Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Bu prosedürün amacı, heca oluşumuna dayanan iki yöntem kullanarak, herhangi bir hücre hattında hepatit C virüsü replikasyon döngüsünün tamamlanması üzerindeki kısıtlama faktörlerinin etkisini incelemektir; ilk yöntem için insan karaciğer hücrelerinin yanı sıra heal A ve Hep 56 1D paketleme hücrelerini kültüre ederek başlayın; ardından hepatit C virüsünü veya H-C-V-R-N-A'yı elektroporasyon yoluyla karaciğer hücrelerine transfekte edin. Sonrasında, ikinci füzyon yönteminde polietilen glikol kullanarak HCV replike eden hücre hattını ilgili paketleme hücre hattı ile füzyonlayın. İlk adım, yüksek titreli HCV stokunun üretilmesidir.

Ardından farklı hücre hatları birlikte kültüre edilir ve prototip köpüklü virüs glikoproteininin transfeksiyonu ile hücre füzyonu indüklenir. Daha sonra, heterokaryonlar HCV ile enfekte edilir. Heterokaryon oluşumunun her iki yöntemi takiben, füzyonu onaylamak için floresan mikroskopi uygulanır ve enfektiyöz partikül üretimi kantifiye edilir.

Bu tekniğin temel avantajı, HV'ye özgü baskın restriksiyon faktörlerinin ekspresyonu açısından çok sayıda hücre hattı ve primer hücre panelinin taranmasında kullanışlı olmasıdır. Bu yöntem, HCV'nin tür özgüllüğü ve normları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Polietilen glikol ile hücre füzyonunun indüklenmesinden önce, iki füzyon sisteminin temel kavramlarının anlaşılmasını kolaylaştırmak için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

HUH 7.5 hücreleri, standart protokollere uygun olarak H-C-V-R-N-A ile transfekte edilir ve ertesi gün 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca kültüre edilir. Subgenomik replikon taşıyan transfekte HUH 7.5 hücrelerinin yanı sıra heal R ve he 56 1D paketleme hücrelerini hasat edin. Bu paketleme hücreleri; core, E1, E2, P7 ve NS2 HCV proteinlerini ektopik olarak eksprese edecek şekilde mühendislikten geçirilmiştir. Tripsinizasyondan sonra hücreleri DMEM komple medyum içinde süspanse edin ve hücre süspansiyonlarını şu konsantrasyonlara seyreltin: HUH 7.5 hücreleri 5 × 10⁵ hücre/mL ve heal ile hep 56 1D hücreleri 2 × 10⁵ hücre/mL.

Ardından, her kuyucukta iki ila üç adet steril cam lameli bulunan altı kuyucuklu bir kültür plağı hazırlayın. Füzyon verimliliğinin daha ayrıntılı analizi için, bir mililitre transfekte edilmiş HUH 7.5 hücresini bir mililitre paketleme hücresiyle birleştirin ve altı kuyucuklu plağın bir kuyucuğuna ekleyin; 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra hücre yoğunluğunu kontrol edin.

Hücre membranlarının kaynaşabilmesi için hücrelerin birbirine yakın olması gerektiğinden, hücre füzyonu indüksiyonundan önce hücre yoğunluğu %60 ile %80 konfluens arasında olmalıdır; ko-kültür hücrelerinden medyumu aspire edin ve bir mililitre PBS ile bir kez yıkayın. Ardından, önceden ısıtılmış 500 mikrolitre %40 polietilen glikol veya PEG 1,500'ü dikkatlice ekleyin. Kontrol olarak, ko-kültür hücrelerinin bulunduğu başka bir kuyucuğa 500 mikrolitre PBS ekleyin; heterokaryon oluşumunu indüklemek için 37 °C'de beş dakika inkübe edin; PEG'i aspire edin ve dikkatlice iki mililitre PBS ekleyin; bir dakika sonra PBS'i aspire edin ve iki mililitre taze PBS ekleyin; fazla PEG'i uzaklaştırmak için her yıkama bir dakika sürecek şekilde PBS ile 3 ila 5 kez yıkayın.

Son olarak, her kuyucuğa iki mililitre tamamlanmış DMEM besiyeri ekleyin ve 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında 48 saat boyunca inkübe edin. Füzyondan 48 saat sonra, her bir SNAT'ı toplayın ve 0.45 mikronluk bir filtreden süzün; hücre kültürü SNAT'ları toplandıktan sonra füzyon verimliliği immünofloresan yöntemle belirlenebilir; cam lamellerin bulunduğu kuyucukları bir mililitre PBS ile bir dakika boyunca bir kez yıkayın.

Hücreleri, PBS içinde %3 paraldehit ile 15 dakika boyunca 600 µL miktarında fiksasyon işlemine tabi tutun. Son yıkama sonrası, her biri birer dakika sürecek şekilde PBS ile üç kez yıkayın. Lamel camlarını bir 24 kuyucuklu plakaya dikkatlice aktarmak için pens kullanın; hücreleri geçirgen hale getirmek için PBS içinde %0,5 Triton X 100 ile beş dakika boyunca 500 µL uygulayın.

