Name: Incelenmesi için İnsan Fallop Tüp Modeli C. trachomatis Enfeksiyonlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Keşfedin C. trachomatis enfeksiyonlarını insan fallop tüpü modeli kullanarak. Bu yöntem, bakteriyal patojenler ile insan fallop tüpü hücreleri arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için geliştirilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma &quot;Interfaces inflamasyon&quot; Mükemmeliyet DFG-Küme (RA-Eğer, RA-D) tarafından desteklenmiştir. Biz Kristin Wischnat mükemmel teknik destek için minnettarız.

1. Chlamydia trachomatis serovar D Stok hazırlanması <ol><li> 4 ml C. ile HeLa-229 hücre içeren konfluent 175 cm 2 hücre kültürü şişesi Infect tampon SPG içinde trachomatis D. </li><li> Sürekli sarsıntı sırasında 37 ° C&#39;de bir saat inkübe edin. </li><li> % 10 FCS ve 240 ul Cycloheximide ile 20 ml DMEM ekleyin. </li><li> 37 de 48 saat süre ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li><li> C. ayırmak ve yok etmek için 5 ml steril cam boncuk, güçlü sarsıntı ekle HeLa-229 hücreleri barındıran trachomatis. </li><li> Süpernatant toplayın ve steril cam boncuk başka bir 5 ml ekleyin. </li><li> 1 dakika Kaya üç kez tüm HeLa-229 hücrelerini yok ve serbest C&#39;ye trachomatis. </li><li> 5 1000 RPMI dk ve 4 santrifüjleyin ° C hücresel enkaz kurtulmak için. </li><li> 8-10 175 cm 2 hücre kültürü enfeksiyonu için supernatant toplamak konfluent g şişelerHeLa 229 hücrelerle rown. </li><li> 37 az bir saat için 4 ml SPG tampon ve önceki enfeksiyondan 4 ml supernatant ° sürekli sarsıntı ile C hastası olan her şişesi inkübe edin. </li><li> Bir saat% 10 FCS ile 37 ° C ve% 5 CO2 az 48 saatlik inkübasyondan ardından 230 ul sikloheksimid ile 15 ml DMEM ekledikten sonra. </li><li> , 5 ml steril cam boncuk ekle ayırmak için sallayın ve C. yok HeLa-229 hücreleri barındıran trachomatis. </li><li> Süpernatant toplayın ve steril cam boncuk başka bir 5 ml ekleyin. </li><li> 1 dakika Kaya üç kez tüm HeLa-229 hücrelerini yok ve serbest C&#39;ye trachomatis. </li><li> 4 1000 RPMI az 5 dakika boyunca santrifüj ° C hücresel enkaz kurtulmak için. </li><li> Süpernatant toplayın. </li><li> 11000 RPMI ile 99 dakika boyunca 50 ml Falcon tüpleri, santrifüj süpernatant 40 ml doldurun. </li><li> Santrifüj sonra süpernatan atmak ve 1 ml tampon SPG ile pelet yıkayın. </li><li> Homojenizepelet -70 az 1, 5 ml Eppendorf tüp, mağaza ° C&#39;de kullanılıncaya kadar 1 ml SPG ve tablet 20 ul içinde. Hazırlanan stok biyolojik aktivite kurulu bir HeLa-229 hücre enfeksiyon modelinde doğrulandı. </li></ol> 2. İnsan Fallop Tüp hazırlanması <ol><li> Hemen RPMI hazırlık kadar 4 antibiyotik olmadan ° C% 5 FCS içeren cerrahi sonrası histerektomi geçiren kadınlarda Store&#39;dan insan fallop tüpleri (HFT). Protokolü Lübeck Üniversitesi (09-153) etik komitesi tarafından onaylandı. (53 yaşına kadar 34) çalışmaya dahil Kadınlar önceden C. öyküsü yoktu trachomatis enfeksiyonu. Fallop tüplerinin Doku sezaryen sırasında veya luteal faz semptomatik miyom nedeniyle histerektomi sırasında annenin isteği üzerine peripartum sterilizasyon toplanmıştır. Tüm HFT C. için negatif test edildi PCR ile trachomatis. </li><li> RPMI içeren Petri içinde HFT teşrihAntibiyotikler olmadan% 5 