Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Lyco negatif iplikçik, RNA virüsleri. İnfluenza virüslerinin genomu, tek sarmallı genomun nükleer protein tarafından kapsüllendiği ve enfekte memeli hücrelerinden bozulmamış kompleksleri saflaştırmak için PA PB bir ve PB iki alt biriminden oluşan zerdeçal polimeraz kompleksi ile ilişkilendirildiği viral kaburga nükleer protein kompleksleri veya VR nps şeklinde paketlenir. Hela hücreleri rekombinant strept işaretli influenza virüsü ile inkübe edilir.

Virüs hücrelere girdikten sonra, viral RNA enfeksiyonu takiben çekirdeklerde sentezlenir, hücreler bir deterjan kullanılarak yalan söyler ve santrifüjleme ve saldırı tabanlı kromatin fraksiyon protokolü kullanılarak sitoplazmik nükleer ve kromatin fraksiyonlarına fraksiyonlanır. Son olarak, strept etiketli VRP'ler, saflaştırılmış VR NPS'nin protein ve RNA bileşiminin her bir fraksiyonundan afinite saflaştırılır ve gümüş boyama ile analiz, bu protokolün sıkı bir şekilde bile kullanılmasıyla kromatine bağlı VRP'lerin izole edilebileceğini göstermektedir. Salim. Bu nedenle, protokolümüzün ana avantajlarından biri, influenza virüsü kaburga nükleer protein komplekslerinin afinite saflaştırılması için standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, yöntemimizi kullanarak, VR NPS'yi enfekte hücrelerin kromatininden saflaştırmanın mümkün olmasıdır, bu da influenza virüsü mRNA sentezi bölgesi olarak bilinir.

Bu nedenle yöntemimiz, örneğin hangi viral veya hücresel faktörlerin yanı sıra, örneğin viral mRNA sentezi veya viral genomik RNA sentezi için hangi translasyon sonrası modifikasyonların gerekli olduğu gibi viral replikasyon ve transkripsiyonun düzenlenmesi ile ilgili soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu nedenle, bu yöntemde yeni olan araştırmacılar bazı zorluklarla karşılaşabilirler çünkü alt nükleer fraksiyonlama biyokimyasal koşullara çok duyarlıdır ve farklı hücre hatları arasında da büyük farklılıklar gösterebilir. Bu protokole influenza virüsü ile enfekte olmuş hücrelerimizi iyileştirmekle başlayın, RWSN PB iki strep, genetik olarak PB iki alt biriminin C terminaline üç enfeksiyon çokluğunda kaynaşmış bir strep etiketine sahiptir.

Hücreleri bir kez soğuk PBS ile yıkayın, ardından 12 mililitre soğuk PBS ekleyin ve bunları tabaktan çıkarın. Lastik kazıyıcı kullanarak. Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve santrifüjleme ile peletleyin.

Bu prosedürün en zor yönü hücre fraksiyonlama protokolüdür. Hücre çekirdekleri homojenizasyon ve karıştırma prosedürlerine karşı çok hassastır ve yanlış yapılırsa kromatin ekstraktını kolayca bozabilir. Bu nedenle, sadece homojenizasyon tekniklerini değil, aynı zamanda burada gösterdiğimiz gibi lizatların genel kullanımını da takip etmek çok önemlidir.

Spin aspiratını takiben, PBS ve Resus, hücre peletini 10 mililitre soğuk sükroz tamponu içinde askıya alır. 200 mikrolitrelik bir pipet ucunu 10 mililitrelik bir plastik serum pipetine takın ve hücre kümelerini parçalamak için hücreleri içinden geçirin. Süspansiyonu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.

Hücreleri yeniden askıya almak için periyodik olarak nazikçe ters çevirin. Daha sonra,% 0.5'lik bir nihai konsantrasyona IET olmayan P 40 ekleyin ve 15 saniye boyunca yüksek hızda girdap, hemen bir masa üstü santrifüjde dört santigrat derecede 3, 500 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin. Sıkma işleminden sonra, supinatı çıkarın ve 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.

Supinatı dört santigrat derecede saklayın. Bu bir sitoplazmik fraksiyondur. Pelet, burada gösterildiği gibi orijinal hücre peletinden daha küçük ve daha beyaz olmalıdır.

Protokol daha sonra tamamlanacaksa, hücre peletini dört santigrat derecede saklayın. Aksi takdirde, peleti daha önce olduğu gibi beş mililitre soğuk sakaroz, tampon ve santrifüjde yıkayarak devam edin. Döndürme tamamlandıktan sonra, supinatı atın ve çekirdekleri 1.5 mililitre soğuk nükleer plazmik ekstraksiyon tamponunda içeren peleti yeniden süspanse edin.

Yeniden süspanse edilmiş peleti, sıkıca oturan bir havaneli ile soğutulmuş, tamamen cam dört mililitrelik dans homojenizatörüne aktarın ve çekirdekleri 20 vuruşla homojenize edin. Köpürmeyi önleyerek, direnç yaklaşık 10 vuruştan sonra artmalıdır. Verimli homojenizasyonu doğrulamak için numuneyi bir faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.

Çekirdekler artık yuvarlak olmamalı, düzensiz formlara sahip olmalı ve patlamış gibi görünmelidir. Çekirdekler homojenize edildikten sonra, bunları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Homojenatı dönen bir tekerlek üzerinde dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra dört santigrat derecede 10 dakika boyunca bir mikro santrifüjde 16.000 kez G'de santrifüjleyin. Spinden sonra, nükleer plazmik fraksiyon olan supinatı 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede saklayın. Daha sonra Reese peleti 1.5 mililitre sindirimde askıya alır, 37 santigrat dereceye kadar tampon ön ısıtın.

