Name: Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Öğrenin, yetişkin fare önbeyin akut dilimlerinde geniş alanlı floresan görüntüleme ile nöroblast göçünü gerçek zamanlı izlemeyi. Bu yöntem, nöron gelişimi ve hücre göç mekanizmalarını anlamak için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Université Laval burs tarafından desteklenmiştir ASJK için Sağlık Araştırması (CIHR) hibe Kanadalı Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. AS Postnatal nörogenez bir Kanada Araştırma Başkanı sahibidir.

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Kaneko, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
<li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+neuronal+migration+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li>
<li>Snapyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
<li>Lledo, P. M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+new+neurons+into+the+adult+olfactory+bulb%3A+joining+the+network%2C+life-death+decisions%2C+and+the+effects+of+sensory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience.</a> Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).</li>
<li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+release+and+uptake+regulate+neuronal+precursor+migration+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li>
<li>Martini, F. J., Valdeolmillos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+contraction+at+the+cell+rear+drives+nuclear+translocation+in+migrating+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).</li>
<li>Murase, S., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Bovetti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+scaffold+for+neuroblast+migration+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Uygun beyin bölgelerine nöronal öncüllerinin doğru hedefleme nöral devrelerin düzgün montaj ve fonksiyonu altında yatan temel bir süreçtir. Hücrelerin büyük çoğunluğu embriyonik gelişim sırasında göç ve sadece bu OB, dentat girus ve beyincik gibi birkaç bölgelerde doğum sonrası beyindeki nöronal yerinden hala yer alır. Postnatal beyin hücre göçü düzenlediğini mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır, ancak kalır. Olgun sinir dokularında hücre göçü rehberlik dahil mekanizmaları ve moleküler yolaklar bilgisi postnatal beyi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma </td><td> S9378 </td></tr><tr><td> Glikoz (ACSF) </td><td> EMD </td><td> DX0145-3 </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> Sigma </td><td> S9625 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> MgCI 2 x6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 xH 2 O </td><td> EMD </td><td> SX0710-1 </td></tr><tr><td> CaCI 2 x2H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3881 </td></tr><tr><td> Dekstran TexasRed </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Dekstran CascadeBlue </td><td> Invitrogen </td><td> D1976 </td></tr><tr><td> Glikoz (40X çözüm) </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Sodyum pyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Sigma </td><td> D-5025 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> Neurobasal orta </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> EMD </td><td> 2930 </td></tr><tr><td> Kalem / Strep </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Ketamin / Ksilazin </td><td> CDMV </td><td> 5230 </td></tr><tr><td> Pasteur pipeti </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td></tr><tr><td> 15 ml konik tüp </td><td&gt; Sarstedt </td><td> 62.553.205 </td></tr><tr><td> 50 ml konik bir tüp </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.205 </td></tr><tr><td> Cam kılcal (stereotaksik enjeksiyon) </td><td> TEFE </td><td> 4878 </td></tr><tr><td> Parafin </td><td> EMD </td><td> PX0045-3 </td></tr><tr><td> Proviodine </td><td> Rougier </td><td> 65655-1370 </td></tr><tr><td> Dikin </td><td> Stoelting </td><td> 50487 </td></tr><tr><td> Anafen </td><td> CDMV </td><td> 11508 </td></tr><tr><td> 20 cc Şırınga </td><td> VWR </td><td> SS-20L2 </td></tr><tr><td> Petri kabı </td><td> VWR </td><td> 25384-094 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Laboratoire Mat </td><td> AP-0108 </td></tr><tr><td> Tutkal </td><td> Permabond </td><td> 910 </td></tr><tr><td> % 95 O 2 /% 5 CO 2 </td><td> Linde </td><td> 24068835 </td></tr><tr><td> Blade &lt;/ Td&gt; <td> TEFE </td><td> 501901 </td></tr><tr><td> Naylon örgü </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0198 </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5702 000.019 </td></tr><tr><td> Pipet çektirme </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Nanolitre enjektör </td><td> TEFE </td><td> B203MC4 </td></tr><tr><td> Stereotaksik enjeksiyon aparat </td><td> TEFE </td><td> 502900 </td></tr><tr><td> Mikro matkap sistemi </td><td> TEFE </td><td> 501819 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Thermo Scientific </td><td> 920110 </td></tr><tr><td> Geniş alan floresan mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> BX61WIF </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Fotometrik </td><td> CS-HQ2-D </td></tr><tr><td> Ultra-sessiz görüntüleme odası </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 64-1487 </td></tr><tr><td> PH-1Seri 20 platformu ısıtıcı </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 64-0284 </td></tr><tr><td> Isıtma sistemi </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td></tr><tr><td> 40X su immersiyon objektif </td><td> Olimpos </td><td> 1-UM587 </td></tr><tr><td> 10X su immersiyon objektif </td><td> Olimpos </td><td> 1-UM583 </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Aletleri </td><td> DG-4/OF </td></tr><tr><td> MetaMorph yazılım </td><td> Molecular Devices </td><td> 40000 </td></tr><tr><td> Imaris yazılım </td><td> Bitplane </td><td> BPI-IM70-F1 </td></tr></tbody></table>

yetişkin fare önbeyin akut dilimleri içinde neuroblast göç time-lapse görüntüleme

