Bio-Rad Total RNA Kiti Kullanarak Neuroprecursor Hücreler RNA Ekstraksiyon

Merhaba, ben University of California Irvine'deki Dr. Ed Maki'nin laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi olan Josh Sh. Bu BioRad RNA mini kiti kullanarak nöral öncül hücrelerden RNA'nın nasıl ekstrakte edileceğini size göstereceğim. Bu kiti birkaç yıldır bu laboratuvarda kullanıyorum ve her zaman yüksek verimlilikte tutarlı sonuçlar verdi.

Kullandığımız hücreler, embriyonik kortekslerden akut olarak dissosiye edilmiş E14.5 nöral öncül hücrelerdir ve bunları genellikle PD-L ve laminat kaplı, 24 kuyucuklu doku kültürü işlemine tabi tutulmuş bir plakaya, kuyucuk başına 100.000 hücre olacak şekilde ekiyoruz. Başlamadan önce, RNA çalışmalarınızı yaptığınız belirlenmiş bir tezgahta çalışmanız gerektiğini belirtmeliyim. İlk olarak, RNA tezgahınızın temiz olduğundan emin olun.

Tezgahı temizlemenin uygun yolu bu RNA zap'ı kullanmaktır. Temel olarak tüm RNA'ları yok eder; bunun nedeni, RNaz'ın temel olarak RNA'larınızı tahrip etmesidir. Diğer husus ise, ekstraksiyon işlemini gerçekleştirirken her zaman eldiven takmanızdır, çünkü cildiniz bu RNA'larla doludur.

Yani bu kesinlikle yapılmaması gereken bir şey. Tamam, burada BioRad total RA mini kiti var. İçeriğini çıkardım, hadi size neler olduğunu göstereyim.

İlk olarak, X dep C ile işlem görmüş PBS'ye ve %70 DEP ile işlem görmüş etanola sahibiz. İçine etanol eklenmiş toplam RNA lizis çözeltimiz var. İkincisi, içine %100 etanol eklenmiş düşük stringensli yıkama solüsyonu, yüksek stringensli yıkama solüsyonu, DNA dilüsyon çözeltisi, DNA'nın kendisi ve toplam RNA elüsyonu.

70 derecelik ısıtma bloğuna yerleştireceğimiz çözelti. İhtiyacımız olan diğer şeyler ise 1,5 ml kapaklı tüplerdir. Bunlar herhangi bir DNA veya RNA içermez, bu nedenle bu maddeleri içermeyen tüpler kullandığınızdan emin olun.

Ayrıca iki adet 2 mL'lik kapaksız tüpümüz var. Ve hepsinden önemlisi, RNA kolonlarının kendisidir. Bunlar olmadan RNA ekstraksiyonlarını gerçekleştiremezsiniz.

Bu nedenle, bu kolonları birleştirmek için RNA kolonu ve 2 ml'lik kapaksız tüpe ihtiyacınız vardır; bunları bu şekilde bir araya getirdiğinizde işlem için hazır olacaksınız. Tamam, ve her zaman ihtiyaç duyduğumuz son şey ise bu hücrelerdir. Buradaki hücreler, Eton ve bir buçuk nöral öncü hücreleridir.

Embriyonik kortekslerden akut olarak disosiye edildiler. Birkaç gün boyunca temel ortamda büyütüldüler. Hücreleri 37 °C'deki inkübatörden çıkardım.

Bu protokolle ilgili işlemler yapışkan hücrelere özgüdür. Bu hücreler, PDL ve laminat ile kaplanmış, doku kültürü işleminden geçmiş 0.4 kuyucuklu plaklarda büyütülmüştür. Şimdi bir vakum hortumu kullanarak medyumu çekeceğim.

Bir sonraki adım, yaklaşık 500 µL dep SEA PBS eklemektir. Burada da yine filtre uçlar kullanmak istiyoruz. PBS'nin temel işlevi, besiyerini yıkayıp uzaklaştırmaktır.

Böylece, RNA kolonunuza herhangi bir besiyeri bileşeninin girmesini veya RNA ekstraksiyonunuzu engellemesini istemezsiniz; aksi takdirde iyi verimler alamazsınız. Tamam mı? Nöral kök hücreler PBS'yi sevmediği için PBS'yi hızlıca aspire edeceğim. Şimdi her birine 350 µL liziz tamponu ekleyeceğim.

Tekrar, lizis tamponunun içinde beta-merkaptoetanol olduğundan emin olun. Şimdi, hücrelerin liz edildiğinden ve böylece RNA içeriğini dışarı çıkarabildiğimizden emin olmak için lizis tamponunu 15 kez pipetle yukarı aşağı çekeceğim.