Daha sonra fraksiyonu 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, nihai sodyum klorür konsantrasyonunu 150 milimolar'a getirmek için 42 mikrolitre beş molar sodyum klorür ekleyin, ardından buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. 16.000 kez santrifüjleyin, G 10 dakika boyunca dört santigrat derece mikro santrifüjde.

Döndürdükten sonra sırtı çıkarın ve dört santigrat derecede saklayın. Bu CH bir 50 kesridir. Reeses peleti 1,5 mililitre soğuk yüksek tuz tamponunda büker ve buz üzerinde 20 dakika inkübe eder.

16.000 kez santrifüjleyin, G 10 dakika boyunca dört santigrat derecede bir mikro santrifüjde. Sıkma işleminden sonra, takviyeyi çıkarın ve dört santigrat derecede saklayın. Bu CH 500 fraksiyonudur.

Fraksiyonlama protokolü sırasında kaydedilen fraksiyonları çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra sitoplazmik fraksiyona 300 mikrolitre beş molar sodyum klorür ekleyin. Daha sonra 100 mikrolitre paketlenmiş strep T'yi her fraksiyon için Sphero boncuklar halinde 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Boncuklara 10 hacim strep yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmak için tüpü ters çevirin ve 1000 kez beş dakika santrifüjleyin. G bir masa üstü santrifüjde, sna'yı atın.

Tampon yıkamayı iki kez tekrarlayın ve ardından Reese peleti eşit hacimde strep yıkama tamponunda bükün, 200 mikrolitre yıkanmış strep ekleyin Her fraksiyona boncuk bulamacı içinde hareket edin. Tüpleri dört santigrat derecede bir saat döndürün. Daha sonra tüpleri dört santigrat derecenin 1000 katı G'de bir dakika santrifüjleyin, supinatı atın.

Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte sitoplazmik fraksiyon ile inkübe edilen boncuklar için boncuklara bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Yıkama tamponunu ekleyin ve boncukları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Boncukları bir dakika yıkayın, ardından tüpleri dört santigrat derecede 1000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin.

Son yıkama adımından sonra iki kez tekrarlayın. Düz bir pipet ucu kullanarak yıkama tamponundaki tüm kalıntıları temizleyin. Daha sonra 100 mikrolitre elucian tamponu ekleyin ve tüpleri yavaşça karıştırın ve 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Kuluçka sırasında, ara sıra tüplerin dibine hafifçe vurarak boncukları karıştırın. 15 dakika geçtikten sonra, dört santigrat derecede 1000 kez G'de bir dakika seçmek için santrifüj edin. Ayrıştırılmış strep etiketli VRP'leri içeren Senna'yı toplayın.

Hücrelerimize dokuz saat boyunca influenza virüsü suşu, WSN ile enfekte edildi ve fraksiyone lizatlar burada gösterildiği gibi batı çiçeklenmesi ile analiz edildi. Nazik nükleer izolasyon, bol miktarda nükleer proteinin salınmasını önlerken, tübülin gibi sitoplazmik proteinleri verimli bir şekilde çıkarır. Düşük tuzla ekstrakte edilen kromatin fraksiyonunun, transkripsiyon için önemli olan proteinler açısından zenginleştirildiğine dikkat edin.

Yüksek tuz fraksiyonu, ayrıştırılmış sitoplazmik fraksiyonun protein bileşimini belirlemek için esas olarak nükleozomlar içerirken, etiketlenmemiş virüs, RWSN veya RWSN PB ile dokuz saat boyunca enfekte olmuş R hücrelerinden V NPS, bir sitoplazmik elüat için gösterildiği gibi gümüş boyama ile analiz edildi. Burada, 95 ila 100 kilodalton arasındaki bantlara kıyasla 55 kilodaltonun üzerindeki ana bant tarafından kanıtlandığı gibi, NP'nin PA PB bir, PB iki'ye yüksek bir oranı vardır, bu da çoğu strep PB iki'nin tam olarak oluşturulmuş bir VRNP'nin parçası olarak saflaştırıldığını veya başka bir deyişle, nispi verimleri karşılaştırmak için çok az çözünür polimeraz yakalanır. RWSN PB ile dokuz saatlik enfeksiyonun ardından saflaştırılan VR NPS, iki strep veya RWSN veya bu gümüş lekede gösterildiği gibi gümüş lekeli jel v RMP'ler, dokuz saatlik enfeksiyondan sonra dört hücresel fraksiyonun hepsinden saflaştırılabilir.

V RMP'lerin en yüksek konsantrasyonu nükleer plazmada bulunur, ancak büyük kısımlar sitoplazma ve kromatinden de saflaştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, enfekte olmuş hücrelerin çekirdeğinden yüksek miktarda bozulmamış influenza virüsü ribonükleoprotein komplekslerinin nasıl saflaştırılacağını iyi anlamalısınız. Bu prosedürü gerçekleştirirken, temiz tamponlar kullanmayı unutmamak ve numuneleri gereksiz yere oda sıcaklığına maruz bırakmaktan kaçınmak önemlidir, çünkü bu şekilde hem RNA hem de protein bozulmasını önleyebilir ve protein kompleksinin parçalanmasını önleyebilirsiniz.

Ve bulaşıcı bir grip virüsü ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Tüm adımlar, lizatlara NP 40 eklenene kadar biyogüvenlik seviyesi iki tezgah altında gerçekleştirilmelidir.