FCS. Bütün işleme sırasında doku kurumasını önlemek için ortam içine daldırılmış edilmelidir. </li><li> Kesiniz ve ameliyat sırasında tahrip bağ dokusu ve doku atın. </li><li> Diseksiyon sonra küçük bir bistüri ile dikkatlice HFT açın. </li><li> Daha ayrıntılı bilgi için deneyler x 0,5 cm yukarı 1 cm x 1 cm ile 0.5 cm büyüklüğünde doku parçalarını hazırlamak. </li><li> Enfeksiyon mağaza HFT numune için 1 ml RPMI antibiyotikler olmadan% 5 FCS içeren. HFT örneklerinin C. 5.5x10 5 IFU (dahil oluşturan birim) ile enfekte olduğunu trachomatis. </li><li> 37 içinde HFT numunesi inkübe ° C,% 5 CO2 ve% 21 O2 gibi 37 ° C,% 5 CO2 ve 2 saat süre ile% 24 O2. </li><li> İnkübasyon süresi 4 en az üç gün Monti en sabitleştirici olarak örnek ve mağaza toplamak sonra SEM / TEM hazırlık kadar ° C. </li></ol> 3. TEM için HFT Numune Hazırlanması <ol><li> IçinTEM Monti en sabitleştirici gelen örnek kaldırmak ve 4 x 5 mm adet 2 x 2 mm kesti. Geriye kalan doku SEM için kullanılabilir. </li><li> 1 saat süreyle sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 ile parçalara yıkanır. </li><li> % 1 (w / v) su içinde hedef osmiyum tetroksit de inkübe. gecede. </li><li> Sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 olarak 6x5 dakika yıkanması ile aşırı osmiyum tetroksit çıkarın. </li><li> Su içinde etanol artan yoğunluklarda (v / v) (2 saat süreyle% 30, 2 saat süreyle% 40, 2 saat süreyle% 50, 2 saat süreyle 60%, gece boyunca 70%, 2 için 80% in kuluçkaya suyu uzaklaştırmak s, 1 saat boyunca 90%, 1 saat boyunca 95%, 1 saat boyunca 100%. </li><li> Propilen oksit in 2 x 15 dakika boyunca etanol dışarı yıkanır ve daha sonra% 50 oranında bir karışımı (v / v) içinde propilen taze hazırlanmış araldit (tüm bileşenler de dahil olmak üzere) aktarmak ve bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> En az 1 saat için taze hazırlanmış araldit (tüm bileşenler de dahil olmak üzere) transfer edilir. </li><li> Düz gömme kalıpları transfer ve araldit ile doldurun. </li><li> Için araldit sertleştiriniz60 ° C&#39;de en az 48 saat </li><li> Gömülü örnek Kesimden sonra cam bıçak veya histo elmas bıçak kullanılarak bir ultramicrotome üzerine yarı ince kesitler (700 nm) kesilmiş ve Richardson ile leke leke. </li><li> Bir elmas bıçak ve bakır ızgaralar (örneğin 150 kare gözlü) transfer kullanan ultra-ince kesitler (yaklaşık 70 nm) kesin. </li><li> Aqua dest% 0.5 (w / v) uranil asetat ile ultra-ince kesitler Leke. % 3 (w / v) su hedef kurşun sitrat izledi. otomatik bir bölümü yapıcısı içinde. Alternatif olarak, bölüm ızgaraları su hedef olarak uranil asetat ile doymuş bir çözelti santrifüje üzerinde 15 dakika bırakarak elle boyanmış edilebilir. su hedef olarak% 0.3 kurşun sitrat (w / v) izledi. </li></ol> 4. SEM için HFT numune hazırlanması <ol><li> SEM epitel 1.5 x 1 cm mantar levha üzerinde yukarı bakacak şekilde Monti en fiksatörü, orient örnek kaldırmak ve böcek iğneleri kullanarak konumunu düzeltmek için. </li><li> Uygun metal sepet mantar üzerinde örnek aktarın vesodyum cacodylate tamponu, pH 7.35 olarak 30 dakika süre ile yıkanır. </li><li> Aseton / su karışımları artan konsantrasyonları (v / v) 6 saat süreyle% 30, 6 saat süre ile% 40, 8 saat boyunca 60%, gece boyunca 70%, 2 saat süreyle% 80,% 