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Yeni fonksiyonel nöronlar yapısal yetişkin memeli beyninde kısıtlı alanlarda nöral kök hücrelerinin endojen bir havuz oluşturulur gösteren kanıt önemli bir gövdesi vardır. Subventricular zon (SVZ) den Yenidoğan nöroblast koku ampul (OB) 1 nihai hedefe rostral göç akışı (RMS) boyunca göç. RMS&#39;de, nöroblast bir yapısal destek ve göç 4,5 için gereken moleküler faktörü kaynağı olarak kan damarlarının kullanılarak astrositik işlemler 2,3 göre ensheathed zincirleri teğetsel göç ederler. OB, nöroblast zincirleri ayırmak ve internöron içine ayırt etmek ve mevcut ağ 1, 6 entegre farklı bulber katmanları içine radyal olarak göç ederler. Bu yazıda kemirgen beynindeki akut dilimleri izleme hücre göçü için prosedürü açıklar. Akut dilimlerinin kullanılması assessm sağlaryakından vivo koşullarda ve in vivo görüntüleme için ulaşılması zor beyin bölgelerinde andıran bu mikroçevresindeki hücre göçü ent. Buna ek olarak, sonuçta hücre göçü özelliklerini değiştirebilir organotipik ve hücre kültürlerinin olduğu gibi uzun kültür kalıntıları önler. Akut dilimler Nöronal öncüleri DIC optik ya da floresan proteinleri kullanılarak görüntülenebilir. Wild-tip farelerden SVZ&#39;da içine muhabiri fareler nöroblast aşılama ve nöroblast floresan proteini ifade transgenik fareler kullanarak SVZ nöronal öncüllerinin Viral etiketleme, nöroblast görselleştirme ve göç sonrası için tüm uygun yöntemlerdir. Daha sonra yöntem, ancak tek tek hücreler çünkü işaretli hücrelerin yüksek yoğunluklu uzun süre için izlenen izin vermez. Biz nispeten hızlı bir toplama aralığı (bir ima ulaşmak için bir CCD kamera ile donatılmış geniş bir alan floresan dik mikroskop kullanılırge her 15 veya 30 sn) güvenilir sabit ve göçmen fazları belirlemek için. Kırtasiye ve göçmen fazların süresinin kesin tanımlama sonuçlarının kesin yorumlanması için çok önemlidir. Biz aynı zamanda 3D nöroblast göç izlemek için birden z-aşamalı alımlar gerçekleştirilir. Geniş alan floresan görüntüleme nöronal migrasyon 7-10 görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, biz, nöroblast etiketleme yetişkin fare önbeyin akut dilimleri neuroblast göçün gerçek zamanlı video görüntüleme gerçekleştirerek ve hücre göçü analiz etmek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Açıklanan protokol yetişkin RMS nöroblast göç örnek, aynı zamanda, embriyonik ve erken doğum sonrası beyin hücre göçü takip etmek için kullanılabilir.

Biz fare önbeyin nöronal göç gerçek zamanlı videoimaging için bir protokol açıklar. Viral etiketli veya aşılı nöronal öncüllerinin göç durağan ve göç fazlarının süreleri ve hız gibi hücre göçü farklı evreleri, incelemek için nispeten hızlı toplama aralığı ile geniş alan floresan görüntüleme kullanarak akut canlı dilim kaydedildi göç.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