Şimdi her bir kuyucuğa %70'lik etanol ekleyeceğim; bu %70'lik etanolden 350 µL ekledikten sonra, her kuyucukta 10 kez yukarı-aşağı pipetleme yapacağım. Her biri için 10 kez yukarı-aşağı pipetleme yaptım. Şimdi, her bir kuyucuğun toplam hacmi 700 µL olduğu için pipetimi 700 µL'nin üzerine ayarlayacağım.

Ardından, 700 µL'den fazla olan malzemeyi alıp bir RNA kolonuna aktaracağım. Kolon içeriğini ekledikten sonra santrifüje gidip tam hızda 30 saniye boyunca çevireceğim. Lizatın ilk 30 saniyelik santrifüj işleminin ardından, filtratı boş bir kaba dökerek uzaklaştıracağım.

Veya bazı kişilerin yaptığı gibi, bir vakum hortumu kullanarak süzüntüyü çekebilirsiniz. Ardından, 700 µL düşük stringensli yıkama tamponu ekleyeceksiniz. Ve tekrar, içine etanol eklediğinizden emin olun.

Şimdi bunu tam hızda 30 saniye boyunca santrifüj edeceğim. Düşük stringensli yıkama tamponunu santrifüj ettikten sonra süzüntüyü dökeceğim. Tamam mı? Ardından DNA çözeltisini hazırlayacağım.

Böylece her bir örneğe 5 µL DNA ekleyeceksiniz. Biz, tekrar belirtmek gerekirse, bir enzim olduğu için DNA'ları işlemlere başlamadan önce önceden alikotluyoruz.

Bunları alikotlar halinde saklamak daha iyidir. Eğer bütün olarak saklarsanız, dondurma ve çözme işlemi enzimatik aktiviteyi yok eder. Bu nedenle, 5 µL DNA ekledikten sonra, bunu 75 µL DNA seyreltme çözeltisi ile seyrelteceğim.

Bunu ekledikten sonra toplam hacim 80 µL DNA çözeltisi olacaktır. Şimdi, her bir örneğe 80 µL DNA çözeltisi ekleyeceğim. Çözeltinin kolonun membranına indiğinden emin olun.

Böylece DNA çözeltisinin membranı doyurmasını istersiniz. Böylece DNA'dan kurtulursunuz. Böylece RNA veriminizi artırırsınız.

DNA'ları ekledikten sonra, enzimin görevini yerine getirmesi için kolonu oda sıcaklığında 15 dakika bekleteceksiniz. Tekrar belirtmek gerekirse, 15 dakika boyunca inkübe edeceksiniz. Tamam, süre doldu.

15 dakikalık inkübasyonun ardından, santrifüje giderek DNA'ları tam hızda 30 saniye boyunca çöktüreceğim. Tamam, DNA'lardan kurtulmak için 30 saniye santrifüj yaptıktan sonra filtratı dökeceğim. Şimdi, kalıntı DNA'ları yıkayıp temizlemek için 700 µL yüksek stringensli tampon ekleyeceğim.

Ardından bunu ekledikten sonra, santrifüjde 30 saniye daha çevireceğim. Santrifüj işleminden sonra, yüksek stringensli filtratı bir kaba boşaltarak uzaklaştıracağım. Ardından 700 µL düşük stringensli tampon ekleyeceğiz.

Bu kez, Centri Beach'te tam hızda bir dakika boyunca santrifüj edeceğim. İlk bir dakikalık düşük stringensli yıkamadan sonra süzüntüyü dökeceğim. Ve bu sefer herhangi bir şey eklemeyeceğim, ancak fazla düşük stringensli kalıntıdan kurtulmak için tekrar iki dakika boyunca santrifüj yapacağım; çünkü düşük stringensli yıkama çözeltisi etanol içerir ve bu durum RNA veriminizi düşürecektir.

Şimdi elüsyon tamponunu 70 derecelik ısıtma bloğundan çıkaracağım. Hatırlatmak gerekirse, deneye başlamadan önce elüsyon tamponunun 70 derece olduğundan emin olun; RNA veriminizin etkinliğini artırmak için tamponu sıcak tutmak istiyoruz. Kolonlarım hazır.

Santrifüjde döndürüldüler. Bir sonraki adımda, kolonlar çıkarılır. Tamam, kap tüplerini atacağım ve bunları şu kap tüplerine aktaracağız.

Her bir kolona 50 µL Lucian tamponu ekleyeceksiniz. Tamponun membrana ulaştığından ve membran tarafından iyice emildiğinden emin olun. Aksi takdirde, yeterli RNA verimi elde edemezsiniz.

Şimdi, elüsyonun kolon membranına tamamen nüfuz etmesini sağlamak için kolonu bir veya iki dakika boyunca bekletin. Tamam, bir dakika doldu. Artık kolonu santrifüje götürebilirim.

