İnsan Pankreas Adacıklar için boyama Protokoller
23 Mayıs 2012
Bu video hematoksilen ve eosin (H & E) ve immunohistokimyasal (İHK) kullanarak insan pankreas adacık karakterizasyonu için prosedürleri göstermektedir. Baş, gövde ve kuyruk bölgelerinden Pankreas bölümleri adacık endokrin kompozisyon (insülin, glukagon ve pankreatik polipeptit), hücre çoğaltma (Ki67) ve inflamatuar infiltrasyon (H & E, CD3) belirlemek için H & E ve İHK her ikisi tarafından boyanmış. Unsinat bölge pankreatik polipeptid için İHK kullanarak yerelleştirilmiştir.
Bu prosedürün genel amacı, hematoksilin ve eozin boyama ile immünohistokimya kullanarak insan pankreas adacıklarını karakterize etmektir. Bu işlem, parafin blokla gömülmüş bir pankreas örneğinden seri kesitler oluşturularak gerçekleştirilir. Kesitler daha sonra orijinal yönelimlerinde lamlar üzerine yerleştirilir.
Slaytların bir kısmı hematoksilin ve eozin ile boyanırken geri kalan slaytlar immünohistokimya ile boyanır; son adım, boyanmış slaytların taranması ve vakalara göre düzenlenmesidir. Nihayetinde, bu görüntüler, alandaki diğer araştırmacılar tarafından görüntülenebileceği çevrimiçi bir patoloji veri tabanına yüklenebilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, slaytların orijinal yönelimleri korunurken seri şeklinde boyanmasıdır.
Prosedürü laboratuvarımdaki histoteknolog Linda Snyder, biyolog Emily Montgomery ve laboratuvar teknisyeni Tiffany Hippo uygulamalı olarak gösterecekler. Başlamak için, parafin mikrotomisi standart prosedürlerini izleyerek su banyosunu ve mikrotomu hazırlayın. Ardından, pozitif yüklü lamları vaka numarası, pankreas bölgesi ve lam numarasıyla etiketleyin.
Her şey hazırlandıktan sonra, parafin bloğu kaset etiketi sol tarafa gelecek şekilde mikrotom tutucusuna yerleştirin. Standart mikrotomi prosedürlerini izleyerek, doku tamamen açığa çıkana kadar bloğu kesin. Dokuya eşit şekilde ulaşıldığında, yaklaşık dört mikron kalınlığında seri kesitlerden oluşan bir şerit oluşturun.
Gerekli olan başlangıç boyama sayısına bağlı olarak üç ila altı kesit gereklidir. Ardından, şerit halindeki kesitleri birbirinden ayırın. Her bir kesiti sırasıyla alın ve bir lamın üzerine yerleştirin.
Kesit numarasını kurşun kalemle kaydedin. Bir kesit kullanılamaz durumdaysa, o numarayı atlayın ve kesitleri tam sırasıyla numaralandırmaya devam edin. Slayt etiketini sola gelecek şekilde ayarlayarak, slayttaki yönelimin kasetle aynı kalmasına dikkat edin.
Ardından, lamları bir lam rafına yerleştirin ve gece boyunca kurumaya bırakın. Oda sıcaklığında, dokuyu korumak için parafin bloğun yüzeyini ince bir parafin tabakasıyla yeniden mühürleyin ve bloğu oda sıcaklığında veya -20 °C'de arşivleyin. Bu prosedürü bir sonraki örnek için tekrarlayın.
Yukarıda H&E boyaması için gösterildiği gibi, her seviyedeki seri kesitlerin numaralandırmasını korumak önemlidir. Her bloktan alınan ilk lamı bir lam rafına yerleştirin ve ardından rafı otomatik boyayıcının ilk tepsisine koyun. Standart HE programını seçin ve boyama işlemini başlatın.
Boyama tamamlandığında, lamları otomatik boyama cihazından çıkarın ve lamellenme işlemi için çeker ocak içine yerleştirin. Standart teknikleri kullanarak her lama bir lamel kapatın. Son olarak, lamları basılı bir etiketle işaretleyin ve çeker ocak içerisinde tamamen kurumasını bekleyin.
Otomatik boyama cihazının kurulumunu yaparak ve gerekli tüm reaktifleri hazırlayarak başlayın. Çift boyamalar için Daco programını seçin. Lam sayılarını ve her birinin göreceği işlemi girin.
Tüm reaktifleri üretici tavsiyelerine uygun olarak otomatik boyayıcıya yükleyin. Ardından, prosedür için gerekli olan TBST ve sitrat tamponlarını, antikorları ve diğer reaktifleri hazırlayın. Lamları beş dakika boyunca ksilen içinde bekleterek deparafinize edin.
