Bio-Rad Total RNA Kiti Kullanarak Neuroprecursor Hücreler RNA Ekstraksiyon

Merhaba, ben University of California Irvine'deki Dr. Ed Maki'nin laboratuvarında lisansüstü öğrencisi olan Josh Sh. Bu BioRad RNA mini kiti kullanarak nöral öncül hücrelerden RNA'nın nasıl ekstrakte edileceğini göstereceğim. Bu kiti birkaç yıldır bu laboratuvarda kullanıyorum ve her zaman yüksek verimle tutarlı sonuçlar aldım.

Kullandığımız hücreler, embriyonik kortekslerden akut olarak disosiye edilmiş E14.5 nöro-prekürsör hücrelerdir; bunları genellikle PD L ve laminat kaplı, 24 kuyucuklu doku kültürü işlemeli bir plakaya, kuyucuk başına 100.000 hücre olacak şekilde ekiyoruz. Başlamadan önce, RNA çalışmalarınızı yaptığınız belirlenmiş bir tezgahta çalışmanız gerektiğini belirtmeliyim. İlk olarak yapılması gereken, RNA tezgahınızın temiz olduğundan emin olmaktır.

Tezgahı temizlemenin uygun yolu bu RNA zap ürününü kullanmaktır. Temel olarak, RA'nın RNA'ları yok etmesi nedeniyle tüm RNA'ları ortadan kaldırır. Diğer bir husus ise, cildiniz bu RNA'larla dolu olduğu için ekstraksiyon işlemi sırasında her zaman eldiven giyilmesidir.

Yani bu kesinlikle yapılmamalıdır. Tamam, burada BioRad total RA mini kiti var. İçindekileri çıkardım, gelin size neler olduğunu göstereyim.

İlk olarak, X dep C ile işlem görmüş PBS'ye ve %70'lik DEP ile işlem görmüş etanole sahibiz. İçine etanol eklenmiş total RNA lizis çözeltimiz mevcut. İkincisi, içine %100 etanol eklenmiş düşük stringensli yıkama çözeltisi, yüksek stringensli yıkama çözeltisi, DNA dilüsyon çözeltisi, DNA'ların kendisi ve total RNA elüsyonu.

Bu çözeltiyi 70 derecelik ısıtma bloğuna yerleştireceğiz. İhtiyacımız olan diğer malzemeler ise 1,5 ml'lik kapaklı tüplerdir. Bu tüpler DNA veya RNA içermemelidir, bu nedenle kullandığınız tüplerin bu maddelerden arındırılmış olduğundan emin olun.

Ayrıca iki adet 2 ml'lik kapaksız tüpümüz var. Ve hepsinden daha önemlisi RNA kolonlarının kendisidir. Bunlar olmadan RNA ekstraksiyonlarını gerçekleştiremezsiniz.

Bu kolonlarıle monte etmek için RNA kolonu ve 2 mL'lik kapsız tüpe ihtiyacınız vardır; bunları bu şekilde birleştirerek kullanıma hazır hale getirebilirsiniz. Tamam, son olarak her zaman ihtiyacımız olan şeyler bu hücrelerdir. Buradaki hücreler, Eton ve bir buçuk nöral öncü hücreleridir.

Embriyonik kortekslerden akut olarak disose edildiler. Birkaç gün boyunca DMEM ortamında büyütüldüler. Hücreleri 37 °C'lik inkübatörden çıkardım.

Bu protokol yapışkan hücreler için özeldir. Bu hücreler, PDL ve laminat ile kaplanmış, doku kültürü işleminden geçmiş 0,4 kuyucuklu plaklarda büyütülmüştür. Şimdi bir vakum hortumu alacağım ve besiyerini çekeceğim.

Bir sonraki adım, yaklaşık 500 µL dep SEA PBS eklemektir. Burada da yine filtreli uçlar kullanmak istiyoruz. PBS, temel olarak medyanın yıkanmasını sağlar.

Böylece RNA kolonunuza herhangi bir besiyeri bileşeninin girmesini veya RNA ekstraksiyonunuza müdahale etmesini istemezsiniz; aksi takdirde iyi verim alamazsınız. Tamam mı? Nöral kök hücreler PBS'yi sevmediği için PBS'yi hızlıca aspire edeceğim. Şimdi her birine 350 µL lizis tamponu ekleyeceğim.

Tekrar, lizis tamponuna beta-merkaptoetanol eklediğinizden emin olun. Şimdi, hücrelerin liz olduğunu ve RNA içeriğinin dışarı çıkabildiğini garanti etmek için lizis tamponunu 15 kez pipetle aşağı yukarı çekerek karıştıracağım.