Ardından üç kez PBS ile yıkayın ve her bir kuyucuğa 250 µL primer antikor çözeltisi uygulayın. Konsantrasyonu 0,5 µg/mL olan anti NS5A antikoru ve konsantrasyonu 6,4 ng/mL olan insan monoklonal anti E2 antikoru kullanın. Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin; 45 dakika sonra üç kez PBS ile yıkayın.

Ardından, her kuyucuğa 250 µL sekonder antikor ekleyin; Alexa Fluor 546 veya Alexa Fluor 488 ile konjuge edilmiş, 2 µg/mL konsantrasyonunda sekonder keçi anti-fare veya keçi anti-insan IgG spesifik antikorlar kullanılır. Oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, PBS ile bir kez yıkayın.

Ardından, hücre çekirdeklerini PBS içinde 1/3000 oranında seyreltilmiş 250 µL DPI ile boyayın. Oda sıcaklığında, karanlıkta bir dakika inkübe edin; dört kez PBS ile ve bir kez su ile yıkayın. Son olarak, lamelleri bir mikroskop lamı üzerindeki bir damla flora mount üzerine ters şekilde yerleştirin ve karanlıkta kurumaya bırakın.

Bu prosedüre başlamak için aşağıdaki hücrelerin tek hücre süspansiyonlarını toplayın ve hazırlayın. Endojen CD 81 ekspresyonu bulunmayan Luna NA insan karaciğer hücre hattı. HER paketleme hücreleri ve insan CD 81'ini stabil olarak eksprese eden Hep 56 1D hücreleri. Luna n hücrelerini, HER hücreleri ile bir bire bir ve Hep 56 1D hCD 81 hücreleri ile bir bire iki oranında birlikte kültüre ederek, 12'li kuyucuk başına toplam 1,5 × 10⁵ hücre yoğunluğu elde edin.

Kuyucukları ertesi güne kadar 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat inkübe edin. Hücrelere, üretici talimatlarına uygun olarak Lipofectamine 2000 kullanarak yüksek FU genik PFE zarf proteini ile geçici transfeksiyon yapın. PFE glikoprotein transfeksiyonundan 30 saat sonra, heterokültürleri önceden hazırlanmış virüs stokundan yaklaşık 2,3 MOI değerinde 350 µL ile inoküle edin.

Ertesi sabah, 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 12 saat boyunca inkübe edin. Bir kez PBS ile yıkayın ve her kuyucuğa bir mililitre DMEM komple medium ekleyerek 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 48 saat boyunca inkübe edin. 48 saat sonra, heterokaryon kültürlerinin süpernatanını toplayın ve süpernatanı 0,45 mikronluk bir filtreden süzün. Ardından, bir gün önce sınırlayıcı dilüsyon analizi için 96 kuyucuklu plakalara ekilmiş olan HUH 7.5 hücrelerini inoküle etmek için süpernatanı kullanın; enfeksiyöz progeni partiküllerinin üretimini miktarlandırmadan önce 72 saat boyunca inkübe edin.

füzyon olaylarını görüntüleme prosedürü, ekimden önce tamamlanmalıdır. Ko-kültür hücrelerini bir kez 5 mL PBS ile yıkayın ve ardından her 10 cm'lik petri kabına 4 mL uygun DI solüsyonu ekleyin; hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında 45 dakika inkube edin. Hücreleri bir dakika boyunca 5 mL PBS ile bir kez yıkayın ve ardından DMEM komple medyum ekleyin; ekimden önce 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında altı saat inkube edin. 12 kuyucuklu plakanın her kuyucuğuna bir lam yerleştirin, ardından hücreleri ekin ve daha önce gösterildiği gibi transfekte edip boyayın. Transfeksiyondan 30 saat sonra hücreleri bir dakika boyunca 1 mL PBS ile dikkatlice yıkayın ve ardından hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 250 µL %3 par Formaldehit ile fikse edin.

Hücreleri bir dakika boyunca bir mililitre PBS ile bir kez yıkayın ve ardından hücreleri bir kez PBS ile ve bir kez su ile yıkadıktan sonra bir dakika boyunca dappy ile boyayın; örtü lamları, güneş gözlükleri ve lamları yerleştirin. HCV replikasyon döngüsünün tamamlanması üzerinde kısıtlama faktörlerinin etkisini incelemek için kullanılan ilk yaklaşımda, heterokaronlarda HUH 7.5 hücreleri önce lusiferaz transgeni ile HCV yapısal olmayan proteinlerini eksprese eden subgenomik bir replikonla geçici olarak transfekte edilmiş, ardından HCV yapısal proteinleri core ve yardımcı proteinleri eksprese eden hücre hatları ile birlikte kültüre edilmiş ve bunlarınla füzyonu sağlanmıştır. Temsili bir sonuç bu şekilde gösterilmiştir; hücreler E2 yapısal proteini ve NS5A yapısal olmayan proteini karşıtı monoklonal antikorlar kullanılarak immünoboyama ile işaretlenmiştir.

