Name: Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Keşfedin, insan göbek kordonu ven endotel hücreleri izolasyonu ve akış koşullarında nötrofil transmigrasyonunu inceleme yöntemini. Canlı hücre görüntüleme ile inflamatuar yanıt mekanizmalarını araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onu teknik yardım için Bayan Lailey;; ve insan kordon sağlamak için Calgary, AB içinde Foothills Hastanesi&#39;nde 51 birim Biz Dr Pina Colarusso görüntüleme ve görüntü analizi ile yardım için Canlı Hücre Görüntüleme Tesis teşekkür ederim. Dr KD Patel bir Alberta yenilikler yaratır şudur: Sağlık Çözümleri Scientist. Bu çalışma, Yenilikçilik ve Alberta Bilim ve Araştırma Kurumu için Kanada Vakfı Sağlık Araştırma ve altyapı ve ekipman hibeleri için Kanada Enstitüleri bir işletme hibesi tarafından desteklenmiştir.

1. İnsan Vasküler Endotelyal Hücre İzolasyonu ve Bakım <ol><li> Insan kan ve doku çalışırken Düzey 2 biyogüvenlik prosedürleri kullanılmalıdır. Kullanımı makas plasenta kablosunu kesip sonra yakından kan pıhtılaşması ve doğum sırasında kordon sıkma kaynaklanan zararlar için kordon inceleyin. Kes ve kordon bu kısımlarını atın. </li><li> 50 mg Kollajenaz içeren bir tüp içine sıcak kord tampon 50 ml dökülerek 1 mg / ml taze kollajenaz çözeltisi hazırlayın. </li><li> Steril eldiven içine değiştirin ve sterilize künt kanüller, kordon kelepçeler, makas, üç yollu dur-musluklar ve laminer akış kaputu gazlı bez içeren bir otoklavlanmış alet tepsisine açın. </li><li> Iki arter ve kablosunu tek ven mevcut tanımlayın. Arterler küçük ve büyük damar ve kanüle kolay iken, sıkı dar olma eğilimindedir. Damardan kan temizlemek için hafifçe bağlı iki yollu bir kanül takın ipozisyonda sıkıca tutmak için kanül etrafında mengene ven ve yer nGoogle&#39;a bir ucunu. Ven yoluyla kablosunu tampon serpmek. Akış netleşene kadar tekrarlayın ve sonra kablosunun ucunu kelepçe. </li><li> Damar içine yayma kollajenaz, musluk kapatın, 10 dakika boyunca ılık kablosu tampon ve inkübe içeren bir behere kablosunu yerleştirin. 10 dakika sonra, kordon kaldırın ve yavaşça ven lümeni gelen endotel hücreleri gevşetmek için kordon masaj yapın. Endotel hücre ortam (ECM) içeren tüp içine akmasını çözeltisi. Iki kez kalan hücreleri çıkarmak için kordon tampon ile yıkayın. Aynı tüpe çözüm boşaltın. </li><li> Pelet 10 dakika endotel hücreleri için 350 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve pelet için ECM 10 ml ekleyin. Yavaşça ECM içinde tekrar süspansiyon hücreleri, daha sonra% 0.2 jelatin ile önceden kaplanmış bir şişeye T75 hücre transfer. Jelatin ile ön-kaplama 37 ° C&#39;de en az 1 saat süreyle yapılmıştır 37 de hücrelerin büyümesine ve 5 ° C% 2 CO. </li><li> Ertesi gün, yavaşça herhangi bir kırmızı kan hücreleri daha sonra süpernatant kaldırmak ve sıcak Hank&#39;in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın çıkarmak için şişeyi sallayın. HBSS çıkartın ve ılık ECM 10 ml ile hücreleri besler. Kırmızı kan hücreleri çıkarıldı emin olmak için, hücreleri mikroskopta inceleyin. Endotel hücreleri birleştiği ve morfoloji derecesini değerlendirin. Bu aşamada endotel hücreleri vakuollerinin belirtisi uzamış olmalıdır. </li><li> Hücreler 1 mM EDTA içeren tripsin bir% 0.08 çözümünü kullanarak konfluense, sonra bölmek hücreleri ulaşana kadar üç günde ortamı değiştirmek için devam edin. İstediğiniz yemekleri Plaka endotel hücreleri% 0.2 jelatin ile önceden kaplanmıştır. Hücreler 3-6 gün izdiham