Slaytların kurumasını önleyin; aksi takdirde deparafinizasyon sırasında aşırı arka plan ve gözenek boyanması meydana gelecektir. Kullanmadan önce ön ısıtma yapmak için bir buharlaştırıcıya sitrat tamponu dökün. Ardından, deparafinize edilmiş slaytları bir dizi etanol yıkama işlemine tabi tutun.
Slaytları son bir kez deiyonize su ile durulayın. Slaytları önceden ısıtılmış sitrat tamponuna ekleyin ve 30 dakika boyunca buharlaşmaya bırakın. Bu sürenin ardından slaytları, tamamen soğuyana kadar derhal oda sıcaklığındaki bir su banyosuna aktarın.
Soğuduktan sonra, uygun sırayı korumaya dikkat ederek slaytları Dayco otomatik boyama cihazı raflarına aktarın. Son olarak, daha önce yüklenmiş olan çift boyama programını çalıştırın; çift boyama programı tamamlandığında slaytları otomatik boyama cihazından çıkarın velehidrasyondan önce en az bir saat boyunca kurumaya bırakın.
Dehidrasyona devam etmek için örnekleri bir dakika boyunca %80 etanol içerisine aktarın. Lamları sırasıyla %95 etanole ve ardından %100 etanole daldırarak dehidrasyon işlemini sürdürün. Son olarak, lamları bir dakika boyunca ksilen içinde bekletin.
Prosedürü tamamlamak için lamları hemen cyto seal kullanarak lamellerle kapatın. Organ ve blok numarası, boya türü ve tarih dahil olmak üzere vaka bilgilerini içeren etiketler yazdırın. Boyalı lamları taramak için her lamın üzerine bir etiket yapıştırın.
Bunları bir tarayıcı tepsisine yerleştirin ve standart prosedürleri uygulayın. Boyalı lamları oda sıcaklığında, boyanmamış kalan lamları ise gelecekteki kullanımlar için -20 °C'de arşivleyin. Son olarak, boyanmış görüntüleri donöre ve görülen doku tipine göre düzenleyin.
Burada, hem düşük hem de yüksek büyütme seviyelerinde KI 67 artı insülin boyamasının bir örneği yer almaktadır. Boyanmış pankreas kesitlerinin görüntüleri, sanal bir biyobanka oluşturan çevrimiçi bir patoloji veri tabanına iletilir. Araştırmacılar, bu veri tabanını kullanarak tip 1 diyabet ve araştırma için gerekli bilgilere hızla erişebilirler.
Bu videoyu izledikten sonra, insan pankreasından yüksek kaliteli lamların nasıl hazırlanacağı ve boyanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, hematoksilen ve eozin (H&E) boyama ve immünohistokimya (IHC) kullanılarak insan pankreas adacıklarının karakterizasyonu için uygulanan prosedürleri göstermektedir. Bu teknik; adacık endokrin kompozisyonunun, hücre replikasyonunun ve inflamatuar infiltratların değerlendirilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Endokrinoloji
- Histoloji
Arka Plan
- İnsan pankreas adacıkları, glikoz metabolizmasında kritik bir rol oynar.
- Adacık kompozisyonunun karakterizasyonu, diyabetin anlaşılması için gereklidir.
- H&E ve IHC, doku analizi için standart tekniklerdir.
- Slaytların orijinal yöneliminin korunması, doğru değerlendirme için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- İnsan pankreas adacıklarını karakterize etmek.
- Adacıkların endokrin kompozisyonunu belirlemek.
- Hücre replikasyonunu ve inflamatuar yanıtları değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Parafin gömülü pankreas örneklerinden seri kesitlerin hazırlanması.
- Kesitlerin H&E ve IHC ile boyanması.
- Analiz için boyanmış lamların taranması.
- Görüntülerin veritabanına yüklenmek üzere vaka bazında düzenlenmesi.
Temel Sonuçlar
- Adacıklarda insülin, glukagon ve pankreatik polipeptidin tanımlanması.
- Ki67 boyaması kullanılarak hücre replikasyonunun değerlendirilmesi.
- H&E ve CD3 boyamaları aracılığıyla enflamatuar infiltratların değerlendirilmesi.
- IHC kullanılarak unsinat bölgenin başarılı bir şekilde lokalizasyonu.
Sonuçlar
- Bu yöntem, pankreas adacıklarının kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar.
- Orijinal lam yöneliminin korunması, analiz doğruluğunu artırır.