90 oranında içinde Örnek kuluçkaya suyu uzaklaştırmak Gece boyunca 2 saat ve% 100 (numune sürekli su altında tutmak son derece dikkatli olmalı). </li><li> Kritik nokta kurutma (sıcaklık 40 ° C, basıncı 80 bar) tarafından taze% 100 aseton ve kuru numune transfer. </li><li> Iletken karbon çimento kullanarak bir iletken karbon sekmesi ile donatılmış SEM numune montaj bakacak şekilde epitel ile iğne, mantar ve tutkal örnek çıkarın. Montaj ve iletken karbon sekmesini arasındaki iletkenliği artırmak için sıvı iletken gümüş kullanın. </li><li> Bir lak sputter kullanılan numunenin iletken bir platin, altın veya paladyum kaplama hazırlayın. </li></ol> 5.. Richardson&#39;ın Leke Yarı İnce Kesitler boyanması <ol><li> Slaytta yarı ince kesitler kurumasını bekleyin. </li><li> 1-2 dakika süreyle 60 ° C sıcaklıkta çözelti boyama ile bölümlere leke. </li><li> Aqua dest yıkayın. </li><li> Kuru bölümleri ve kapak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Insan fallop tüpü enfeksiyonu modeli içinde biz enfekte olmayan kontroller (Şekil 1) ve C arasında epitelyal morfoloji farklılıklar görselleştirmek başardık trachomatis - normoksik koşul altında enfekte tüpleri (Şekil 2). Karakteristik morfolojik farklılıklar enfekte olmayan kontroller tespit edilemedi fallop tüpü epitel hücrelerinin patojen bağlı şişme ve lizis ima etti. Yarı ince kesit ve transmisyon elektron mikroskobu kullanarak bizim hücre içi C ispat başardık insan fallop tüpü doku enfekte ex vivo trachomatis dahil oluşumu (Şekil 3, 5) ancak enfekte olmayan kontrollerde (Şekil 4). Oksijen konsantrasyonu gibikadın genital yollarında ASIZ biz de hipoksik koşullarda bizim modeli incelenmiştir inflamatuar sürecinde fizyolojik koşullarda 11 ve daha fazla azalma altında zaten düşük. Ön sonuçlar modeli oksijen biyokatalist altında klamidyal büyüme ve döl analiz etmek yararlı olduğunu göstermektedir. Chlamydia-indüklenen epitel hücre hasarına enfeksiyonu önce fallop tüpleri (Şekil 6) dikkatsizce kullanımı ve kullanım aracılığı ile ortaya eserler ayrılması gerekir. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Kontrolü ortamda bir gün inkübasyon (yeşil ok silli hücre, mavi ok olmayan silli hücre hepsini göster) sonra enfekte olmayan insan fallop elektron mikroskobu (SEM). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Tarama elektron mikro<html> insan fallop tüpü bir gün sonrası enfeksiyon (beyaz ok işareti rüptüre dahil) enfekte bir ex vivo C. trachomatis kopyası (SEM). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Yarı ince kesitler C ile insan tuba enfeksiyondan sonra tipik intraselüler inklüzyon (beyaz oklar) 1d göstermek trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Kontrolü ortamda bir gün inkübasyondan sonra non-enfekte insan tuba transmisyon elektron mikroskobu (TEM). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Bir ex vivo C. Şekil 5. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) trachomatis insan fallop tüpü bir gün sonrası enfeksiyon (beyaz oklar klamidyal kapanım işaretleyin) bulaşmış. ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Numunenin dikkatsizce hazırlama ve işleme (beyaz ok işareti epitel doku tahrip) yoluyla zarar fallop tüpü epitelin elektron mikroskobu (SEM).