ulaşmalıdır. </li><li> % 0,2 jelatin ile her odası ibidi odaları, ön kat kullanırken. Kaldırmak aşırı 1,5 X haznesine ECM içinde süspansiyon endotel hücreleri 10 6 / ml ilave sonra jelatin ve fibronektin ve. Her gün medya değiştirin c kadaronfluent. Hücreler kord bağlı olarak 2-3 gün konfluent olmalıdır. </li></ol> 2. Nötrofiller hazırlanması <ol><li> Nötrofiller yoğunluğu santrifüj kullanılarak sağlıklı gönüllü insanların periferik kandan izole edilmiştir. Nötrofil izolasyonu için görsel bir gösteri ile ayrıntılı bir protokol, bu derginin 6 önceki sayısında bulunabilir. % 0.5 &#39;i, insan albumin içeren HBSS içinde 1x10 6 / mL&#39; lik bir konsantrasyonda bir kez izole, Pastör pipetiyle nötrofiller. </li></ol> 3. Ibidi Odası ayarlama <ol><li> Bir jelatin kaplı ibidi odasında endotel hücreleri büyümek. Onlar sıkıca konfluent olana kadar faz kontrast mikroskopi kullanılarak her gün bunları inceleyin. </li><li> Yapışma ve aktivasyon moleküllerinin ifadesi arttırmak için endotel hücreleri uyarır. Bu protokolün amaçları için, endotel hücreleri, 37, dört saat boyunca 10 ng / rekombinant TNF-α mL ile stimüle edildi ° C&#39;de ve% 5 CO <sub&gt; 2 önceki akış koşullarında görüntüleme için ibidi odası kurma. </li><li> Mikroskobu ve görsel olarak boş bir ibidi odalarını kullanarak Wiese ve arkadaşları 11 tarafından açıklandığı gibi şırınga pompası hazırlayın. </li><li> Bu protokol ve Wiese prosedür arasında önemli farklar ön dolum, hava endotelyal hücrelerin maruziyeti önlemek için hortum 37 tampon muhafaza ° C sıcaklık kaybetme tampon tutmak için PharMed tüp kullanarak ve kullanarak, bir su banyosu kullanarak farklı dahil faz kontrast ve flüoresan ile olsa görüntüleme bağlı mikroskop hedefler. </li><li> Mikroskop kurmak ve boru yakın HBSS, tüm stopcocks dolu ve boş ibidi odasına çıkarın sonra. </li><li> TNF-α içeren ibidi odasına hortuma endotel hücreleri uyarılır bağlayın. </li></ol> 4. Nötrofil İşe Alım ve Transmigration <ol><li> Microsc alan endotel hücre monolayer görselleştirin10x faz kontrast objektif kullanarak ope. </li><li> Istenilen kayma gerilmesi de HBSS akışını (genellikle 0.5 ila 2 dyn / cm 2 arasında) çekme ve başlamak için şırınga pompası ayarlayın. </li><li> Üç-yollu durdur-horoz çevirerek izole nötrofiller (1x10 6 / mL) ile HBSS gelen giriş tarafına, anahtarı. </li><li> Bir DVD kaydedici ya bağlı veya doğrudan bilgisayara bağlı bir CCD kamera ile kayıt başlayın. Nötrofiller odası girdiğinizde zamanlayıcı başlayın. Dört dakika nötrofillerin serpmek. Nötrofil süspansiyon 3 mL toplam tek bir deney için yeterli olur. </li><li> Dört dakika sonra, yeni nötrofillerin eki önlemek HBSS geri dönün. Toplam etkileşimleri, haddeleme ve sağlam yapışma için veri istenirse, 10 saniye her biri için görüntü 6 rasgele alanları dakika 4 ile 5 arasında bir 10x faz kontrast objektif kullanarak. </li><li> Bir 40x objektif geçin ve 5 ile 10 dakika arasında bir görüş tek bir alan kaydedin. 10 dakika, toplamakbakış rastgele alanları 5 ila 10. </li><li> Akışını durdurun ve sonraki odasına taşıyın. </li></ol> 5.. Bir Ibidi Odası kullanarak Akım Altında Floresan Görüntüleme <ol><li> Bir ilgi floresan prob ile Etiket Gerek endotel hücreleri veya nötrofil. Örneğin, Alexa-[547] ile konjuge edilmiş anti-ve-cadherin antikoru endotel hücre eklemleri canlandırmak için kullanılabilir. </li><li> Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve floresan özellikleri olan bir mikroskop ibidi odası birleştirin. Biz bir