Üst panellerdeki görüntüler, PEG ile işlem yapıldığında hem MS five A hem de D two sinyallerinin aynı sitoplazmada eş zamanlı olarak tespit edildiğini ve bunun da kendi kendine füzyona (self-fusion) işaret ettiğini göstermektedir. Buna karşılık, alt paneller, ko-kültür hücreleri PBS ile işlem gördüğünde herhangi bir füzyonun tetiklenmediğini göstermektedir. Bu nedenle, sinyallerin kolokalizasyonu gözlemlenmemiştir; hetero karonlardan üretilen viral enfektiviteyi nicelleştirmek için füzyon indüksiyonundan 48 saat sonra ko-kültürlerden örnekler toplanmış ve sonraki lüsiferaz analizleri için naif HUH 7.5 hücrelerini inoküle etmek amacıyla kullanılmıştır.

Bu grafikte, üç bağımsız deneyin ortalama değerleri gösterilmektedir. Gri yatay çubuk, enfekte edilmemiş HUH 7.5 hücrelerinde belirlenen bağıl ışık birimleri veya RLU için arka planı temsil etmektedir. Özellikle, HUH 7.5 replikant hücreler ya naif hücre hatlarıyla füzyon edildiğinde ya da kontrol olarak PBS ile muamele edildiğinde, kültür sıvılarında herhangi bir enfektivite saptanmamıştır.

Buna karşın, HUH 7.5 replikon ve paketleme hücre hatları arasındaki hücre füzyonu PEG ile indüklendiğinde, kültür sıvılarına enfeksiyöz viral partiküller salınmıştır. Bu durum, virüs üretiminin hücre füzyonuna ve paketleme hücre hatlarında viral proteinlerin ekspresyonuna ihtiyaç duyduğunu göstermektedir; dikkat çekici bir şekilde, sadece HUH 7.5 insan hepatoma hücrelerinin heterokaryonları değil, aynı zamanda insan karaciğer dışı hücreleri ve fare karaciğer hücreleri ile oluşturulan heterokaryonlar da virüs salınımına izin vermiştir; bu da birleştirme ve salınımın, bu hücre tiplerindeki olası restriksiyon faktörleri tarafından baskın bir şekilde inhibe edilmediğini göstermektedir. Alternatif bir yaklaşımda, hücrelerin kültürlenmesinin ardından genik bir glikoproteinin ekspresyonu ile somatik hücre füzyonu indüklenmiştir.

Hetero karyonlar, ko-kültür ve transfeksiyondan önce ayrı hücre hatlarının hücre takip boyalarıyla boyanmasıyla görselleştirilmiştir; genik protein hücreleri transfeksiyondan 30 saat sonra fikse edilmiş ve DPI ile boyanmıştır ve temsili bir sonuç bu şekilde gösterilmiştir. İki hücre tipinin füzyonu, burada örneklendiği gibi, sitoplazma içinde homojen dağılımlı boyalar içeren bir hetero karyon ile belirtilir. Buna karşılık, alt paneldeki görüntüler, hücre füzyonunun olmadığını gösteren çift boyalı sitoplazmaya sahip hücrelerin yokluğunu göstermektedir.

Bu son grafik, tüm HCV giriş faktörlerinin yalnızca HeLa veya insan CD 81 eksprese eden Hep 56 1D hücreleri ile birlikte Luna N hücrelerinin hetero taşıyıcılarında eksprese edildiğini göstermektedir. Burada kültürler, enfeksiyöz HCV partikülleri ile inoküle edilmiştir. Kültür sıvıları 48 saat sonra toplanmış ve hetero taşıyıcılardan de novo partikül salınımı, naif HUH 7.5 hedef hücreleri kullanılarak sınırlandırma dilüsyon testi ile belirlenmiştir; üç bağımsız deneyin ortalama değerleri gösterilmektedir ve gri yatay çubuk testin saptama sınırını temsil etmektedir.

Kontrol olarak, lunar N hücreleri lunar N hücreleri ile kaynaştırılmış olup bu işlem, saptama sınırına yakın çok düşük düzeylerde enfeksiyöz HCV ile sonuçlanmıştır. Benzer sonuçlar, lunar N hücreleri naive HEP 56 1D hücreleri ile kaynaştırıldığında elde edilmiştir. Her iki durumda da insan CD 81 yoktu, bu nedenle HCV heterokaryonları üretken bir şekilde enfekte edememiştir.

Buna karşılık, lunar 10 hücrelerinde ve insan CD 81 eksprese eden HEP 56 1D hücreleri ile füzyonlanmış lunar hand hücrelerinde, analiz arka planının yaklaşık on katı üzerinde de novo enfektif viral progeny üretimi gözlemlenmiştir. Bu durum, HCV'nin RetroCars'larda replikasyon döngüsünü başarıyla tamamladığını göstermekte, dolayısıyla bu hücre hatlarında baskın restriksiyon faktörlerinin ekspresyonu olasılığını dışlamaktadır. Uzmanlaşıldığında, deneysel prosedürün tamamı uygun şekilde yürütülürse bir hafta içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, olası HV restriksiyon faktörlerinin tanımlanması için hetero kariyonların nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Hepatit C virüsü ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken yüksek biyogüvenlik gibi önlemlerin her zaman dikkate alınması gerektiğini unutmayın.