Yeni fonksiyonel nöronların, endojen bir nöral kök hücre havuzundan sürekli olarak üretildiğini gösteren önemli miktarda kanıt bulunmaktadır ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin fare beyninin akut dilimlerinde nöroblast göçünü incelemektir. Bu işlem, öncelikle yetişkin subventriküler bölgedeki nöronal öncüllerin işaretlenmesiyle ve nöroblast işaretlemesinden beş ila sekiz gün sonra fare beyninden akut dilimlerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, nöroblast göçünün zaman ayarlı görüntülemesi yapılır.Sonuç olarak, akut dilimlerde nöroblast migrasyonunun dinamiklerini göstermek için geniş alan gerçek zamanlı mikroskopi kullanılır. Bu yöntem, hücre migrasyonu ile ilişkili farklı moleküler ipuçlarının ve hücresel mekanizmaların rolünü inceleyerek, nöronal gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, yetişkin beyninde nöral migrasyonu düzenleyen fizyolojik süreçlere dair içgörü sağlayabildiği gibi, iskemik beyindeki nöral migrasyonun incelenmesi ve embriyonik gelişim gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Bu prosedüre, kesitlerin alınması için sükroz bazlı bir yapay beyin omurilik sıvısı (A CSF) ve görüntülemeye kadar kesitlerin muhafaza edilmesi için 32 °C sıcaklıkta sodyum klorür bazlı bir A CSF hazırlayarak başlayın; ardından çözeltileri %95 oksijen, %5 karbondioksit ile sürekli kabarcıklama yaparak oksijenlendirin. Sonrasında, floresan işaretli nöroblast içeren fareyi ketamin ksilazin ile intraperitonal olarak anestezi edin. Ardından, sıvı azot kullanarak jöle benzeri görünüme sahip buz soğukluğundaki kesme çözeltisini hızla hazırlayın.Ardından, 20 cc'lik bir şırınga ile 15 ila 20 mililitre buz gibi soğuk kesim solüsyonu alın ve fareye intra-kardiyak olarak perfüzyon yapın. Kesim solüsyonu ile perfüzyon yapmak yerine kan damarlarının işaretlenmesi gerekiyorsa, kalbin sol ventrikülüne trans-kardiyak olarak 10 mg/mL konsantrasyonda 200 mikrolitre dekstran Texas red enjekte edin ve farenin başını koparmadan önce iki ila üç dakika bekleyin. Trans-kardiyal perfüzyondan sonra farenin başını hızla koparın, başı buz gibi soğuk kesim solüsyonuna daldırın ve vibratoma taşıyın. Kafatasını, serebellumdan olfaktor bulba kadar sagital sütür boyunca makasla kesin.Ardından, bir penset yardımıyla kraniyal kapakçıkları nazikçe kaldırın. Sonrasında, beynin caudale kısmını bir bistüri kullanarak çıkarın. Daha sonra, her iki hemisferin en lateral kısmından iki sagittal kesi yapın ve beyni intrahemisferik fissür boyunca kesin. Ardından beyni bir spatula kullanarak nazikçe çıkarın ve buz soğukluğundaki kesim solüsyonuna yerleştirin.İki hemisferi, dorsal yanları agara değecek şekilde ayrı ayrı %4'lük bir agar bloğuna yerleştirin. Ardından, bloğu, iki hemisferin lateralden kesilmiş tarafı olacak şekilde bir Vibram platformuna yapıştırın ve medial yanın yukarı bakmasını sağlayın. Bundan sonra, platformu Vibram haznesine yerleştirin.İçini kesme solüsyonuyla doldurun. Ardından, %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile kabarcıklar oluşturarak, dilim hazırlama işlemi boyunca solüsyonun oksijenle doygun kalmasını sağlayın. Şimdi, vibratör ile 250 micron kalınlığında kesitler hazırlayın.Yüksek kaliteli kesitler elde etmek için düşük kesme hızı ve yüksek frekanslı bıçak titreşimi kullanılmalıdır. Bir kesit bıçaktan ayrılır ayrılmaz, nazikçe kesme solüsyonundan çıkarın ve su banyosunda 32 °C'de tutulan oksijenle zenginleştirilmiş A CSF ile doldurulmuş bir inkübasyon haznesine yerleştirin. Bu prosedürde, görüntüleme sırasında kesitin sürüklenmesini önlemek için kesiti mikroskobun görüntüleme haznesine dikkatlice yerleştirin.Üzerine dikkatlice bir naylon ağ yerleştirerek stabilize edin. Kesitin sürekli olarak A CSF ile perfüze edildiğinden emin olun. Ardından, ilgilenilen alanı bulmak için 10 x objektif kullanın.Metamorph yazılımını açın ve naylon ağın görüntüleme alanını engellemediğinden emin olun. Ardından 40 x objektifi devreye sokun ve odağı ayarlayın. Objektif ile kesit arasında yeterli çözelti olduğundan emin olun.Metamorph yazılımını kullanarak uyarım süresi, Z düzlemi sayısı, her bir Z kesiti arasındaki mesafe, zaman aralığı ve kayıt süresi gibi zaman atımlı görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Ardından zaman atımlı görüntüleme işlemini başlatın. Veriler Metamorph tarafından otomatik olarak, elde edilen zaman atımlı videonun her bir zaman noktasına karşılık gelen bir tiff dosyası şeklinde kaydedilir; videoyu açmak için Mrs. kullanın.Videonun ilk zaman noktasına ait görüntüsünü program simgesinin üzerine sürükleyip bırakarak edinilen görüntüleri yükleyin. Film yüklendikten sonra, ekran ayarlama penceresinden sinyalin parlaklığını ve kontrastını ayarlayın. Görüntü özellikleri kısmından, voksel boyutu ve zaman aralığı gibi edinilen videonun parametrelerini belirleyin ve eşit aralıklı zaman noktası pencerelerini ayarlayın.Voksel boyutu belirlendikten sonra, kaydedilen hücreleri otomatik olarak takip etmek için videonun zamanı ve ölçeğinin yanı sıra karenin 3 boyutlu görünümünü görmek mümkündür. Spotlar fonksiyonunu seçerek görüntüleme penceresindeki her bir hücre için bir nokta oluşturun ve takip edilecek hücrenin çapını kesit penceresinde ölçün. Takip parametrelerini ayarlayın ve işleme devam edin.Saptanan nesnelerin zaman içindeki güvenilirliğini inceleyin. Göç eden hücrelerin tamamı otomatik olarak saptanmadıysa, saptama eşiğini değiştirin ve tüm hücrelerin tüm zaman noktalarında noktalarla seçildiğinden emin olun. Programın zaman noktalarını birbirine bağlayabilmesi için, aynı izleğin komşu zaman noktalarını temsil eden iki nokta arasındaki maksimum mesafe ve maksimum boşluk boyutu belirtilmelidir.İzler oluşturulduktan sonra, ilgisiz izler basitçe silinerek filtrelenebilir ve kaldırılabilir. Tüm düzeltmeler yapıldıktan sonra, farklı izler veya aynı izin farklı zaman noktaları birbirine bağlanarak ya da bağlantıları kesilerek izler düzeltilebilir. İzlere son bir kez göz atın ve zaman noktası başına hücre yer değiştirmesi, iz uzunluğu, yer değiştirme uzunluğu ve iz süresini içeren verileri bir Excel dosyasına aktarın.Bu video, dekstran, Texas red ile işaretlenmiş kan damarları boyunca yeşil nöroblast migrasyonunun zaman atlamalı görüntülemesini göstermektedir. Migrasyon aşamalarının durağan dönemlerle kesildiği durumlarda, göç eden nöroblastların saltatory davranış sergilediğine dikkat edin. Ayrıca bu video, imas yazılımı ile nöroblast migrasyonunun takibini göstermektedir.Küreler ve çizgeler sırasıyla hücre gövdelerini ve münferit hücrelerin migrasyon izlerini göstermektedir. Bu prosedür uygulanırken, yetişkin fare ön beyninden yüksek kaliteli akut canlı kesitlerin elde edilmesinin önemli olduğu unutulmamalıdır. Ayrıca, görüntüleme sırasında kesitin kaymasını önlemek için naylon bir ağ dikkatlice yerleştirilerek kesitlerin görüntüleme odasında iyi stabilize edilmesi gerekir.A CSF perfüzyon hızındaki herhangi bir değişiklik, düzensiz perfüzyon veya sıcaklıktaki ciddi varyasyonlar, görüntüleme sırasında kaymalara ve odak düzleminde değişikliklere neden olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akut erişkin kesitlerde nöroblast migrasyonunun nasıl kaydedileceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Migrasyon ve durağan evrelerin başlangıcını ve sonunu güvenilir bir şekilde belirlemek için 15 ile 30 saniye civarında kısa bir görüntüleme aralığı kullanmanızı öneririz.