kazanı olan bir FluoView 1000 konfokal (Olympus) kullanın. DIC ve floresan iş için tasarlanmış bir objektif kullanarak odaklanın. </li><li> Bölüm 4&#39;te açıklandığı zaman ders takip ederken satıcı tarafından verilen yazılım ile eş zamanlı DIC ve floresan resim al. </li></ol> 6. Nötrofil İşe Analizi <ol><li> Hücreleri, haddeleme ve etkileşim analizi Wiese ark 11 tarafından tarif edilir. </li&gt; <li> Endotel tek tabakalı 5 saniyelik bir süre içinde birden fazla hücre çapı taşındı nötrofil sayıları saymak yuvarlanarak nötrofillerin yüzdesini ölçmek için. Haddeleme hücrelerin yüzdesi belirlemek için alanda lökositlerin toplam sayısı ile bu sayı böler. Uzantısı olarak, kalan hücreler sıkıca yapışık olarak kabul edilir. </li><li> Nötrofil belirli bir süre içinde gitti ve sonra saniyeler içinde o zaman da bölünerek mesafeyi hesaplayarak nötrofil haddeleme hızı ölçün. </li><li> Hicret şekli değişti ve tek tabakalı 10 altında göç etmiş nötrofil sayısını sayarak belirlenir. Bunlar nötrofiller onlar faz olmanın parlak değiştirmek gerçeği ile tespit zaman zaman tek tabakalı 10 altında faz karanlık olmasının tek tabaka üstüne. Nakledildi hücrelerin sayısı görüş alanı içindeki toplam hücrelerin yüzdesi olarak ya da ham bir uyuşmuş olarak ifade edilebilirbirim alan başına nakledildi hücrelerin er. Bu model sistem olarak, nötrofillerin tipik olarak% 50 10 dakika sonra göçmek. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Unstimulated endotelyal hücreler nötrofil göçünü desteklemez. Buna karşılık, nötrofil haddeleme, firma yapışma ve geçişe TNF-α sonuçları ile endotel hücreleri uyarmak. Bu verilerin bir örneği, Şekil 1 ve 2 &#39;de gösterilmiştir. Şekil 1A TNF-α-uyarılmış endotel hücreleri ile etkileşen nötrofiller gösterir. Bu etkileşimler endotel hücreleri ile etkileşim nötrofil sayısı gibi (Şekil 2) sıkıca yapışık veya nakledildi, haddeleme nötrofil sayısı açığa ölçülebilir. Nötrofil göçü hücre kavşaklarda veya endotel hücreleri kendileri aracılığıyla oluşabilir. Bu iki durum arasında ayrım yapmak, endotelyal hücreler bir anti-VE-c ile etiketlenir<html> adherin antikor ve hicret (Şekil 1B ve C) paracellularly veya transcellularly meydana olarak kaydedilecektir. Bu modelde, hemen hemen tüm âlemden 7 paracellular olduğunu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Şekil 1. Bir ibidi odalarını kullanarak akış koşullarında Eşzamanlı DIC ve floresan görüntüleme. (A) DIC görüntü taze insan umbilikal ven endotel hücreleri arasında göç eden insan nötrofil izole. Sarı ok ucu yapışık, nötrofil gösterir; beyaz ok ucu bir transmigrating nötrofil gösterir. (B) endotel hücre kavşaklar Alexa-[547] ve görüntülü konjuge anti-VE-cadherin antikor ile boyandı. (C) Kanal A ve B bu model neredeyse tüm transmigrating paracellular olduğunu ifşa yerleşim gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . _content &quot;&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> Şekil 2. Endotel hücreleri unstimulated bırakılan veya TNF-α 10 ng / ml ile uyarıldı. 4 saat sonra, paralel bir plaka akış odası toplandı ve nötrofiller 1 dyn / cm 2 azından boyunca perfüze edilmiştir. (A) Nötrofil etkileşimleri incelenmiş ve NIH ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Toplam etkileşen hücreleri (B) haddeleme, sıkıca yapışık veya (C) transmigrating olarak karakterize edilmiştir. Veri 3 ila 5 deneyler ortalama + SEM temsil eder. Paneller A ve C kontrolü ve TNF arasındaki fark anlamlıydı (p &lt;0,001).