<ol><li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li>
<li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li>
<li>Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeipert%2C+JF+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 349, 2424-2430 (2003).</li>
<li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubal+factor+infertility%2C+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li>
<li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55(2006).</li>
<li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li>
<li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li>
<li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li>
<li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li>
<li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Enfekte dokuya patojen ile endüklenen zarar görselleştirme zahmetli ve farelerde deney prosedürleri genellikle sınırlı değildir. Biz C. analiz etmek, insan fallop tüpleri bir ex vivo enfeksiyon modelinde kurulan Üst kadın genital sistem enfeksiyonları trachomatis. Bu metodun kullanılması suretiyle, C. görsel mümkün olduğu trachomatis - bir gün sonrası enfeksiyon içinde insan fallop tüpü epitel hasarını. Hücresel şişme ve lizis C. gözlendi tipik morfolojik değişiklikler vardı trachomatis - enfekte fallop tüpleri ancak enfekte olmayan kontrol. TEM analizleri klamidyalar yeniden farklılaşmış temel organları değil, aynı zamanda kalıcılık gösterebilir genişlemiş retiküler organları ile küçük inklüzyonlar büyük inklüzyonları gösteren, enfekte dokuların içinde tipik bir hücre içi gelişim döngüsünü gerçekleştirirken ortaya koymuştur. Ancak tek başına morfolojik resmi repl arasında ayrım yeterli değilazalmış metabolizma ile karakterize edilir ve icating ve inatçı enfeksiyonlar, antibiyotik 10 dayanıklılığı artar. Enfekte fallop tüpleri epitel tahribatı C. bozulması için iki nedeni trachomatis - hücre içi gelişim döngüsü ve enfeksiyöz elementer cisimlerin serbest bırakılması veya pro-inflamatuvar 8 sürümü tamamlanmasından sonra enfekte olmuş epitel hücreleri. Patojen bağlı doku hasarı ve C&#39;ye karşı konak bağlı immün reaksiyonlar trachomatis epitel hücre fonksiyonu, fibroblast şekillenmesi ve in vivo 8,11 nihayet tubal kaybına yol açan başlıca faktörler olması gerekiyordu. Bu model önemli kısıtlamaları biri başlangıç ​​C. sekonder etkileri analizi engellemektedir inflamatuar hücrelerin yokluğudur Fallop tüpü epitel trachomatis enfeksiyonu. Bununla birlikte, modeli ap olduğufarklı çevresel koşullarda (örneğin oksijen içeriği) ve akut C. ilk ana-immün yanıtı araştırmak için propriate trachomatis enfeksiyonları 8,9. Daha planları C&#39;ye karşı antibiyotik test için bir model oluşturmaktır Tüm insan fallop tüpleri ve 2-foton lazer tarama mikroskop ile tuba epiteli gözlenen farklı gelişim aşamalarında metabolik durumları karakterize etmek trachomatis.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon SPG </td><td> çeşitli </td><td></td><td> aşağıdaki tarife bakınız </td></tr><tr><td> Monti en fiksatif </td><td> çeşitli </td><td></td><td> aşağıdaki tarife bakınız </td></tr><tr><td> sodyum cacodylate tampon </td><td> çeşitli </td><td></td><td> aşağıdaki tarife bakınız </td></tr><tr><td> Richardson en leke </td><td> çeşitli </td><td></td><td> aşağıdaki tarife bakınız </td></tr></tbody></table> Tarifler: 1. Tampon SPG <ol><li> 75 g sakaroz ekleyin. </li><li> 2.47 g disodyum fosfat ekleyin. </li><li> 0.36 g monosodyum fosfat ekleyin. </li><li> 0.72 g glutamik asit ekleme. </li><li> Aqua dest ile 1 l doldurun. </li><li> 7.3 pH ayarlayın. </li></ol> 2. 0.1 M sodyum cacodylate tamponu, pH 7.35. <ol><li> 42.80 g dimethylarsenic asit sodyum tuzu ekleyin. </li><li> 68.46 g sakaroz ekleyin. </li><li> Aqua dest ile 1 l doldurun. 0.2 M sodyum cacodylate tamponu almak için. </li><li> Aqua dest ile çözelti kullanmadan önce. istenen konsantrasyonu ve 7,35 gerekirse üzere pH&#39;ı ayarlamak için. </li></ol> 3. Monti en fiksatif <ol><li> 156 ml 0,12 M sodyum cacodylate tamponunu ekleyin. 3,2 su hedef olarak 25 mL% 25 Glutaraldehit ekleyin. </li><li> 19 ml ekleAqua dest% 10 paraformaldehit. </li><li> Aqua dest 3 ml% 3 CaCI2 ekleyin. </li><li> 7,35 pH ayarlayın ve aqua dest ile doldurun. 312 ml nihai bir çözüm için. </li></ol> 4. Richardson&#39;ın leke <ol><li> Aqua dest% 1 sulu boraks çözeltisi ve% 1 Azur II% 1 metilen mavisi eşit hacimde karıştırılır. </li></ol>

