Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

FollowMe deneyinin genel amacı, çok sayıda nörondan gelen sinirsel ani yükselme aktivitesini kaydetmektir. Bu, ilk adımda floresan mikroskobu kullanılarak her bir aksiyon potansiyeli ile ilişkili bir nöron somasındaki hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki artışın gözlemlenmesiyle elde edilir. 40 nöron somato'dan gelen kalsiyum floresan sinyallerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle kaydetmek için iki foton uyarımı ve rastgele erişim tarama prensibi kullanılır.

İkinci adımda, bir evrişim algoritması kullanılarak floresan sinyallerinden kesin ani yükselme zamanlamaları çıkarılır. Bu teknik, onlarca nörondan gelen ani aktiviteyi kaydetmek için kullanılabilir. Sivri uçlu veriler daha sonra karşılıklı bilgileri, nöronal popülasyonlar arasındaki sinyal yayılımını veya nöro korelasyonları ölçmek için kullanılabilir.

Bu tekniğin mikro elektrot kayıtları gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yerel bir popülasyondan çok sayıda nörondan nöron spiking aktivitesinin kaydedilebilmesidir. Bu yöntem, korelasyonların önemi, bilgi arayışı ve kortiko plastisite ile ağ dinamiklerindeki değişiklikler gibi, yerel nöron ağları düzeyinde kortikal fonksiyonla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: İki foton uyarımı için, femtosaniye darbeli bir kızılötesi darbeli lazer sistemi kullanılır. Sistemin optik bileşenlerinin neden olduğu büyük kayıpları dengelemek için yüksek bir lazer çıkış gücü gereklidir.

İki prizmadan oluşan sistem başına bir vaiz, AOD'ler tarafından tanıtılan zamansal dağılımı telafi etmek için custo optik deflektörlerden önce lazer darbelerine negatif bir grup hızı dağılımı verir, geniş açıklıklara sahip iki AOD, lazer ışınını iki boyutta saptırır. AOD'ler tarafından ortaya çıkan uzamsal dağılımı telafi etmek için milimetre başına 100 oluk ile yansıtıcı bir kırınım derecelendirmesi, AOD'lerin 13 santimetre arkasına yerleştirilir. Kısa lazer darbeleri kullanılırken, lazer ışını iki röle teleskopu ile dik bir mikroskobun kamera portuna yönlendirilir.

Optik bileşenlerin hizalanması için süsenler düzenli aralıklarla yerleştirilir. Objektifin önündeki bir dikroik ışın ayırıcı, kızılötesi uyarma ışığını numuneye iletir ve numuneden gelen floresan ışığını bir dedektöre yansıtır. Epi ve trans floresan dedektörler, objektif aracılığıyla floresan sinyalini toplar ve uyarma ışığının dedektörlere ulaşmasını önlemek için kondenser renkli cam filtreler dedektörlerin önüne yerleştirilir.

A OD sapma açıları, voltaj kontrollü osilatörleri çalıştıran bir dijital analog dönüştürücü kartı ile donatılmış bir bilgisayar tarafından kontrol edilir. Fotoğraf çarpanlarından gelen sinyal, 100 kilohertz'lik bir kesme frekansına sahip düşük geçişli bir Butterworth filtresinden geçirilir ve analiz için bir bilgisayarda saklanmadan önce 156.25 kilohertz saat hızında bir analog dijital dönüştürücü tarafından sayısallaştırılır, hizalama ve elektriksel gürültü, foto çarpanların düşük ve yüksek kazancında lazer ışıklı ve lazer ışıksız floresan sinyallerin dağılımı kaydedilerek test edilir, Göstergeli ve göstergesiz olduğu gibi, titrek rastgele erişim taraması, kalsiyumdaki hücre içi artışların saptanmasına dayanır. Protokoldeki ilk adım, bolus enjeksiyonu ile çok sayıda nöronu bir kalsiyum indikatörünün Esther formu ile boyamaktır.

Daha sonra, her bir nörondaki soma aktivitesini her bir yerde 6.4 mikrosaniye boyunca dört yerde kaydedin. İlgilenilen nöronları seçmek için 256 x 256 pikselden oluşan tam bir çerçeve elde edin. Daha sonra bu görüntüde kaydedilecek nöronların merkezlerini manuel olarak seçin.

Her merkezin etrafında iki mikron uzaklıktaki üç nokta, her döngüde kontrol yazılımı tarafından otomatik olarak eklenir. Floresan sinyal, 40 nöronun tamamındaki dört yerden kaydedilir. Bir döngüde tüm nöronlardan kayıt yapmak 1.536 milisaniye gerektirir.

40 nöronun tümünün bu sıralı kaydını beş saniye boyunca tekrarlayın. Floresan somatik kalsiyum sinyallerinden ani yükselme tespiti, yüksek bir sinyal-gürültü oranına dayanır. Uyarma yoğunluğu artırılarak yüksek bir sinyal-gürültü oranı elde edilebilir.

