Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kaliteli insan endotel hücrelerini izole etmek ve bunları alt akış koşulları altında nötrofil transmigrasyonunu düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle insan göbek kordonu ven endotel hücrelerinin izole edilmesi ve ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise hücrelerin IBD odacıklarına bölünmesidir.

Ardından, taze izole edilmiş insan nötrofilleri aktive edilmiş endotel hücrelerinin üzerine yayılır; bu durum nötrofil yuvarlanması, sıkı adezyon ve transmigrasyon ile sonuçlanır. Son adım, transmigrasyonun video mikroskopi kullanılarak nicelendirilmesidir. Nihayetinde, aktive edilmiş endotel hücreleri boyunca nötrofil transmigrasyonunu değerlendirmek için floresan ve parlak alan mikroskopisi kullanılabilir.

Endotelyal hücre izolasyonunu tanımlamak kolaydır ancak kilit adımların göbek kordonunun görselleştirilmesini gerektirmesi nedeniyle öğrenmesi zordur. Bu sebeple, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Bu yöntem, lökosit göçünün akış koşulları altında nasıl gerçekleştiği gibi inflamasyon alanındaki temel soruları anlamamıza yardımcı olacak ve endotelyal hücrenin akış koşulları altındaki davranışının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Bu yöntem, inflamasyon sırasında nötrofil katılımına dair içgörü sağlayabilse de, doğal öldürücü hücreler ve eozinofiller gibi nadir lökosit popülasyonları için de uygulanabilir. Bu prosedürü Ritu Sharma ile birlikte laboratuvarımdaki teknisyen Hong Jang uygulamaktadır. Prosedürden en az bir saat önce, jelatin içeren bir T 75 flaskı 37 °C'de inkübe edin.

Ardından, bir makas kullanarak plasentadan bir göbek kordonu keserek laminer akışlı kabinde endotel hücre izolasyon prosedürüne başlayın. Steril eldivenleri giydikten sonra kordonu dikkatlice inceleyin ve kan pıhtısı içeren veya doğum sırasındaki kordon klempleme işlemi nedeniyle hasar görmüş kısımları atın. Daha sonra kordonda bulunan iki arteri ve tek veni belirleyin.

Ardından, ucuna iki yollu stop kok takılı bir kanülü venin bir ucuna nazikçe yerleştirin ve kanülü sabit tutmak için etrafına bir klemps takın. Prosedürün en zor kısımlarından biri göbek kordonunun perfüzyonudur. Bunun başarıyla gerçekleşmesini sağlamak için, kordonu fazla miktarda tampon çözelti ile perfüze edin ve akış berraklaşana kadar izleyin.

Akış berraklaşana kadar veni kordon tamponu ile perfüze edin ve ardından kordonun ucunu klempleyin. Perfüzyon sırasında, hekimlerin göbek kordonundan kordon kanı almış olması nedeniyle ara sıra küçük bir delik ortaya çıkabilir. Bu durumlarda, deliği kapatmak için hemostatlar kullanılabilir ve endotel hücreleri izole edilirken perfüzyona devam edilebilir.

Kollajenaz işleminin zamanlamasını hassas bir şekilde ayarlamak kritik öneme sahiptir. Sürenin çok kısa tutulması durumunda yeterli endotel hücre hasadı yapılamaz; sürenin çok uzun tutulması ise kontamine edici düz kas hücrelerinin oluşmasına veya endotel hücrelerinin hasar görmesine neden olabilir. Ardından veni, taze hazırlanmış sıcak kollajenaz ile perfüze edin.

Musluğu kapatın ve kordonu, ılık kordon tamponu içeren bir beher içinde inkübe edin. 10 dakika sonra kordonu çıkarın ve ardından endotel hücrelerini ven lümeninden ayırmak için kordona nazikçe masaj yapın. Çözeltiyi, beş mililitre endotel hücre medyumu veya ECM içeren bir tüpe aktarın; kalan tüm hücreleri temizlemek için kordonu iki kez kordon tamponu ile yıkayın.

Şimdi hücreleri 10 dakika boyunca 350 ×g'de santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, süpernatanı uzaklaştırın ve ardından peleti yeniden süspande edin. Hücreleri 10 mL endotel hücre besiyeri içerisinde, jelatin kaplı T 75 flaska aktarın ve endotel hücrelerini 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında gece boyunca kültüre edin. Ertesi gün, herhangi bir eritrositi uzaklaştırmak için flaskı hafifçe sallayın.

Ardından süpernatanı uzaklaştırın ve endotel hücre kültürünü ılık HBSS ile yıkayın. HBSS'yi uzaklaştırdıktan sonra hücreleri 10 milliliters ılık ECM ile besleyin. Daha sonra, eritrositlerin uzaklaştırıldığından emin olmak ve endotel hücrelerinin konfluens derecesini ve morfolojisini değerlendirmek için hücreleri mikroskop altında inceleyin.