incelenmesi için İnsan fallop tüp modeli<em&gt; c. trachomatis</em&gt; enfeksiyonlar

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Chlamydia trachomatis ile genital sistem enfeksiyonları (C. trachomatis) tüm dünyada kadınlarda en sık görülen cinsel yolla bulaşan hastalık vardır. Patojenlerin Verimsiz klirensi veya kalıcılık üst genital sistem enfeksiyonları artan ve enfekte dokuların 1,2 kronik inflamatuar zarar gerekiyordu yol açabilir. Sonuç olarak, pelvik inflamatuar hastalık (PID), tubal oklüzyon ve infertilite gibi ciddi klinik sekeller 3,4 oluşabilir. C ile araştırmaların çoğu trachomatis epitel hücre çizgilerinden (örneğin HEp-2 hücreleri ve HeLa-229) veya farelerde yapılmıştır. Bununla birlikte, hücre kültürü bazlı modelleri ile olduğu gibi, ne de ana doku fizyolojisini ya da C&#39;nin patofizyolojisini yansıtır yok in vivo 5 trachomatis genital sistem enfeksiyonları. Başka sınırlamalar gerçeği ile verilir, merkez sinyal şelaleri (ör. IFN-γ mediatintrasellüler klamidyal büyümesini kontrol ed JAK / STAT sinyal yolağı) temelde farelerde ve insanlarda 6,7 arasında farklılık. Biz ve diğerleri, bu nedenle C arasında doğrudan etkileşimleri araştırmak için bütün bir organın fallop tüpü model oluşturdu trachomatis ve insan fallop tüpü hücrelerinin ex vivo 8,9. Bu amaçla, histerektomi geçiren kadınlarda insan fallop tüpleri C ile toplanır ve enfekte edildi 24 saat sonrası enfeksiyon içinde trachomatis serovar D., örnek nerede Chlamydia trachomatis algılamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak epitel hasarı gibi aracılık analiz C. Fallop dokusunda trachomatis dahil oluşumu.

Biz bir tarif<em&gt; Ex vivo enfeksiyon</emInsan fallop tüpü hücreleri ile bakteriyel patojenler doğrudan etkileşim görselleştirme&gt; modeli. Tüm organ doku modeli araştırmak için kuruldu<em&gt; C. trachomatis</em&quot;Hayat&quot; gibi koşullar altında kadın fallop tüpüne&gt; bağlı patoloji.

Incelenmesi için İnsan Fallop Tüp Modeli<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Enfeksiyonlar

*Chlamydia trachomatis* (C. trachomatis) ile gelişen genital sistem enfeksiyonları, dünya çapında kadınlarda en sık görülen cinsel yolla bulaşan hastalıktır. Yetersiz...

