sırasında influenza A virüs çekirdeklerinin sökülmesi çok adımlı bir işlemdir. Viral kaplamanın erken aşamalarını analiz etmek için bir in vitro yöntem tarif ediyoruz. Bu yaklaşımda, tanımlanmış koşullar altında kaplamayı başlatan adımları biyokimyasal olarak incelemek için hız gradyan santrifüjlemesi kullanılır.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Öğrenin, enfekte hücrelerin kromatininden viral ribonükleoprotein komplekslerini (VRNP) saflaştırma yöntemini. Bu protokol, influenza virüsü biyolojisini ve viral RNA sentez mekanizmalarını incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Daha fazla video keşfet