time-lapse-imaging-neuroblast-migration-acute-slices-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Kaynak: Wiegreffe, C., et. al.,  {{}}In Utero Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 44}} (2017) Bu video, transdüksiyonlu fare embriyonik beyin dilimlerinde radyal glial iskeleler yoluyla subventriküler bölgeden kortikal plakaya kortikal nöron radyal göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Transdüksiyonlu Fare Embriyonik Beyin Dilimlerinde Kortikal Nöron Radyal Migrasyonunun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Manyetik rezonans görüntüleme (MRG), genetiği değiştirilmiş farelerde fenotip incelenmesi için giderek daha popüler bir araç haline gelmiştir. Bu makale, çoklu-fare MRI kullanarak genetiği değiştirilmiş farelerde yüksek verimli fenotipleme ulaşmak için gerekli yöntemleri göstermektedir.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Öğrenin, yetişkin fare önbeyin akut dilimlerinde geniş alanlı floresan görüntüleme ile nöroblast göçünü gerçek zamanlı izlemeyi. Bu yöntem, nöron gelişimi ve hücre göç mekanizmalarını anlamak için değerli bilgiler sunar.

Yetişkin Fare önbeyin akut dilimleri içinde Neuroblast Göç Time-lapse Görüntüleme

Daha fazla video keşfet