Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

Biz fare önbeyin nöronal göç gerçek zamanlı videoimaging için bir protokol açıklar. Viral etiketli veya aşılı nöronal öncüllerinin göç durağan ve göç fazlarının süreleri ve hız gibi hücre göçü farklı evreleri, incelemek için nispeten hızlı toplama aralığı ile geniş alan floresan görüntüleme kullanarak akut canlı dilim kaydedildi göç.

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin farenin dört beyninin akut dilimlerinde Nöroblast göçünü incelemektir. Bu, ilk olarak nöroblast etiketlemesinden beş ila sekiz gün sonra yetişkin subventriküler bölgedeki nöronal öncülleri etiketleyerek, farenin beyin için akut dilimlerini hazırlayarak gerçekleştirilir. Daha sonra, nöroblast göçünün hızlandırılmış görüntülemesi gerçekleştirilir.

Sonuç olarak, akut dilimlerde nöroblast göçünün dinamiklerini göstermek için geniş alan gerçek zamanlı mikroskopi kullanılır. Bu yöntem, hücre göçünü içeren farklı moleküler ipuçlarının ve hücresel mekanizmanın rolünü inceleyerek nöronal gelişim alanındaki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Şimdi bu yöntem, bir yetişkinde beyin için nöral göçü düzenleyen fizyolojik süreçler hakkında fikir verebilir, ancak aynı zamanda iskemik beyinde ve embriyonik gelişim sırasında nöral göçü incelemek gibi diğer sistemlerde de uygulanabilir.

Bu prosedüre, dilimleri kesmek için sükroz bazlı bir yapay beyin omurilik sıvısı ve dilimleri görüntülemeye kadar korumak için 32 santigrat derece sodyum klorür bazlı bir BOS hazırlayarak başlayın, ardından çözeltileri sürekli olarak %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürterek oksijenlendirin. Daha sonra, fareyi enternal ketamin ksilazin kullanarak floresan olarak işaretlenmiş nöroblast ile uyuşturun. Ardından, sıvı nitrojen kullanarak jöle benzeri bir görünüme sahip buz gibi soğuk kesme solüsyonunu hızlı bir şekilde hazırlayın.

Bundan sonra, 20 cc'lik bir şırınga ile 15 ila 20 mililitre buz gibi soğuk kesme solüsyonu alın ve fareyi Cardi'ye perfüze edin. Kesme solüsyonu ile perfüze etmek yerine kan damarlarının etiketlenmesi gerekiyorsa, mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda 200 mikrolitre dekstran Texas kırmızısı enjekte edin, Cardi'yi kalbin sol ventrikülüne trans edin ve trans kardiyal perfüzyonu takiben farenin başını kesmeden önce iki ila üç dakika bekleyin, farenin başını hızla çıkarın, kafayı buz gibi soğuk kesme solüsyonuna daldırın ve vibratoya taşıyın. Kafatasını, beyincikten koku soğancığına kadar sagital sütür boyunca makasla kesin.

Daha sonra, bir çift forseps kullanarak kraniyal flepleri nazikçe çıkarın Daha sonra, bir neşter kullanarak beynin küçük kısmını eksize edin. Daha sonra her yarım kürenin en yan kısmında iki sagital kesim yapın ve beyni hemisfer içi fissür boyunca kesin. Ardından bir spatula kullanarak beyni nazikçe çıkarın ve buz gibi Soğuk kesme solüsyonuna koyun.

İki yarım küreyi, sırt tarafı agar'a değecek şekilde %4'lük bir agar bloğuna ayrı ayrı yerleştirin. Daha sonra, iki yarım kürenin yanal olarak kesilmiş tarafı ile bloğu, medial tarafı yukarı bakacak şekilde bir Vibram platformuna yapıştırın. Bundan sonra, platformu Vibram odasına yerleştirin.

Kesme solüsyonu ile doldurun. Daha sonra çözeltiyi %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürterek dilim hazırlığı boyunca oksijenli tutun. Şimdi vibratör ile 250 mikron kalınlığındaki bölümleri hazırlayın.

Yüksek kaliteli kesitler elde etmek için düşük kesme hızı ve yüksek frekanslı bıçak titreşimi kullanılmalıdır. Bıçaktan bir dilim çıkar çıkmaz, onu kesme solüsyonundan nazikçe çıkarın ve bir su banyosunda 32 santigrat derecede tutulan oksijenli A BOS ile dolu bir inkübasyon odasına yerleştirin. Bu prosedürde, görüntüleme sırasında dilimin sürüklenmesini önlemek için dilimi mikroskobun görüntüleme odasına dikkatlice yerleştirin.