Şimdi her kuyucuğa %70'lik etanol ekleyeceğim; 350 µL %70'lik etanol ekledikten sonra her kuyucukta 10 kez yukarı-aşağı pipetleme yapacağım. Her kuyucuk için 10 kez yukarı-aşağı pipetleme yaptım. Şimdi, her kuyucuğun toplam hacmi 700 µL olduğu için pipetimi 700 µL'nin üzerine ayarlayacağım.

Ardından, 700 µL üzerindeki sıvıyı alıp bir RNA kolonuna aktaracağım. Kolonun içeriğini ekledikten sonra, santrifüje gidip maksimum hızda 30 saniye boyunca döndüreceğim. Lizatın ilk 30 saniyelik santrifüj işleminden sonra, filtratı boş bir kaba boşaltarak atacağım.

Veya bazı kişilerin yaptığı gibi, bir vakum hortumu kullanarak filtratı çekebilirsiniz. Bir sonraki adımda, 700 µL düşük stringensli yıkama tamponu ekleyeceksiniz. Ve yine, içerisine etanol eklediğinizden emin olun.

Şimdi bunu 30 saniye boyunca tam hızda santrifüj edeceğim. Düşük stringensli yıkama tamponunu santrifüj ettikten sonra filtratı dökeceğim. Tamam mı? Ardından DNA solüsyonunu hazırlayacağım.

Böylece her örnek için beş mikrolitre DNA ekleyeceksiniz. Biz, bu işleme başlamadan önce DNA'ları önceden aliquotlara ayırıyoruz çünkü tekrar belirtmek gerekirse, bu bir enzimdir.

Bunları alikotlar halinde saklamak daha iyidir. Bütün olarak saklarsanız, dondurma ve çözme işlemi enzimatik aktiviteyi yok edecektir. Bu nedenle, beş µL DNA ekledikten sonra, bunu 75 µL DNA dilüsyon çözeltisi ile seyrelteceğim.

Bunu ekledikten sonra, toplam hacim 80 µL DNA çözeltisi olacaktır. Şimdi, her bir örneğe 80 µL DNA çözeltisi ekleyeceğim. Çözeltinin kolonun membranına ulaştığından emin olun.

Böylece DNA çözeltisinin membrana nüfuz etmesini istersiniz. Böylece DNA'dan kurtulmuş olursunuz. Böylece RNA veriminizi artırırsınız.

DNA'ları ekledikten sonra, enzimin görevini yapabilmesi için kolonu oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Tekrar hatırlatmak gerekirse, 15 dakika inkübe edeceksiniz. Tamam, zamanlayıcı çaldı.

15 dakikalık inkübasyonun ardından, santrifüje geçip DNA'ları tam hızda 30 saniye boyunca çöktüreceğim. Tamam, DNA'lardan kurtulmak için 30 saniye döndürdükten sonra filtratı dökeceğim. Şimdi, kalıntı DNA'ları temizlemek için 700 µL yüksek stringensli tampon ekleyeceğim.

Ardından bunu ekledikten sonra, santrifüjde 30 saniye daha döndüreceğim. Döndürme işlemi bittikten sonra, yüksek stringanslı filtratı bir kaba boşaltarak uzaklaştıracağım. Ve ardından 700 µL düşük stringanslı tampon ekleyeceğiz.

Bu kez, Centri Beach'te tam hızda bir dakika boyunca santrifüj edeceğim. Dolayısıyla, ilk bir dakikalık düşük stringensli yıkamadan sonra filtratı dökeceğim. Ve bu sefer hiçbir şey eklemeyeceğim, ancak ekstra düşük stringensli kalıntıları uzaklaştırmak için tekrar iki dakika boyunca santrifüj edeceğim; çünkü düşük stringensli yıkama çözeltisinin içinde bir miktar etanol bulunur ve bu durum RNA veriminizi düşürür.

Şimdi elüsyon tamponunu 70 derecelik ısıtma bloğundan çıkaracağım. Hatırlatmak gerekirse, deneye başlamadan önce elüsyon tamponunun 70 dereceye ulaştığından emin olun; RNA veriminin etkinliğini artırmak için tamponu sıcak tutmak istiyoruz. Kolonlarım hazır.

Santrifüjde döndürme işlemi tamamlandı. Bir sonraki adımda, kolonları çıkarıyorlar. Tamam, kap tüplerini atacağım ve onları şu kap tüplerine aktaracağız.

Her bir kolona 50 µL Lucian tamponu ekleyeceksiniz. Tamponun membrana ulaştığından ve membran tarafından iyice emildiğinden emin olun. Aksi takdirde, iyi bir RNA verimi elde edemezsiniz.

Şimdi, elüsyonun kolon membranına tamamen emildiğinden emin olmak için kolonu bir veya iki dakika bekletin. Tamam, bir dakika doldu. Artık kolonu santrifüje götürebilirim.