Hücreler konfluence seviyesine ulaşana kadar her üç günde bir besiyerini değiştirmeye devam edin. Bu noktada, hücreleri bir tripsin ve EDTA çözeltisi kullanarak pasajlayın. Ardından ayrılan hücreleri toplayın ve ECM içinde yeniden süspande edin.

Son olarak, bir IBD odasının her kuyucuğunu jelatin ile kaplayın. Fazla jelatini uzaklaştırın ve ardından odanın her kuyucuğuna mililitre başına 1,5 × 10⁶ endotel hücre süspansiyonu ekleyin. Endotel hücreleri aktive edilirken, onları uygun bir stimülan ile inkübe ederek adezyon ve aktivasyon molekülü hücre yüzeyi ekspresyonunun yukarı regülasyonunu indükleyerek başlayın.

Sağlıklı insan gönüllülerin periferik kanından, daha önce yayınlandığı üzere yoğunluk gradiyent santrifüjle nötrofilleri izole edin ve ardından hücreleri HBSS artı insan albümin içinde mililitre başına 1x10⁶ konsantrasyonda süspande edin. Mikroskop kurulumunu tamamladıktan sonra, stimüle edilmiş endotel hücrelerini içeren IBD haznesini mikroskobun boru hattına bağlayın. 10x faz kontrast objektifini seçin ve ardından şırınga pompasını, istenen kayma geriliminde HBSS akışını başlatmak üzere çekme konumuna getirin.

Çıkış tarafındaki üç yollu musluğu kapalı konuma getirerek ve giriş hattını HBSS'den izole nötrofillere geçirerek akışı kısa süreliğine durdurun. Musluğu tekrar açık konuma getirerek akışı yeniden başlatın. Ardından, bir DVD kayıt cihazına bağlı bir CCD kamera kullanarak kayda başlayın.

Zamanlayıcıyı başlatın. Dört dakika sonra nötrofiller hazneye girdiğinde, yeni nötrofillerin tutunmasını önlemek için tekrar HBSS'ye geçin. Toplam etkileşimler, yuvarlanma ve sıkı yapışma için veri isteniyorsa, 10x faz kontrastı kullanın.

Dördüncü ve beşinci dakikalar arasında, her biri 10 saniye boyunca altı rastgele alan görüntülemek için objektifi ayarlayın. Son olarak, 40 x objektife geçin ve ilgili zamanda tek bir görüş alanını kaydedin. 10. dakikadaki nötrofil perfüzyonundan sonra, beş ile 10 arasında rastgele görüş alanı toplayın.

Uyarılmamış endotel hücreleri nötrofil göçünü desteklemez. Bu nedenle, aşağıdaki şekiller TNF alfa ile uyarılmış endotel hücreleriyle etkileşime giren nötrofilleri göstermektedir. Sarı ok ucuyla belirtilen yapışmış nötrofile ve beyaz ok ucuyla belirtilen transmigrasyon halindeki nötrofile dikkat ediniz.

Nötrofil transmigrasyonu, hücre eklemlerinde veya endotel hücrelerinin kendileri aracılığıyla gerçekleşebilir. Bu iki durumu birbirinden ayırt etmek için endotel hücreleri anti-VE koherent antikor ile işaretlenmiştir. Burada kırmızı renkte görüldüğü üzere, transmigrasyon paraselüler veya transselüler olarak puanlanır.

Bu modelde, önceki iki şeklin üst üste bindirildiği bu şekilde gösterildiği üzere, transmigrasyonun neredeyse tamamı parasellülerdir. Üç grafikten ilki olan bu grafikte, nötrofil etkileşimleri Image J yazılımı kullanılarak incelenmiş ve ölçülmüştür. Nötrofiller ile TNF alpha aktive edilmiş endotel hücreleri arasındaki nötrofil endotel hücre etkileşimlerinin, kontrol grubu olan uyarılmamış endotel hücrelerine göre anlamlı derecede daha fazla olduğu görülmektedir.

Toplam etkileşen hücreler, daha önce yapıldığı gibi yuvarlanan, sıkıca yapışan veya transmigrasyon yapan hücreler olarak daha ayrıntılı şekilde karakterize edildi. Endotel hücrelerinin izolasyonunu takiben, aktive edilmiş endotel hücreleri içeren kuyucuklarda anlamlı derecede daha fazla nötrofil transmigrasyonu gerçekleşti. Gelişimden sonra, endotel hücresi biyolojisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için western blotting, real-time PCR ve endotel direnci gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu yöntem, inflamasyon ve vasküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, insan model sisteminde akış koşulları altında lökosit göçünün nasıl gerçekleştiğini anlamalarına yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, insan göbek kordonu ven endotel hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve bir ity kamarası kullanarak akış koşulları altında nötrofil transmigrasyonunu incelemek için bu hücrelerin nasıl kullanılacağını iyi derecede kavramış olmalısınız.