Üstüne dikkatlice naylon bir ağ yerleştirerek sabitleyin. Dilimin sürekli olarak A CSF ile perfüze edildiğinden emin olun. Ardından, bir ilgi alanı bulmak için 10 x'lik bir hedef kullanın.

Metamorf yazılımını açın ve naylon ağın görüntüleme alanını engellemediğinden emin olun. Ardından 40 x objektifi devreye sokun ve odağı ayarlayın. Hedef ile dilim arasında yeterli çözüm olduğundan emin olun.

Metamorph yazılımını kullanarak, uyarma süresi, Z düzlemlerinin sayısı, her bir Z bölümü arasındaki mesafe, zaman aralığı ve kayıt süresi gibi hızlandırılmış çekim parametrelerini ayarlayın. Ardından hızlandırılmış alıma başlayın. Veriler Metamorph tarafından otomatik olarak bir tiff dosyası olarak kaydedilir Her dosya, elde edilen hızlandırılmış videonun bir zaman noktasına karşılık gelir, filmi Mrs.Load'da açmak için,

videonun ilk zaman noktası görüntüsünü program simgesine sürükleyip bırakarak elde edilen görüntüleri yükleyin. Film yüklendikten sonra, ekran ayarlama penceresinde sinyalin parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Alınan videonun voksel boyutu ve görüntü özelliklerindeki zaman aralığı gibi parametrelerini ayarlayın ve eşit uzaklıktaki zaman noktaları pencerelerini ayarlayın.

Voksel boyutunu belirledikten sonra, kaydedilen hücreleri otomatik olarak izlemek için çerçeveyi 3D olarak ve videonun zamanını ve ölçeğini görmek mümkündür. Noktalar işlevini seçerek aşma penceresindeki alandaki her hücre için bir nokta oluşturun, dilim penceresinde izlenecek hücrenin çapını ölçün. İzleme için parametreleri ayarlayın ve devam edin.

Algılanan nesnelerin zaman içindeki güvenilirliğini inceleyin. Taşınan tüm hücreler otomatik olarak algılanmazsa, algılama eşiğini değiştirin ve tüm hücrelerin tüm zaman noktalarında noktalarla seçildiğinden emin olun. Programın zaman noktalarını bağlayabilmesi için, aynı parkurun komşu zaman noktalarını temsil eden iki nokta arasındaki maksimum mesafe ve maksimum boşluk boyutu belirtilmelidir.

Parçalar oluşturulduktan sonra, bunları filtrelemek ve alakasız parçaları basitçe silerek kaldırmak mümkündür. Parçalar, tüm düzeltmeler yapılır yapılmaz farklı izlere ve aynı parçanın farklı zaman noktalarına bağlanarak ve bağlantısı kesilerek düzeltilebilir. Parçalara son bir kez bakın ve zaman noktası başına hücre yer değiştirmesi, iz uzunluğu, yer değiştirme uzunluğu ve iz süresi dahil olmak üzere verileri bir Excel dosyasına aktarın.

Bu video, dekstran, Teksas kırmızı etiketli kan damarları boyunca yeşil Neuroblast göçünün hızlandırılmış görüntülemesini göstermektedir. Göç eden nöroblastın, göç fazları durağan dönemlerle kesintiye uğradığında tuzlanma davranışı gösterdiğine dikkat edin. Ve bu video, nöroblast göçünün imas yazılımı tarafından izlenmesini göstermektedir.

Küreler ve çizgiler, sırasıyla tek tek hücreler için hücre gövdelerini ve göç yollarını gösterir. Bu prosedürü denerken, yetişkin fare ön beyninin kaliteli akut yaşam dilimlerinin elde edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Ek olarak, görüntüleme sırasında dilimin sürüklenmesini önlemek için dikkatli bir şekilde naylon bir ağ yerleştirilerek dilimler görüntüleme odasında iyi bir şekilde stabilize edilmelidir.

BOS perfüzyon hızındaki herhangi bir değişiklik, düzensiz perfüzyon veya sıcaklıktaki şiddetli değişiklik, görüntüleme sırasında odak düzleminde sürüklenmeye ve değişikliklere neden olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akut yetişkin dilimlerinde nöroblast göçünün nasıl kaydedileceğini ve analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Migrasyon ve durağan fazların başlangıcını ve bitişini güvenilir bir şekilde belirlemek için 15 ila 30 saniye arasında kısa doktor aralığı kullanmanızı öneririz.