Şimdi kolonları santrifüje yerleştireceğim. Tam hızda bir dakika boyunca döndüreceğim. Bu, elüye pollutant'ı veya RNA'yı bu kapaklı tüplere toplayacağınız son santrifüj adımıdır.

Şimdi, son santrifüjden sonra içerikleri çıkarın, kolonu yerinden ayırın, kolonu atabilirsiniz, tüpü kapatın ve artık bunları -80 °C'de saklayabilirsiniz; daha sonra onlarla istediğiniz işlemi yapabilirsiniz. BioRad RNA kiti kullanarak RNA ekstraksiyonunu tamamladım. Şimdi ekstrakte ettiğimiz RNA'nın konsantrasyonunu ölçeceğim veya bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğunu (OD) okuyabiliriz.

Şimdi size göstereceğim işlem şu şekildedir. Öncelikle bir dilüsyon karışımı hazırlamalıyız; bu, 1'e 5 oranında bir dilüsyon olacaktır.

RNA'mızı ve sadece moleküler MQ filtrelenmiş suyu karıştıracağız. Bu yüzden önce bir boş kontrol (blank) hazırlayacağım. RNA'mızı daha önce elüe etmek için kullandığımız elüsyon çözeltisinden iki mikrolitre alacağım ve üzerine sekiz mikrolitre moleküler su ekleyeceğim. Tamam mı?

İşte boş örneğimiz bu. Şimdi numuneyi hazırlayacağım. İlgilendiğimiz RNA'dan 2 µL alacağız.

Yeniden sekiz mikrolitre MQ su ekleyeceğiz. Böylece bu, bir beşe bir dilüsyon olacak, değil mi? Örneklerimi içine koyacağım bu küvetim var ve bu küveti spektrometreye yerleştireceğim.

Hadi bunu ölçelim. RNA örneklerinin OD değerlerini ölçmeden önce küvetimi temizlemem gerekecek. İşte burada cam küvet var.

Ön kısmına asla dokunmak istemezsiniz. Böylece üzerinde herhangi bir iz bırakmazsınız, aksi takdirde bana yanlış ölçümler verir. Bu nedenle, ilk olarak cam küveti çift distile su ile yıkayacağım.

Ardından bir vakum hortumu alacağım. Suyu çekip çıkaracağım. Bu yıkama işleminden sonra, %95 etanol ile yıkayacağım ve ardından etanolü uzaklaştırmak için tekrar vakum hortumu kullanacağım.

Şimdi kör örneğimi yüklemeye hazırım. Okumalarımızı normalize etmek için öncelikle kör örneğe ihtiyacımız var. Bu yüzden, az önce hazırladığımız karışımdan 10 µL alacağım.

Şimdi çözeltimizi aşağı yukarı karıştırarak homojen bir karışım elde edeceğim. Ardından çözeltiyi bu spektrofotometreye götüreceğim. Bu cihaz Ultra Spec 3, 100 prob makinesidir ve burada RNA konsantrasyonunu ölçeceğiz.

Cihazı açın, örneği bu tutuculardan birine yerleştireceğiz. Programları sadece RNA okuyacak şekilde ayarlayacağız. Tamam, tekrar belirtelim, 1'e 5 oranında bir dilüsyon yaptık.

Seyreltme faktörünü beşe ayarlamak istiyoruz. Tamam, hazırım. Boş örneği referans almak için çalıştırma düğmesine basacağım.

Tamam, şu an sıfırlandı. Artık numunemizi ölçmeye hazırız. Bu yüzden cam tabanı çıkaracağım.

Boşluktaki içeriğile çekeceğim. Ardından, tekrar çift distile su ile yıkayacağım. Son olarak %5 etanol ile yıkayacağım.

Şimdi, ilgili örneğimizden 10 µL yüklemeye hazırım. Bu nedenle, örneğinizi karıştırdığınızdan tekrar emin olun. Ardından örneği cam küvete yükleyeceğiz.

Şimdi okumaya hazırız. OD ölçüldükten sonra, iyi bir verim ve saflık için RNA absorbans oranının 260/280'in 2 civarında olması gerekir. Verim ise yaklaşık 144 µg/mL'dir.

Cihaz mil başına 72 mikrogram dese de, vetlerimizin yarım uzunluğu nedeniyle bunu ikiyle çarpmamız gerekiyor, iki santimetre nöral öncül hücrelerden RNA'yı nasıl ekstrakte edeceğinizi gösterdi. Tekrar, BioRad'den total mini RNA kitini kullanıyoruz. Diğer kitleri denedik ve verimliliğine dayanarak kullandığımız en iyi kit budur.

Bu, yüksek kalitede RNA elde etmenizi sağlar. Bu kiti kullandığınızda, her zaman elde ettiğimiz yüksek kaliteli sonuçları siz de alacaksınız.