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+rolling%2C+arrest%2C+and+transmigration+across+activated%2C+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b%2FCD18%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li>
<li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation%2C+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li>
<li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+leukocyte+transmigration%3A+cell+surface+interactions+and+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li>
<li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+under+shear+flow%3A+it%27s+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li>
<li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neutrophil+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li>
<li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).</li>
<li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Phys+-+Gastrointestinal+and+Liver+Phys%22%5BJournal%5D)">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li>
<li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li>
<li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mat.+Res%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Araştırmacılar rutin nötrofil göçünü ve hicret incelemek için farklı vasküler yatak endotel hücreleri kullandık. Örnekleri arasında, bunlarla dermal mikrovasküler endotel hücreleri 12, insan göbek ven 10 den karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri 13 ve endotelyal hücreler, bunlarla sınırlı değildir. Aralarında HUVEC çünkü izolasyon ve durumu kendi göreceli kolaylığı geniş popülerlik kazandı. HUVEC in vivo olarak ortaya çıkan birçok endotel süreçleri taklit in vitro</em...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ve Ekipmanları </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Kordon tampon </td><td></td><td></td><td> Kompozisyon: 7.4 pH&#39;da 1mM NaH 2 PO 4/2 Na HPO 4 tampon 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glukoz </td></tr><tr><td> Endotel Hücre Medya (ECM) </td><td></td><td></td><td> Penisilin 100 adet streptomisin 100 mikrogram ve L-glutamine/ml 0,3 mg% 16 insan serumu kartal tuzları ile M199 </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin Streptomisin Glutamat (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi odaları </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Human Albumin% 20 çözüm </td><td> İkizler Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> + Ve Mg 2 Ca 2 olmadan HBSS + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> Ca 2 + ve Mg 2 + HBSS </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

akış koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil transmigration Çalışmaları kullanılması İzolasyonu

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Nötrofiller beyaz kan hücresi en bol türüdür. Bunlar doğuştan gelen bağışıklık sistemi 1 önemli bir parçasını oluştururlar. Akut iltihap süresince, nötrofiller yaralanma siteye geçirmek için ilk enflamatuvar hücreler. Arasında nötrofil üçüncü, haddeleme, yapışma ve hicret, ikinci, mikrovasküler yapısal değişiklikler ve kan dolaşımından plazma proteinlerine kaçmasını önlemek için; bir yaralanma siteye nötrofil alımı kan akışını arttırmak için kan damarları, ilk dilatasyon içeren bir basamaklı bir işlemdir endotel; yaralanma 2,3 yerinde nötrofil ve dördüncü birikimi. In vivo ve in vitro geniş bir dizi bu işlemler 4 çalışma sağlamak için gelişmiştir. Bu yöntem, insan endotel hücreleri arasında nötrofil göçü üzerinde duruluyor. Nötrofil göçü rol oynayan moleküler süreçleri inceleyerek Bir popüler yöntemi, insan n kullanırbirincil insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) 5 ile etkileşim eutrophils. Nötrofil izolasyon başka bir yerde 6 görsel olarak tarif edilmiştir, dolayısıyla bu makalenin HUVEC izolasyonu için yöntem gösterecektir. Izole edilip birleştiği yetiştirilen, endotel hücreleri yapışma ve aktivasyon moleküllerinin uyarılması sonucu aktive edilir. Örneğin, artan E-selektin ve IL-8 ifadesi 7 TNF-α sonuçları gibi sitokinler ile endotel hücrelerinin aktivasyonu. E-selektin aracılık nötrofiller ve IL-8 aracılık aktivasyonu ve nötrofil firma yapışma yakalama ve haddeleme. Yapışma nötrofiller göçmek sonra. Âlemden (endotelyal hücre kendisi üzerinden) transcellularly paracellularly oluşabilir (endotelyal hücre kavşak aracılığıyla) veya. Çoğu durumda, bu etkileşimlerin damar 7,8 bulundu akış koşullarda oluşur. Paralel plakalı akışı odası yaygın olarak kullanılan bir sistem olduğunu mihidrodinamik kayma in vivo ve in vitro bulundu 9,10 akış koşullarında nötrofil işe alınma çalışması sağlar. stresleri mikrofon Bazı şirketler paralel plakalı akışı odaları üretmek ve her avantaj ve dezavantajları var. Flüoresan görüntüleme gerekli ise, cam veya optik olarak benzer bir polimerin kullanılması gerekmektedir. Endotel hücreleri cam üzerinde iyi büyümez. Burada hızlı yapışma ve insan endotel hücrelerinin büyümesini destekler ve karşılaştırılabilir optik niteliklere sahip bir polimer düşük hacimli ibidi kanalı slayt kullanarak nötrofil göçü faz-kontrast, DIC ve floresan görüntüleme için kolay ve hızlı bir yöntem sunmak cam. Bu yöntemde, endotel hücreleri yetiştirildi ve bir ibidi μslide uyarılmış. Nötrofiller akış koşullarında tanıtıldı ve hicret değerlendirildi. Kavşaklarından Floresan görüntüleme karşı paracellular ölçüde gerçek zamanlı belirlenmesi etkintranssellüler âlemden.

