Incelenmesi için İnsan Fallop Tüp Modeli

Chlamydia trachomatis, gram-negatif obligat hücre içi bir bakteridir. Göz veya genital traktus enfeksiyonlarına neden olan farklı klamidya serovarları bilinmektedir. Chlamydia trachomatis ile gerçekleşen genital traktus enfeksiyonları, dünya çapında en sık görülen cinsel yolla bulaşan hastalıklardır.

Avrupa Birliği'nde 1990 ile 2009 yılları arasında bildirilen yaklaşık 3 milyon enfeksiyonla beraber görülmektedirler. 2009 yılında yaklaşık 400.000 vaka bildirilmiştir. Halk sağlığı ve cinsel eğitim sürekli gelişse de, yeni genital klamidyal enfeksiyonların oranının 1990'taki 70.000 vakadan 2009'daki 400.000 vakaya yükseldiği tespit edilmiştir.

Yeni enfeksiyonların %75'inin 15 ile 24 yaş arasındaki gençlerde görüldüğü bildirilmektedir. Klinik sekellerin, patojenlerin yetersiz temizlenmesi nedeniyle meydana geldiği, bunun alt genital sistemden üst genital sisteme doğru çıkan enfeksiyonlara yol açabileceği ve sonuç olarak enfekte dokuda kronik inflamatuar hasara neden olabileceği düşünülmektedir. chlamydia tracheitis ile enfekte olan kadınların %10 ila %30'unda pelvik inflamatuar hastalık (PID) gelişmekte ve PID vakalarının %50'ye kadarı chlamydia tracheitis enfeksiyonlarına bağlanmaktadır.

Sonuç olarak, tüpler kaynaklı infertiliteye sahip hastaların %50'sinde ve ektopik gebeliği olan hastaların %40'ında etken patojen olarak klamidya tespit edilmektedir. Enfekte olmamış sağlıklı bir kadında, döllenmiş yumurta fallop tüpleri aracılığıyla rahme göç eder ve burada doğuma kadar gelişir. Enfekte hastalarda ise klamidya, alt genital yoldan fallop tüplerine yükselerek kronik inflamatuar süreçleri tetikleyebilir.

Patojenlerin tetiklediği epitel hücre hasarının ve merkezi epitel hücre fonksiyonlarının kaybının, nihayetinde yumurtalıkların uterusuna doğru gerçekleşen yumurta transportunun azalmasına veya tamamen ortadan kalkmasına yol açan tüp tıkanıklığına neden olduğu varsayılmaktadır. Bu amaçla, histerektomi ameliyatı geçiren kadınlardan insan fallop tüpleri toplanarak saklanır. Tüpler diseke edilir ve dikkatlice açılır.

Deneysel düzeneğe göre, örnekler küçük parçalar halinde kesilir ve ilgili zaman noktalarından sonra 24 ila 48 saat boyunca enfeksiyöz chlamydia tracheitis elementer cisimleri ile enfekte edilir. Örnekler, daha sonraki hazırlık aşamasına kadar en az üç gün boyunca Monty fiksatifi ile fikse edilir. Histerektomi ameliyatı geçiren kadınlardan alınan insan fallop tüpleri HFT, cerrahi işlemden hemen sonra saklanır.

Hazırlık aşamasına kadar dört derece santigrat sıcaklıkta, antibiyotik içermeyen %5 FCS'li RPMI içerisinde saklayın. Tüm işlem boyunca, antibiyotik içermeyen %5 FCS'li RPMI içeren bir Petri kabında insan fallop tüpünü disseke edin. Kurumayı önlemek için tüp besiyeri ile kaplı olmalı; bağ dokusu ve cerrahi sırasında zarar görmüş dokular kesilip atılmalıdır.

Diseksiyon sonrası, HFT'yi küçük bir neşterle dikkatlice açın. Pens ve neşterin dikkatsiz kullanımıyla oluşabilecek doku hasarından kaçının. Enfeksiyon için beş çarpı beş milimetre boyutunda küçük doku parçaları hazırlayın; HFT örneğini antibiyotiksiz, %5 FCS içeren bir mililitre RPMI içerisinde saklayın ve C track ekleyin.

OMAS elementer cisimcikli HFT örnekleri, normal bir inkübatörde 37 degrees Celsius, 5%CO2 ve 20%O2 koşullarında veya bir hipoksi odasında 5%O2'den daha düşük düşük oksijen ortamında 48 saate kadar inkübe edilir. İlgili inkübasyon sürelerinin sonunda örnekler toplanır ve SEM veya TEM hazırlığına kadar, transmisyon elektron mikroskopisi için Monty fiksatifinde dört degrees Celsius'ta en az üç gün boyunca saklanır. Fikse edilmiş doku küçük parçalar halinde kesilir, yıkanır ve gece boyunca 1%osse ve tetroxide ile inkübe edilir.

