İnsan Pankreas Adacıklar için boyama Protokoller
May 23rd, 2012
Bu video hematoksilen ve eosin (H & E) ve immunohistokimyasal (İHK) kullanarak insan pankreas adacık karakterizasyonu için prosedürleri göstermektedir. Baş, gövde ve kuyruk bölgelerinden Pankreas bölümleri adacık endokrin kompozisyon (insülin, glukagon ve pankreatik polipeptit), hücre çoğaltma (Ki67) ve inflamatuar infiltrasyon (H & E, CD3) belirlemek için H & E ve İHK her ikisi tarafından boyanmış. Unsinat bölge pankreatik polipeptid için İHK kullanarak yerelleştirilmiştir.
Bu prosedürün genel amacı, hematin ve eozin boyama ve immünohistokimya kullanarak insan pankreas deliklerini karakterize etmektir. Bu, bir parafin bloğuna gömülü bir pankreas örneğinden seri kesitler oluşturularak gerçekleştirilir. Bölümler daha sonra orijinal yönlerinde slaytlara yerleştirilir.
Slaytların bir kısmı hematin ve eoin ile boyanırken, kalan slaytlar immünohistokimya ile boyanır, son adım lekeli slaytları taramak ve duruma göre düzenlemektir. Sonuç olarak, bu görüntüler, alandaki diğer araştırmacılar tarafından görüntülenebilecekleri çevrimiçi bir patoloji veritabanına yüklenebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, slaytların orijinal oryantasyonlarını korurken seri olarak boyanmasıdır.
Prosedürü gösterenler, tarihi teknoloji uzmanı Linda Snyder, biyolojik bilim adamı Emily Montgomery ve laboratuvarımdaki laboratuvar teknisyeni Tiffany Hippo olacak. Başlamak için, parafin mikrotomisi için standart prosedürleri izleyerek su banyosunu ve mikrotomu kurun. Sonraki etiket: pozitif yüklü slaytları vaka numarası, pankreas bölgesi ve slayt numarası ile etiketleyin.
Her şey hazırlandıktan sonra, parafin bloğunu sol tarafta kaset etiketi olacak şekilde mikrotom aynasına yerleştirin. Normal mikrotomi prosedürlerini takiben, doku düzgün bir şekilde açığa çıkana kadar bloğu bölümlere ayırın. Doku eşit şekilde karşılaşıldığında, yaklaşık dört mikron kalınlığında seri kesitlerden oluşan bir şerit oluşturun.
Gerekli ilk lekelerin sayısına bağlı olarak üç ila altı bölüme ihtiyaç vardır. Ardından, şeridin bölümlerini ayırın. Her bölümü sırayla alın ve bir slayta yerleştirin.
Bölüm numarasını bir kalemle kaydedin. Bir bölüm kullanılamıyorsa, bu numarayı atlayın ve bölümleri tam sırayla numaralandırmaya devam edin. Slayt etiketi sola doğru bakacak şekilde, kasette bulunan yönün aynısını slaytta tutmaya dikkat edin.
Ardından, slaytları bir sürgülü rafa yerleştirin ve gece boyunca kurumaya bırakın. Oda sıcaklığında, dokuyu korumak ve oda sıcaklığında veya eksi 20 santigrat derecede arşivlemek için parafin bloğunun yüzeyini ince bir parafin tabakası ile tekrar kapatın. Bir sonraki örnek için bu prosedürü tekrarlayın.
H ve e boyama için yukarıda görüldüğü gibi her seviyede seri bölümler için numaralandırmanın korunması önemlidir. Her bloktan ilk slaydı bir kayar rafa yerleştirin ve ardından rafı otomatik boyayıcının ilk tepsisine yerleştirin. Standart HE programını seçin ve boyama işlemini başlatın.
Boyama bittiğinde, sürgüleri otomatik boyayıcıdan çıkarın ve kapağın kayması için kaputun içine yerleştirin. Standart teknikleri kullanarak her slayta bir kapak fişi yerleştirin. Son olarak, slaytları basılı bir etiketle etiketleyin ve kaputun içinde iyice kurumasını bekleyin.
Otomatik boyayıcıyı ayarlayarak ve gerekli tüm reaktifleri hazırlayarak başlayın. Çift lekeler için Daco programını seçin. Slaytların sayısını ve her birinin alacağı tedaviyi girin.
Tüm reaktifleri üreticinin tavsiyelerine göre otomatik boyayıcıya yükleyin. Ardından, TBST ve sitrat, tamponlar, antikorlar ve prosedür için gerekli diğer reaktifleri hazırlayın. Slaytları beş dakika boyunca ksilen içine yerleştirerek ayırın.
Slaytların kurumasına izin vermeyin çünkü bu, slaytlar depolanırken aşırı arka plan ve gözenek lekelenmesine neden olur. Kullanmadan önce ön ısıtmak için sitrat tamponunu bir buharlı pişiriciye dökün. Ardından, depa slaytlarını bir dizi etanol yıkamasına gönderin.
Slaytları deiyonize suda son bir kez durulayın. Slaytları önceden ısıtılmış sitrat tamponuna ekleyin ve 30 dakika buharda pişmelerine izin verin. Bu süreden sonra, slaytları tamamen soğuyana kadar hemen oda sıcaklığındaki bir su banyosuna aktarın.
Soğuduktan sonra, kızakları uygun sırayı korumaya özen göstererek Dayco auto Stainer raflarına aktarın. Son olarak, çift boyama programı tamamlandığında daha önce yüklenmiş olan çift boyama programını çalıştırın. Slaytları otomatik boyayıcıdan çıkarın ve kurutmadan önce en az bir saat kurumasını bekleyin.