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Nötrofiller, en bol bulunan beyaz kan hücresi türüdür. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin temel bir parçasını oluştururlar1. Akut inflamasyon sırasında, ...

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kaliteli insan endotel hücrelerini izole etmek ve bunları alt akış koşulları altında nötrofil transmigrasyonunu düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle insan göbek kordonu ven endotel hücrelerinin izole edilmesi ve ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin IBD odacıklarına bölünmesidir.Ardından, taze olarak izole edilen insan nötrofilleri aktive edilmiş endotel hücrelerinin üzerine yayılır; bu durum nötrofil yuvarlanması, sıkı yapışma ve transmigrasyon ile sonuçlanır. Son adım, video mikroskobu kullanarak transmigrasyonun miktarının belirlenmesidir. Nihayetinde, aktive edilmiş endotel hücreleri üzerinden nötrofil transmigrasyonunu değerlendirmek için floresan ve parlak alan mikroskobu kullanılabilir.Endotel hücre izolasyonunu tanımlamak kolaydır, ancak temel adımların göbek kordonunun görselleştirilmesini gerektirmesi nedeniyle öğrenmesi zordur. Bu nedenle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Bu yöntem, lökosit göçünün akış koşulları altında nasıl gerçekleştiği gibi inflamasyon alanındaki temel soruları anlamamıza yardımcı olacak ve endotel hücrenin akış koşulları altındaki davranışlarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.Bu yöntem enflamasyon sırasında nötrofil göçü hakkında bilgi sağlayabilse de, doğal öldürücü hücreler ve eozinofiller gibi nadir lökosit popülasyonlarına da uygulanabilir. Bu prosedürü Ritu Sharma ile birlikte laboratuvarımdaki teknisyen Hong Jang uygulamaktadır. Prosedürden en az bir saat önce, jelatin içeren bir T 75 flaskı 37 °C'de inkübe edin.Ardından, bir makas kullanarak plasentadan bir göbek kordonu keserek laminar akışlı kabinde endotel hücre izolasyon prosedürüne başlayın. Steril eldivenleri giydikten sonra kordonu dikkatlice inceleyin ve kan pıhtıları içeren veya doğum sırasındaki kordon klempleme işlemi nedeniyle hasar görmüş bölümleri atın. Daha sonra kordonda bulunan iki arteri ve tek veni belirleyin.Ardından, ucuna iki yollu stop musluğu takılı bir kanülü venin bir ucuna nazikçe yerleştirin ve ardından kanülü konumunda sabit tutmak için etrafına bir klemple sabitleyin. Prosedürün en zor kısımlarından biri göbek kordonunun perfüzyonudur. Bunun başarılı bir şekilde gerçekleştiğinden emin olmak için, kordonu fazla miktarda tampon çözelti ile perfüze edin ve akış şeffaf hale gelene kadar izleyin.Akış berraklaşana kadar veni kordon tamponu ile perfüze edin ve ardından kordonun ucunu klempleyiniz. Perfüzyon sırasında, hekimlerin göbek kordonundan kordon kanı almış olması nedeniyle bazen küçük bir delik ortaya çıkabilir. Bu durumlarda, delikleri kapatmak için hemostatlar kullanılabilir ve endotel hücreleri izole edilirken perfüzyona devam edilebilir.Kollajenaz işleminin zamanlamasını hassas bir şekilde ayarlamak kritik önem taşır. Sürenin çok kısa tutulması durumunda yeterli endotel hücre hasadı yapılamaz; sürenin çok uzun tutulması ise kontamine edici düz kas hücrelerinin oluşmasına veya endotel hücrelerinin hasar görmesine yol açabilir. Ardından, veni taze hazırlanmış sıcak kollajenaz ile perfüze edin.Musluğu kapatın ve kordonu, içinde ılık kordon tamponu bulunan bir behere yerleştirerek inkübe edin. 10 dakika sonra kordonu çıkarın ve endotel hücrelerini ven lümeninden ayırmak için kordona nazikçe masaj yapın. Çözeltiyi, beş mililitre endotel hücre medyumu veya ECM içeren bir tüpe boşaltın; kalan hücreleri temizlemek için kordonu iki kez kordon tamponu ile yıkayın.