Bununla birlikte, uyarma yoğunluğu, fotoğraf hasarı nedeniyle yalnızca belirli bir sınıra kadar artırılabilir. Kaydedilen sinyallerin yüksek ani yükselme algılama penceresi içinde olduğundan emin olmak için fotoğraf hasarının düşük olduğu ve sinyal-gürültü oranının tek sivri uçları algılamak için yeterli olduğu çok küçük bir uyarma yoğunluğu penceresi vardır. Bir deney sırasında, laboratuvarımız tarafından geliştirilen bir dizi çevrimiçi analiz yazılımı kullanılır.

Daha sonra, yaklaşık 100 ila 200 milisaniyelik kısa bir temel gürültü penceresinden nöron başına yaklaşık foton oranını hesaplayın. Foton sayısı ve foton hızı, bağıl floresan değişikliklerinin dağılımına bu denklem uydurularak floresan değerlerinden hesaplanır, ardından aynı zaman penceresinden temel floresanı hesaplar ve bunu zamanın veya denemelerin bir fonksiyonu olarak çizer. Lazer gücünü ayarlayarak taban çizgisinin ortalama düşüşünü saniyede 0,0002'nin altında tutun.

Çünkü bu sınır aşıldığında ani artış algılaması hızla azalır. Bundan sonra, tam kare bir görüntü elde ederek her 10 ila 20 dakikada bir nöron somatik pozisyonlarını doğrulayın. Gerekirse kayıt konumlarını ayarlayın.

Nöral aktiviteden kaynaklanan floresan sinyalleri, kalsiyumun uzun süre bozulması nedeniyle genellikle zamanla yedi. Bu prosedürde, floresan sinyallerden ani yükselme ve ani yükselme zamanlamaları için bir evrişim giderme yöntemi kullanılır. Burada, kaydedilen floresan sinyaline uyan en olası spike tren modelini belirlemek için genetik bir algoritma kullanıyoruz.

Algoritmanın her yinelemesinde, maksimum olasılık, floresan kayıtlarının gürültüsü tarafından verilen maksimum olasılığına asimptotik olarak yaklaşır. Homojen nöron popülasyonlarında, spike ile uyarılan kalsiyum sinyali nöronlar arasında farklılık gösterebilir. Büyük veri kümelerinin denetimsiz analizi için, çok sayıda yanlış pozitif algılamayı önlemek için nörondan nörona ani uyarılmış kalsiyum sinyalinin değişimini hesaba katan bir algoritma tasarladık.

Tek spike uyarılmış kalsiyum geçici genliğinin ve bozunma zaman sabitinin ortak dağılımı, aynı deney koşulları altında aynı tip nöronlardan ayrı bir deney setinde kaydedilir. Yavaş temel değişiklikleri hesaba katmak ve decon'un hesaplama maliyetlerini azaltmak için, daha uzun kayıtlar her bir nöron için bir ila beş saniyelik birkaç kısa ize bölünür her kayıtta, dekonvolüsyon algoritması çok sayıda modeli test edebilir Dekonvolüsyonu hızlandırmak için 1 milyon farklı model veya daha fazlası Bir deney de 10 farklı bilgisayarda dolambaçlıdır. Paralel olarak.

Dekonvolüsyondan sonra, spike verileri analiz edilir ve incelenir. Peri uyaran zamanı, histogram, ani yükselme olasılığı ve nöron ateşleme hızı otomatik bir şekilde hesaplanır. Algılama penceresi içinde çok düşük uyarma hızında ve diğeri çok yüksek uyarma hızında kaydedilen bir floresan sinyalinin örnekleri aşağıda verilmiştir.

Her örneğin bir ani artışa verilen yanıtı gösterdiğini unutmayın. Burada gösterilen, akut bir beyin diliminin ve aynı kortikal kolona yerleştirilmiş iki stimülasyon pipetinin bir fotoğraf mikrografıdır. Dördüncü katmanda, bunlar tekrarlayan uyaranlar için sinirsel tepkileri gösterir ve bu grafik, kaydedilen nöron popülasyonu tarafından işaret edilen Shannon'un karşılıklı bilgisini gösterir.

İşte farklı kortikal nöron popülasyonları arasındaki süper eşik sivri aktivitesinin yayılımının ölçümü. Bunlar, kortikal nöronlarda tespit edilen sivri uçlar, tal kortikal liflerin elektriksel stimülasyonuna yanıttır. Rastgele erişim taraması kullanarak nöronal aktiviteyi kaydederken, algılama penceresi içinde kayıt yapmak çok önemlidir.

Aksi takdirde, kullanılamaz veri kümeleriyle sonuçlanmak çok kolaydır. Optik sivri uç tespiti henüz emekleme aşamasındadır. İyileştirme için çok yer var.

Bazı iyileştirmelerle, daha da fazla nörondan kayıt yapıyoruz. Diğer iyileştirmelerle, uyanık ve davranan hayvanlarda bile kayıt yapabileceğiz.