Chlamydia trachomatis, gram-negatif obligat hücre içi bir bakteridir. Göz veya genital traktus enfeksiyonlarına neden olan farklı klamidya serovarları bilinmektedir. Chlamydia trachomatis ile gerçekleşen genital traktus enfeksiyonları, dünya çapında en sık görülen cinsel yolla bulaşan hastalıklardır.Avrupa Birliği'nde 1990 ile 2009 yılları arasında bildirilen yaklaşık 3 milyon enfeksiyonla beraber görülmektedirler. 2009 yılında yaklaşık 400.000 vaka bildirilmiştir. Halk sağlığı ve cinsel eğitim sürekli gelişse de, yeni genital klamidyal enfeksiyonların oranının 1990'taki 70.000 vakadan 2009'daki 400.000 vakaya yükseldiği tespit edilmiştir.Yeni enfeksiyonların %75'inin 15 ile 24 yaş arasındaki gençlerde görüldüğü bildirilmektedir. Klinik sekellerin, patojenlerin yetersiz temizlenmesi nedeniyle meydana geldiği, bunun alt genital sistemden üst genital sisteme doğru çıkan enfeksiyonlara yol açabileceği ve sonuç olarak enfekte dokuda kronik inflamatuar hasara neden olabileceği düşünülmektedir. chlamydia tracheitis ile enfekte olan kadınların %10 ila %30'unda pelvik inflamatuar hastalık (PID) gelişmekte ve PID vakalarının %50'ye kadarı chlamydia tracheitis enfeksiyonlarına bağlanmaktadır.Sonuç olarak, tüpler kaynaklı infertiliteye sahip hastaların %50'sinde ve ektopik gebeliği olan hastaların %40'ında etken patojen olarak klamidya tespit edilmektedir. Enfekte olmamış sağlıklı bir kadında, döllenmiş yumurta fallop tüpleri aracılığıyla rahme göç eder ve burada doğuma kadar gelişir. Enfekte hastalarda ise klamidya, alt genital yoldan fallop tüplerine yükselerek kronik inflamatuar süreçleri tetikleyebilir.Patojenlerin tetiklediği epitel hücre hasarının ve merkezi epitel hücre fonksiyonlarının kaybının, nihayetinde yumurtalıkların uterusuna doğru gerçekleşen yumurta transportunun azalmasına veya tamamen ortadan kalkmasına yol açan tüp tıkanıklığına neden olduğu varsayılmaktadır. Bu amaçla, histerektomi ameliyatı geçiren kadınlardan insan fallop tüpleri toplanarak saklanır. Tüpler diseke edilir ve dikkatlice açılır.Deneysel düzeneğe göre, örnekler küçük parçalar halinde kesilir ve ilgili zaman noktalarından sonra 24 ila 48 saat boyunca enfeksiyöz chlamydia tracheitis elementer cisimleri ile enfekte edilir. Örnekler, daha sonraki hazırlık aşamasına kadar en az üç gün boyunca Monty fiksatifi ile fikse edilir. Histerektomi ameliyatı geçiren kadınlardan alınan insan fallop tüpleri HFT, cerrahi işlemden hemen sonra saklanır.Hazırlık aşamasına kadar dört derece santigrat sıcaklıkta, antibiyotik içermeyen %5 FCS'li RPMI içerisinde saklayın. Tüm işlem boyunca, antibiyotik içermeyen %5 FCS'li RPMI içeren bir Petri kabında insan fallop tüpünü disseke edin. Kurumayı önlemek için tüp besiyeri ile kaplı olmalı; bağ dokusu ve cerrahi sırasında zarar görmüş dokular kesilip atılmalıdır.Diseksiyon sonrası, HFT'yi küçük bir neşterle dikkatlice açın. Pens ve neşterin dikkatsiz kullanımıyla oluşabilecek doku hasarından kaçının. Enfeksiyon için beş çarpı beş milimetre boyutunda küçük doku parçaları hazırlayın; HFT örneğini antibiyotiksiz, %5 FCS içeren bir mililitre RPMI içerisinde saklayın ve C track ekleyin.OMAS elementer cisimcikli HFT örnekleri, normal bir inkübatörde 37 degrees Celsius, 5%CO2 ve 20%O2 koşullarında veya bir hipoksi odasında 5%O2'den daha düşük düşük oksijen ortamında 48 saate kadar inkübe edilir. İlgili inkübasyon sürelerinin sonunda örnekler toplanır ve SEM veya TEM hazırlığına kadar, transmisyon elektron mikroskopisi için Monty fiksatifinde dört degrees Celsius'ta en az üç gün boyunca saklanır. Fikse edilmiş doku küçük parçalar halinde kesilir, yıkanır ve gece boyunca 1%osse ve tetroxide ile inkübe edilir.Birkaç yıkama ve kurutma adımının ardından, dehidrate