Şimdi hücreleri 10 dakika boyunca 350 ×g'de santrifüjleyin. Oda sıcaklığında süpernatantı uzaklaştırın ve ardından peleti yeniden süspande edin. Hücreleri 10 mL endotel hücre medyumu içinde, jelatin kaplı T 75 flaskına aktarın ve endotel hücrelerini gece boyunca 37 °C ve %5 CO2 koşullarında kültüre edin. Ertesi gün, herhangi bir eritrositi yerinden ayırmak için flaskı hafifçe sallayın.Ardından süpernatanı uzaklaştırın ve endotel hücre kültürünü ılık HBSS ile yıkayın. HBSS'i uzaklaştırdıktan sonra hücreleri 10 milliliters ılık ECM ile besleyin. Daha sonra, eritrositlerin uzaklaştırıldığından emin olmak ve endotel hücrelerinin konfluens derecesini ve morfolojisini değerlendirmek için hücreleri mikroskop altında inceleyin.Hücreler konfluansa ulaşana kadar her üç günde bir besiyerini değiştirmeye devam edin. Bu noktada, hücreleri tripsin ve EDTA çözeltisi kullanarak ayırın. Ardından ayrılan hücreleri toplayın ve ECM içinde yeniden süspande edin.Son olarak, bir IBD odacığının her kuyucuğunu jelatin ile kaplayın. Fazla jelatini uzaklaştırın ve ardından odacığın her kuyucuğuna mililitre başına 1,5 × 10⁶ endotel hücre süspansiyonu ekleyin. Endotel hücreleri aktive edilirken, hücreleri uygun bir stimülan ile inkübe ederek adezyon ve aktivasyon molekülleri hücre yüzey ekspresyonunun yukarı regülasyonunu indükleyerek başlayın.Sağlıklı insan gönüllülerin periferik kanından nötrofilleri, daha önce yayınlandığı üzere yoğunluk gradiyentli santrifüj ile izole edin ve ardından hücreleri HBSS artı insan albümin içerisinde mililitre başına 1 × 10⁶ konsantrasyonda süspande edin. Mikroskobu kurduktan sonra, stimüle edilmiş endotel hücrelerini içeren IBD haznesini mikroskobun tüplerine bağlayın. 10x faz kontrast objektifini seçin ve ardından şırınga pompasını, istenen kayma geriliminde HBSS akışını başlatacak şekilde çekme moduna ayarlayın.Çıkış tarafındaki üç yollu musluğu kapalı konuma getirip giriş hattını HBSS'den izole nötrofillere geçirerek akışı kısa süreliğine durdurun. Musluğu tekrar açık konuma getirerek akışı yeniden başlatın. Ardından, bir DVD kaydediciye bağlı bir CCD kamera kullanarak kayda başlayın.Zamanlayıcıyı başlatın. Dört dakika sonra nötrofiller hazneye girdiğinde, yeni nötrofillerin yapışmasını önlemek için tekrar HBSS'ye geçin. Toplam etkileşimler, yuvarlanma ve sıkı yapışma verileri isteniyorsa, 10x faz kontrastı kullanın.Dördüncü ve beşinci dakikalar arasında, her biri 10 saniye boyunca altı rastgele alanı görüntülemek için objektifi ayarlayın. Son olarak, 40x objektife geçin ve ilgi duyulan zamanda tek bir görüş alanını kaydedin. 10. dakikadaki nötrofil perfüzyonundan sonra, beş ile 10 arasında rastgele görüş alanı toplayın.Uyarılmamış endotel hücreleri nötrofil göçünü desteklemez. Bu nedenle, aşağıdaki şekillerde TNF alpha ile uyarılmış endotel hücreleri ile etkileşime giren nötrofiller gösterilmektedir. Sarı ok başı ile belirtilen yapışmış nötrofile ve beyaz ok başı ile gösterilen transmigrasyon halindeki nötrofile dikkat ediniz.Nötrofil transmigrasyonu, hücre bağlantılarında veya endotel hücrelerinin kendileri aracılığıyla gerçekleşebilir. Bu iki durum arasındaki farkı ayırt etmek için endotel hücreleri, anti VE koherent bir antikor ile işaretlenmiştir. Burada kırmızı renkte görüldüğü üzere, transmigrasyon paraselüler veya transselüler olarak skorlanmaktadır.Bu modelde, önceki iki şeklin üst üste bindirilmiş halini