- Sonuçlar, sağlıklı ve hastalık durumundaki pankreas fonksiyonlarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Uygunluk
İnsan pankreas adacıkları için standardize edilmiş histopatoloji iş akışları, diyabet araştırmalarında hedef doğrulamayı destekleyerek tekrarlanabilir endokrin hücre karakterizasyonuna olanak tanır. Seri kesit yönelimini koruyan ve dijitalleştirilmiş tam lam görüntüleri oluşturan bu yöntem, adacık hedefli terapilerin mekanistik risklerinin azaltılması için fonksiyonlar arası veri paylaşımını ve biyobankalamayı kolaylaştırır. Bu yaklaşım; adacık kompozisyonu, replikasyonu ve immün infiltratlar hakkında nicelendirilebilir, mekânsal olarak çözümlenmiş veriler sağlayarak preklinik modellerdeki öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Adacık endokrin hücrelerinin titiz histopatolojisi ve immünlokalizasyonu yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: H&E ve IHC boyamaları kullanarak adacık morfolojisi, boyutu, yoğunluğu ve endokrin hücre kompozisyonunu karakterize ederek biyolojik risk azaltımını destekler.
- Öngörücü Değer: Ki67 ve diğer proliferasyon belirteçleri aracılığıyla adacık replikasyonunu ve apoptotik hücreleri değerlendirerek portföy önceliklendirmesine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: İnsan pankreasının belirli bölgelere (baş, gövde, kuyruk) ve transvers kesitlere standart işlemle ayrılması yoluyla, sonraki iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Tam kesitsel analiz için alt bölümlerin boyutlarına göre numaralandırılması ve alfabetik olarak belirtilmesiyle, analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Platform Değeri: 200'den fazla araştırmacının erişebildiği çevrimiçi bir patoloji veri tabanında organize edilmiş dijitalize tüm lam görüntüleri aracılığıyla, tarama hazırlığı ve ölçeklenebilirliği vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: H&E ve CD3 boyaması kullanarak adacıkların inflamasyon, fibroz, amiloid ve T-hücre infiltrasyonları açısından değerlendirilmesi yoluyla hastalıkla olan ilgiyi tartışır.
- Operasyonel Değer: Duktüler patoloji ve neoplazi dahil olmak üzere hem endokrin hem de ekzokrin kompartmanların değerlendirilmesi ile keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Pankreatik intraduktal neoplaziyi ve bunun kanal sistemiyle ilişkisini karakterize ederek öngörücü risk azaltmaya odaklanır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; seri kesit alma, standart boyama ve insan pankreas dokusunun dijital biyobankalanmasını mümkün kılarak, erken hedef doğrulamadan preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Pankreatik adacıkların ve endokrin hücrelerin histopatolojisi ve immünlokalizasyonu yoluyla hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Seri kesit alma ve seri boyama sırasında orijinal lam yönelimini koruyarak analiz hazırlığını ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Analitikler: Koşullar arası karşılaştırmayı sağlamak için H&E ve IHC aracılığıyla adacık alanı, sayıları, endokrin hücre kompozisyonu, replikasyon ve T-hücresi infiltrasyonlarının nicel ölçümlerini vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Tip 1 diyabet patogenezi ile ilgili adacık amiloidi, fibroz ve enflamatuar infiltratları değerlendirerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Parafin veya donmuş seri kesitler için hızlı veri paylaşımı ve blok seçimi sağlayan çevrimiçi bir patoloji veri tabanı aracılığıyla yöntemi yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak yapılandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörü güveni, hedef doğrulama, adacık endokrin kompozisyonu ve bağışıklık etkileşimlerindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Seri kesit alma, boyama ve dijital lam arşivlemenin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Adacık patolojisinin ve replikasyon durumunun erken teşhisi yoluyla daha iyi devam/durdur kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Nicelendirilebilir adacık morfolojisi, yoğunluğu ve endokrin hücre fenotiplerine dayalı riskle ayarlanmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- Histoteknoloji, immünohistokimya ve dijital patoloji iş akışlarında gerekli bilimsel uzmanlık.
- Mikrotom, otomatik boyama cihazı, lam tarayıcı ve çevrim içi patoloji veri tabanı erişimi dahil olmak üzere enstrümantasyon ve analitik altyapı gereksinimleri.
- Histoloji ve görüntüleme ekipleri arasında lam etiketleme, kesit numaralandırma ve oryantasyonun korunmasına yönelik ekipler arası standardizasyon gereksinimleri.
- Model sistemler genelindeki adaptasyon hususları, özellikle standartlaştırılmış bölgesel işlemenin (baş, gövde, kuyruk) insan dışı pankreaslara uygulanması.
- Organ bağışçılarından kaynaklanan doku değişkenliği ve multipleks IHC boyaması için optimize edilmiş antikor validasyonuna duyulan ihtiyaç gibi pratik sınırlamalar.