Şimdi kolonları santrifüje yerleştireceğim. Bir dakika boyunca tam hızda döndüreceğim. Bu, elüe edilen kirleticiyi veya RNA'yı bu kapaklı tüplere toplayacağınız son santrifüj aşamasıdır.

Şimdi, son santrifüjden sonra içerikleri çıkarın, kolonu çıkarın, bunları atabilirsiniz, tüpü kapatın ve artık bunları -80 °C'de saklayabilirsiniz; daha sonra onlarla istediğiniz işlemi yapabilirsiniz. Böylece BioRad RNA kiti kullanarak RNA ekstraksiyonunu tamamlamış oldum. Şimdi ekstre ettiğimiz RNA'nın konsantrasyonunu ölçeceğim veya bir spektrofotometre kullanarak OD değerini okuyabiliriz.

Şimdi size göstereceğim işlem şudur. Öncelikle bir dilüsyon karışımı hazırlamamız gerekiyor. Bu, bire beş oranında bir dilüsyon olacaktır.

RNA'mızı ve sadece moleküler MQ filtrelenmiş suyu karıştıracağız. Bu yüzden önce bir boş kontrol hazırlayacağım. RNA'mızı daha önce elüe etmek için kullandığımız elüsyon çözeltisinden iki µL alacağım ve üzerine sekiz µL moleküler su ekleyeceğim. Tamam mı?

İşte boş örneğimiz bu. Şimdi numuneyi hazırlayacağım. İlgilendiğimiz RNA'dan 2 µL alacağız.

Tekrar 8 µL MQ su ekleyeceğiz. Böylece bu 1:5'lik bir dilüsyon olacak, değil mi? Numunelerimi yerleştireceğim şu kyvetim var ve bu kyveti spektrometreye yerleştireceğim.

Öyleyse hadi bunu ölçelim. RNA örneklerinin OD değerini ölçmeden önce küvetimi temizlemem gerekecek. Tekrar, işte cam küvet.

Ön kısmına asla dokunmamalısınız. Aksi takdirde üzerinde parmak izi bırakırsınız ve bu da yanlış ölçümler almanıza neden olur. Bu yüzden ilk olarak, cam küveti çift distile su ile yıkayacağım.

Ardından bir vakum hortumu kullanarak suyu çekeceğim. Bu yıkamanın ardından, %95 ethanol ile yıkayacağım ve ardından ethanolü uzaklaştırmak için tekrar bir vakum hortumu kullanacağım.

Şimdi kör örneğimi yüklemeye hazırım. Okumalarımızı normalize edebilmek için öncelikle kör örneğe ihtiyacımız var. Bu yüzden, az önce hazırladığımız karışımdan 10 µL alacağım.

Çözeltiyi aşağı yukarı hareket ettirerek iyice karıştıracağım. Ardından çözeltiyi şu spektrofotometreye götüreceğim. Bu cihaz Ultra Spec 3, 100 prob makinesidir ve burada RNA konsantrasyonunu ölçeceğiz.

Cihazı açın, numuneyi bu tutuculardan birine yerleştireceğiz. Programları, yalnızca RNA okuyacak şekilde düzenleyeceğiz. Tamam, tekrar belirtelim, bir ila beş oranında seyrelme işlemi yaptık.

Seyreltme faktörünü beşe ayarlamak istiyoruz. Tamam, hazırım. Şimdi, kör örneği referans almak için çalıştırma düğmesine basacağım.

Tamam, şu an sıfırlandı. Böylece örneğimizi ölçmeye hazırız. Şimdi cam anahtar yatağını çıkaracağım.

Boş örneğin içeriğini çekeceğim. Tekrar, çift distile su ile yıkayacağım. %5 etanol ile yıkayacağım.

Şimdi, ilgilendiğimiz örneğimizden 10 µL yüklemeye hazırım. Bu nedenle, örneğinizi karıştırdığınızdan tekrar emin olun. Ardından örneği cam kaba yükleyeceğiz.

Artık okumaya hazırız. OD değerini ölçtükten sonra, iyi bir verim ve saflık için RNA absorbans oranının 2,60 ile 2,80 arasında, yani yaklaşık 2 olması gerekir. Verim ise mililitrede yaklaşık 144 µg civarındadır.

Cihaz mil başına 72 mikrogram dese de, vetlerimizde uzunluğun yarıda olması nedeniyle bunu ikiyle çarpmamız gerekiyor, iki santimetrede nöro öncül hücrelerden RNA'nın nasıl ekstre edileceğini gösterdik. Tekrar belirtmek gerekirse, BioRad'in total mini RNA kitini kullanıyoruz. Diğer kitleri denedik ve verimliliğine dayanarak kullandığımız en iyi kit budur.

Bu durum, yüksek kalitede RNA elde edilmesini sağlar. Bu kiti kullandığınızda, her zaman elde ettiğimiz yüksek kaliteli sonuçları siz de alacaksınız.