gösteren bu şekille kanıtlandığı üzere, transmigrasyonun neredeyse tamamı parasellülerdir. Üç grafikten ilki olan bu grafikte, nötrofil etkileşimleri Image J yazılımı kullanılarak incelenmiş ve ölçülmüştür. Nötrofiller ile TNF alpha aktive edilmiş endotel hücreleri arasındaki nötrofil endotel hücre etkileşimlerinin, kontrol grubu olan uyarılmamış endotel hücrelerine göre anlamlı derecede daha fazla gerçekleştiğine dikkat edin.Toplam etkileşen hücreler; daha önce olduğu gibi yuvarlanan, sıkıca yapışan veya transmigrasyon yapan hücreler olarak daha ayrıntılı şekilde karakterize edildi. Endotel hücrelerinin izolasyonunun ardından, aktive edilmiş endotel hücreleri içeren kuyucuklarda anlamlı derecede daha fazla nötrofil transmigrasyonu gerçekleşti. Gelişim sonrası, endotel hücresi biyolojisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla western blotting, real-time PCR ve endotel direnci gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu yöntem, enflamasyon ve vasküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, insan model sisteminde akış koşulları altında lökosit göçünün nasıl gerçekleştiğini anlamalarına yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, insan göbek kordonu ven endotel hücrelerinin nasıl izole edileceği ve bir ity kamarası kullanarak akış koşulları altında nötrofil transmigrasyonunu incelemek için bu hücrelerin nasıl kullanılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.

isolation-human-umbilical-vein-endothelial-cells-their-use-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video protokolü insan göbek kordonu, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) izolasyonu ve kültürü göstermektedir. Bir kere bu hücreler, in vitro Hughes laboratuvar gösterdiği Optimize Fibrin Jel Boncuk Testi gibi anjiyogenez tayinlerde için kullanılabilir izole edilmiştir.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Video, stromal hücrelerin lökosit alımı üzerindeki etkisini araştırmak için bir yöntem göstermektedir. Paralel bir plaka akış odası modelinde, pro-inflamatuar sitokinler, endotel hücreleri tarafından adezyon reseptörlerinin ekspresyonunu indükleyerek nötrofil alımını ve göçünü kolaylaştırır. Stromal hücreler ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, endotel hücrelerine nötrofil alımını azaltır.

Stromal Hücrelerin Lökosit Alımı Üzerindeki Etkisinin İn Vitro Flow Araştırması

Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Birincil insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler), bir mikroakışkan ağ cihazı içinde birleşecek şekilde büyütüldü. Endotel hücre bağlantısı ve F-aktin dağılımları gösterildi ve adenozin trifosfata (ATP) yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve nitrik oksit üretimindeki değişiklikler, bireysel hücre seviyelerinde gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) kültürü için protokoller, mikrotübül büyümesinin floresan işaretli belirteçlerinin geçici transfeksiyonu, canlı hücre görüntüleme ve interfaz mikrotübül büyüme dinamiklerinin otomatik analizi detaylandırılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.

Akciğer Kaynaklı Örneklerden Mikrovasküler ve Makrovasküler Endotel Hücre İzolasyonu ve Saflaştırma

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Keşfedin, insan göbek kordonu ven endotel hücreleri izolasyonu ve akış koşullarında nötrofil transmigrasyonunu inceleme yöntemini. Canlı hücre görüntüleme ile inflamatuar yanıt mekanizmalarını araştırın.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Daha fazla video keşfet