Dehidrasyona devam etmek için, bir dakika boyunca% 80 etanole aktarın. Slaytları %95 etanole batırarak ve ardından %100 sonlandırarak kurutmaya devam edin. Son olarak, slaytları ksilen'e batırın ve bir dakika basılı tutun.
Prosedürü tamamlamak için cyto conta kullanarak slaytları hemen kapak fişleri ile monte edin. Organ ve blok numarası, leke türü ve tarih dahil olmak üzere vaka bilgilerini içeren etiketleri yazdırın. Leke slaytlarını taramak için her slayta bir etiket yerleştirin.
Bunları bir tarayıcı tepsisine yerleştirin ve standart prosedürleri izleyin. Leke slaytlarını oda sıcaklığında ve kalan lekelenmemiş slaytları ileride kullanmak üzere eksi 20 santigrat derecede arşivleyin. Son olarak, lekeli görüntüleri donör ve görülen doku tipine göre düzenleyin.
İşte hem düşük hem de yüksek büyütme seviyelerinde KI 67 artı insülin boyamaya bir örnek. Lekeli pankreas bölümlerinin görüntüleri, sanal bir biyobanka oluşturarak çevrimiçi bir patoloji veritabanına gönderilir. Araştırmacılar bu veri tabanını kullanarak araştırma ve tip bir diyabet için gerekli bilgilere hızlı bir şekilde erişebilirler.
Bu videoyu izledikten sonra, insan pankreasından yüksek kaliteli slaytların nasıl hazırlanacağını ve boyanacağını iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu video, hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve immünohistokimya (IHC) kullanarak insan pankreatik adalarda karakterizasyon prosedürlerini gösterir. Teknik, ada endokrin bileşiminin, hücre replikasyonunun ve enflamatuar infiltratların değerlendirilmesine izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Endokrinoloji
- Histoloji
Arka Plan
- İnsan pankreatik adaları glukoz metabolizmasında önemli bir rol oynar.
- Ada bileşiminin karakterizasyonu diyabetin anlaşılması için esastır.
- H&E ve IHC, doku analizi için standart tekniklerdir.
- Kaymaların orijinal yönünün korunması, doğru değerlendirme için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- İnsan pankreatik adalarda karakterizasyon yapmak.
- Adaların endokrin bileşimini belirlemek.
- Hücre replikasyonunu ve enflamatuar yanıtları değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Parafinle gömülü pankreas örneklerinden seri kesitler oluşturma.
- Kesitleri H&E ve IHC ile boyama.
- Boyanmış slaytların analiz için taranması.
- Görüntüleri vaka bazında düzenleyerek veritabanı yüklemesi için hazırlama.
Ana Sonuçlar
- Adalarda insülin, glukagon ve pankreatik polipeptid tanımlanması.
- Ki67 boyaması kullanılarak hücre replikasyonunun değerlendirilmesi.
- H&E ve CD3 boyaması aracılığıyla enflamatuar infiltratların değerlendirilmesi.
- IHC kullanılarak uncinate bölgenin başarılı bir şekilde lokalize edilmesi.
Sonuçlar
- Metot, pankreatik adalarda kapsamlı bir karakterizasyon sağlar.
- Orijinal slayt yönünün korunması analiz doğruluğunu artırır.
- Sonuçlar, sağlık ve hastalık durumunda pankreas fonksiyonunun anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Standardized histopathology workflows for human pancreatic islets enable reproducible endocrine cell characterization, supporting target validation in diabetes research. By preserving serial section orientation and generating digitized whole-slide images, the method facilitates cross-functional data sharing and biobanking for mechanistic de-risking of islet-targeted therapies. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantifiable, spatially resolved data on islet composition, replication, and immune infiltrates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through rigorous histopathology and immunolocalization of islet endocrine cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing islet morphology, size, density, and endocrine cell composition using H&E and IHC stains.
- Predictive Value: Assists in portfolio triage by evaluating islet replication and apoptotic cells via Ki67 and other proliferation markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized processing of human pancreas into defined regions (head, body, tail) and transverse sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility by numbering and alphabetically denoting subsections based on size for complete cross-sectional analysis.
- Platform Value: Highlights screening readiness and scalability via digitized whole-slide images organized in an online pathology database accessible to over 200 researchers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by evaluating islets for inflammation, fibrosis, amyloid, and T-cell infiltrates using H&E and CD3 staining.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by assessing both endocrine and exocrine compartments, including ductular pathology and neoplasia.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by characterizing pancreatic intraductal neoplasia and its relationship to the duct system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment by enabling serial sectioning, standardized staining, and digital biobanking of human pancreatic tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through histopathology and immunolocalization of pancreatic islets and endocrine cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility by maintaining original slide orientation during serial sectioning and staining in series.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of islet area, numbers, endocrine cell composition, replication, and T-cell infiltrates via H&E and IHC to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by evaluating islet amyloid, fibrosis, and inflammatory infiltrates relevant to type 1 diabetes pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through an online pathology database that provides rapid data sharing and block selection for paraffin or frozen serial sections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in islet endocrine composition and immune interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of serial sectioning, staining, and digital slide archiving.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early identification of islet pathology and replication status.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable islet morphology, density, and endocrine cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histotechnology, immunohistochemistry, and digital pathology workflows.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtome, auto stainer, slide scanner, and online pathology database access.
- Cross-team standardization requirements for slide labeling, section numbering, and orientation maintenance across histology and imaging teams.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for applying standardized regional processing (head, body, tail) to non-human pancreata.
- Practical limitations include tissue variability from organ donors and the need for optimized antibody validation for multiplex IHC staining.