Birkaç yıkama ve kurutma adımının ardından, dehidrate edilen numuneler taze hazırlanmış aite içine aktarılır ve 60 °C'de 48 saat boyunca polimerize edilir. Kırpma işleminin ardından, yarı ince ve ultra ince kesitler alınarak sırasıyla lamlara veya gridlere aktarılır. Boyama işleminden sonra, yarı ince kesitler transmisyon elektron mikroskobisi için ışık mikroskobu kullanılarak incelenebilir.

Numuneyi Monty sabitleyicisinden çıkarın ve maksimum iki x iki x beş milimetrelik parçalara bölün. Yıkama, sodyum CCO dilate tamponu inkübasyonu, osmiyum tetroksit yıkaması, dehidrasyon ve artan konsantrasyonlarda etanol işlemlerinin ardından numuneyi %50 propilen oksit ve aite karışımına aktararak gece boyunca bekletin. Ertesi gün, en az bir saat süreyle taze hazırlanmış aite içerisine aktarın.

Ardından düz kalıplara aktarın, aite ile doldurun ve aerd dite'nin 60 °C'de 48 saat boyunca polimerize olmasını sağlayın. Gömülü numunenin kenarlarını düzelttikten sonra, cam bıçak veya tercihen elmas bıçak donanımlı bir ultra mikrotom kullanarak yaklaşık 700 nanometre kalınlığında yarı ince kesitler veya 70 nanometre kalınlığında ultra ince kesitler alın. Numuneyi ışık ve transmisyon elektron mikroskobisi ile analiz etmek için yarı ince ve ultra ince kesitleri kullanın; taramalı elektron mikroskobisi için uygun işlemleri gerçekleştirin.

Numuneler, epitel tabakası yukarı bakacak şekilde mantar plakalara iğnelenir, yıkanır ve artan konsantrasyonlarda aseton kullanılaraky dehidre edilir. Kritik nokta kurutucuda kurutulduktan sonra numuneler bir SEM numune tutucuya aktarılır ve bir sputter kaplayıcı kullanılarak platin, altın veya paladyum ile kaplanır. Ardından, taramalı elektron mikroskobu ile analiz edilmeye hazır hale gelirler.

Numuneyi Monty sabitleyicisinden çıkarın ve doku parçasını, epitelyum yukarı bakacak şekilde bir mantar levha üzerine yerleştirip böcek iğneleriyle sabitleyin. Sodyum kalsiyum dilate tamponuyla yıkadıktan ve aseton işlemi uyguladıktan sonra numuneyi kritik nokta kurutucuda kurutun. Numuneyi mantar levhadan bir SEM numune tutucuya aktardıktan sonra, bir püskürtme kaplayıcı (sputter coater) kullanarak numuneye iletken platin altın veya paladyum kaplama yapın; kaplanan numuneyi ileri analizler için bir taramalı elektron mikroskobuna aktarın.

Kadınlarda uterus enfeksiyonlarının yüksek insidansı ve asendan enfeksiyonların yol açtığı ciddi klinik sonuçlar, bu alandaki temel ve translasyonel araştırmaların yoğunlaştırılmasının gerekçelerini oluşturmaktadır. Fallop tüplerinde klamidya kaynaklı hücre hasarını morfolojik olarak karakterize etmek için St. Perus ve ekibi tarafından daha önce geliştirilen insan fallop tüpü ex vivo doku modelini kullandık. Bu yöntemin kullanımıyla, hem replike olan hem de persistan enfeksiyonlar görülerek, hücre içi inklüzyonların farklı gelişim evrelerindeki oluşumu gözlemlenmiştir.

Bununla birlikte, insan fallop tüpü dokusunda kalıcı klamidyanın varlığına dair deneysel kanıtlar hâlâ eksiktir ve klamidya, progeniler ve persistans genlerinin transkripsiyonel artışı için daha fazla analiz gerektirmektedir. Bu modelin başlıca kısıtlamalarından biri, başlangıçtaki KLA glokomatöz enfeksiyona bağlı ikincil etkilerin analizini engelleyen inflamatuar hücrelerin yokluğudur. Yine de bu model, fallop tüpü epitelyal hücre hasarı bağlamında oksijen içeriği gibi çevresel koşulları analiz etmek ve akut glokomatöz enfeksiyona karşı başlangıç konakçı bağışıklık yanıtını incelemek için uygun görünmektedir.

Gelecekteki amaçlardan biri, pH insan fallop tüpü doku modelinde CTU'ların MIC testi için daha ayrıntılı bir model oluşturmak ve iki foton lazer tarama Mikroskopi tekniğinden yararlanarak CLI'ların farklı gelişim aşamalarını metabolik olarak gerçekten tanımlamak için bu modeli kullanmaktır.