edilen numuneler taze hazırlanmış aite içine aktarılır ve 60 °C'de 48 saat boyunca polimerize edilir. Kırpma işleminin ardından, yarı ince ve ultra ince kesitler alınarak sırasıyla lamlara veya gridlere aktarılır. Boyama işleminden sonra, yarı ince kesitler transmisyon elektron mikroskobisi için ışık mikroskobu kullanılarak incelenebilir.Numuneyi Monty sabitleyicisinden çıkarın ve maksimum iki x iki x beş milimetrelik parçalara bölün. Yıkama, sodyum CCO dilate tamponu inkübasyonu, osmiyum tetroksit yıkaması, dehidrasyon ve artan konsantrasyonlarda etanol işlemlerinin ardından numuneyi %50 propilen oksit ve aite karışımına aktararak gece boyunca bekletin. Ertesi gün, en az bir saat süreyle taze hazırlanmış aite içerisine aktarın.Ardından düz kalıplara aktarın, aite ile doldurun ve aerd dite'nin 60 °C'de 48 saat boyunca polimerize olmasını sağlayın. Gömülü numunenin kenarlarını düzelttikten sonra, cam bıçak veya tercihen elmas bıçak donanımlı bir ultra mikrotom kullanarak yaklaşık 700 nanometre kalınlığında yarı ince kesitler veya 70 nanometre kalınlığında ultra ince kesitler alın. Numuneyi ışık ve transmisyon elektron mikroskobisi ile analiz etmek için yarı ince ve ultra ince kesitleri kullanın; taramalı elektron mikroskobisi için uygun işlemleri gerçekleştirin.Numuneler, epitel tabakası yukarı bakacak şekilde mantar plakalara iğnelenir, yıkanır ve artan konsantrasyonlarda aseton kullanılaraky dehidre edilir. Kritik nokta kurutucuda kurutulduktan sonra numuneler bir SEM numune tutucuya aktarılır ve bir sputter kaplayıcı kullanılarak platin, altın veya paladyum ile kaplanır. Ardından, taramalı elektron mikroskobu ile analiz edilmeye hazır hale gelirler.Numuneyi Monty sabitleyicisinden çıkarın ve doku parçasını, epitelyum yukarı bakacak şekilde bir mantar levha üzerine yerleştirip böcek iğneleriyle sabitleyin. Sodyum kalsiyum dilate tamponuyla yıkadıktan ve aseton işlemi uyguladıktan sonra numuneyi kritik nokta kurutucuda kurutun. Numuneyi mantar levhadan bir SEM numune tutucuya aktardıktan sonra, bir püskürtme kaplayıcı (sputter coater) kullanarak numuneye iletken platin altın veya paladyum kaplama yapın; kaplanan numuneyi ileri analizler için bir taramalı elektron mikroskobuna aktarın.Kadınlarda uterus enfeksiyonlarının yüksek insidansı ve asendan enfeksiyonların yol açtığı ciddi klinik sonuçlar, bu alandaki temel ve translasyonel araştırmaların yoğunlaştırılmasının gerekçelerini oluşturmaktadır. Fallop tüplerinde klamidya kaynaklı hücre hasarını morfolojik olarak karakterize etmek için St. Perus ve ekibi tarafından daha önce geliştirilen insan fallop tüpü ex vivo doku modelini kullandık. Bu yöntemin kullanımıyla, hem replike olan hem de persistan enfeksiyonlar görülerek, hücre içi inklüzyonların farklı gelişim evrelerindeki oluşumu gözlemlenmiştir.Bununla birlikte, insan fallop tüpü dokusunda kalıcı klamidyanın varlığına dair deneysel kanıtlar hâlâ eksiktir ve klamidya, progeniler ve persistans genlerinin transkripsiyonel artışı için daha fazla analiz gerektirmektedir. Bu modelin başlıca kısıtlamalarından biri, başlangıçtaki KLA glokomatöz enfeksiyona bağlı ikincil etkilerin analizini engelleyen inflamatuar hücrelerin yokluğudur. Yine de bu model, fallop tüpü epitelyal hücre hasarı bağlamında oksijen içeriği gibi çevresel koşulları analiz etmek ve akut glokomatöz enfeksiyona karşı başlangıç konakçı bağışıklık yanıtını incelemek için uygun görünmektedir.Gelecekteki amaçlardan biri, pH insan fallop tüpü doku modelinde CTU'ların MIC testi için daha ayrıntılı bir model oluşturmak ve iki foton lazer tarama Mikroskopi tekniğinden yararlanarak CLI'ların farklı gelişim aşamalarını metabolik olarak gerçekten tanımlamak için bu modeli kullanmaktır.

a-human-fallopian-tube-model-for-investigation-c-trachomatis

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Fallop tüpü (FT), seröz over kanseri (SOC) kökenli bir alternatif site olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol izolasyon için yeni bir yöntem açıklanır...

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Trichuris muris enfeksiyon dayanıklı farelerde koruyucu bir Th2 yanıtı oluşturmak ve duyarlı fareler patolojik bir Th1 yanıtı Th2 dokunulmazlık bağırsak modelidir.

Trichuris muris Enfeksiyon: Gut Tip 2 Bağışıklık ve İnflamasyon Bir Model

Kaynak: O'Brien, V. P. ve diğerleri, Tekrarlayan Escherichia coli Idrar Yolu Enfeksiyonu Gardnerella vaginalis mesane maruziyeti tarafından fare içinde tetikleniyor. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, önceden enfekte edilmiş bir fare modelinin mesane epitelinde bakteri kolonizasyonu ve konak-patojen etkileşimlerini görselleştirmek için taramalı elektron mikroskopisi kullanımını göstermektedir.

Bakteriyel Enfeksiyonun Görselleştirilmesi İçin Fare Mesanesi Dokusu Hazırlanması

Bu video, transüretral kateter damlatma yoluyla bir dişi fare mesanesinde üropatojenik Escherichia coli enfeksiyonunun oluşumunu göstermektedir. Enjekte edilen bakteriler, mesane içinde başarılı bir idrar yolu enfeksiyonu oluşturur ve idrar yolu ile ilgili sağlıkla ilişkili hastalıkları incelemek için değerli bir platform sağlar.

Erkek Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonu Modeli Oluşturmak için Transüretral Kateterizasyon ve Bakteriyel Aşılama

Dişi Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonu Modelinin Oluşturulması

Farelerin transüretral Kateterizasyon kurulan modeli mesane patolojiler, idrar yolu enfeksiyonu, dahil olmak üzere çalışma sağlar ancak yalnızca dişi içinde gerçekleştirilebilir. Burada anlatılan erkek transüretral korumak yeni bir model araştırma cinsiyetler arasında güçlü klinik ve epidemiyolojik farklarına iaretlenmi bir alanı sağlayacaktır.

İdrar yolu enfeksiyonu küçük bir hayvan modeli: erkek ve dişi farelerin transüretral Kateterizasyon

Yumurtalık kanseri erken teşhisinin bir aracı olarak fallop tüpünü direkt olarak cerrahi sonrası eksizyonu örnekleyerek bir tubal sitolojik yöntem araştırdık. Burada, yeni alınan cerrahi örneklerden fallop tüp hücreleri toplamak için bir protokol sunuyoruz.

Yumurtalık Kanseri Erken Teşhisi İçin Umut Verici Bir Araç Olarak Fallop Tüpünün Tubal Sitolojisi

Gizli hücre içi mesane rezervuarları oluşturmak için üropatojenik E. coli (UPEC) transüretral aşılamasının bir fare modeli ve tekrarlayan UPEC İYE'yi indüklemek için G. vajinalis'e mesane maruziyeti gösterilmiştir.  Ayrıca bakterilerin sayımı, idrar sitolojisi ve in situ mesane fiksasyonu ve taramalı elektron mikroskobu için işlenmesi de gösterilmiştir.

Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu

Bu protokol, insan fallop tüpü epitel hücrelerinin izolasyonu için bir günlük bir yöntemi tanımlar. İzole epitel hücreleri, 2 boyutlu (2D) kültürde kaplanabilir veya tek hücreli süspansiyonlara ayrılabilir ve akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi dahil olmak üzere aşağı akış deneylerinde kullanılabilir.

Tek Hücreli Analizler için İnsan Fallop Tüpü Epitelinin Çıkarılması İçin Etkili Bir Yöntem

Bu protokol, simüle edilmiş kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonlarında hem planktonik hem de biyofilm ile ilişkili bakteri hücre popülasyonlarını incelemek için kullanılabilen kateterize idrar yolunun in vitro bir modelini detaylandırır. Bu model, idrar yolu enfeksiyonlarını kontrol etmeyi amaçlayan antimikrobiyal ürünlerin etkinliğini incelemek için daha fazla kullanılabilir.

Kateter İlişkili İdrar Yolu Enfeksiyonunun İn Vitro Mesane Modeli

Bu protokol, in vitro ve in vivo olarak yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomu (HGSOC) fare modellerinin geliştirilmesini detaylandırır. Murin fallop tüpü organoidlerinin türetilmesinden, insan HGSOC genetiğini özetlemek için genetik modifikasyonlarından ve in vivo tümörlerin gelişimi için sinjeneik farelerin yumurtalık bursasına sokulmasından.

Yüksek Dereceli Seröz Over Karsinomu Modellemesi için Fallop Tüpü Epitel Hücrelerinden Fare Kaynaklı Organoid Hatların Geliştirilmesi

Keşfedin C. trachomatis enfeksiyonlarını insan fallop tüpü modeli kullanarak. Bu yöntem, bakteriyal patojenler ile insan fallop tüpü hücreleri arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için geliştirilmiştir.

Incelenmesi için İnsan Fallop Tüp Modeli

Daha fazla video keşfet