Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

Bu işlemin amacı postnatal subventriküler bölgedeki hücrelerin kalsiyum aktivitesini görüntülemektir. Bu, önce doğum sonrası bir fareden beyin dokusunun dikkatlice çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, subventriküler bölgeyi içeren canlı akut beyin dilimleri yapmaktır.

Daha sonra, beyin dilimleri kalsiyuma duyarlı bir boya ile yüklenir. Son adım, aktiviteyi hızlandırılmış konfokal mikroskopla görüntülemektir. Sonuç olarak, ventriküler bölge hücrelerindeki kalsiyum aktivitesinin hızlandırılmış görüntülemesi, farklı hücre tipleri ve damar sistemi arasındaki iletişim modellerini ortaya çıkarmak için hücreler arası aktivite dinamiklerini göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, farklı hücre tiplerinin birbirleriyle nasıl iletişim kurduğu ve hücrelerin bir P 20 ila P 30 fare yavrusunu feda ettikten ve başını kestikten sonra damar sistemini nasıl etkileyebileceği gibi nörojenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kurumsal olarak onaylanmış yönergelere göre, kafayı diseksiyon solüsyonu olan bir tepsi alanına yerleştirin. Kafayı forseps ile sabitleyin ve kafatası ve orta hat çevresinde sürekli kesimler yapmak için mikro makas kullanın.

Koku soğancığının beyne bağlı kaldığından ve hasar görmediğinden emin olun. Sırt tarafında kesikler yapın ve ardından üstteki kafatasını beyinden çıkarmak için forseps kullanın. Ardından, kafayı hala forseps ile tutarken, lambda seviyesinde bir koronal kesim yapmak için cerrahi bir bıçak kullanın.

Beynin her iki tarafında, orta hatta yaklaşık iki ila üç milimetre yanal sagital kesimler yapmak için aynı tıraş bıçağını kullanın. Daha sonra bıçağı kullanarak beynin altına sürün ve kafatasından tamamen çıkarın. Bu noktaya kadar olan prosedür üç dakikadan daha kısa sürede yapılmalıdır.

Vibram plakasına bir miktar siyanoakrilat bazlı süper yapıştırıcı yerleştirin. Daha sonra beyin dokusunu alın ve lateral sagital kesimin oluşturduğu düz kenarlardan birine monte edin. Kesme sırasında dokuyu stabilize etmek için bir agaroz bloğunun monte edilmesi isteğe bağlıdır.

Yağları çıkarmak için vibram bıçağını etanol ile durulayın ve ardından damıtılmış su ile durulayın. Bıçağı bıçak tutucusuna yerleştirin ve bıçak tutucuyu vibratöre monte edin. Vibratörü, doku dilimleri yüksek frekanslı titreşimde ve düşük hızda 250 ila 350 mikron kalınlığa kadar kesilecek ve doku boyunca aşamalı olarak kesilecek şekilde ayarlayın.

Koku soğancığının görünümü, sagital bölümlerin subventriküler bölgeye yaklaştığının iyi bir göstergesidir. Ventriküllerin görünümü ve korpus kallozumun kalınlaşması da subventriküler bölgenin sonraki görünümünün iyi göstergeleridir. Subventriküler bölgeye ulaşıldığında, her dilimi çıkarmak ve bir dilim tutma odasına aktarmak için ucu kesilmiş plastik bir makarna pipeti kullanın.

Bir BOS ile. Dilimler, A CSF'de bir saatlik inkübasyon gerektirir. Bu süre zarfında, pipetler, boya ve mikroskop sonraki görüntüleme adımları için hazırlanabilir.

Pipetleri hazırlamak için, her birinin uç uzunluğu yaklaşık iki milimetre ve çapı iki ila üç mikron olacak şekilde altı ila sekiz cam pipet çekin. Ek olarak, pipet tutucu yaklaşık 16 derecelik bir açıyla önceden ayarlanmıştır, böylece pipet perfüzyon odasına temas etmeden veya objektifin yerleştirilmesine müdahale etmeden monte edilebilir. Kalsiyum boyayı hazırlamak için, DMSO'da 4.6 mikrolitre onic F1 27,% 20'lik bir çözeltiyi 50 mikrogramlık bir grip oh dördüne ekleyin.

Son olarak, kullanımı görüntü kaymasını en aza indirmeye yardımcı olan peristaltik pompayı hazırlamak için, perfüzyon hatlarından bir BOS geçirin ve hatların kabarcıksız olduğundan emin olun. Şimdi, çözeltinin perfüzyon odasından aspire edildiğinden emin olmak için vakum ucunu konumlandırın. Bu görüntü perfüzyon sisteminin kurulumunu göstermektedir.

Çözelti, hedefi uygun çalışma mesafesine daldırmak için yeterli bir seviyede olmalı, ancak çözelti odanın kenarlarına dökülecek kadar yüksek olmamalıdır. Banyo yöntemiyle yükleme boyası uygulamak için sabit bir aspirasyonu doğrulamak için kararlılığı dinleyin. İlk olarak, stok çözeltisini seyrelterek dört ila beş mikromolar boya çalışma çözeltisinden bir ila iki mililitre yapın.

Bir CSF'de, dilimleri A BOS ile doldurulmuş bir ağ tabanlı 35 milimetrelik kültürlü bir kaba aktarın. Kalsiyum boya çalışma solüsyonunu eklerken aynı anda A BOS'u nazikçe çıkarmak için üç mililitrelik bir plastik transfer pipeti kullanın. Daha sonra 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit gazı kontrollü bir ortamda 30 ila 60 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücrelere girmemiş boyayı yıkamak için dilimi tekrar A BOS dolu tutma odasına yerleştirin. A BOS'ta 30 dakika sonra, boyanın basınç uygulaması için dilimi perfüzyon odasına aktarın. Bekletme odasından mikroskop kurulumundaki perfüzyon odasına bir dilim aktarın.

Ardından cam pipeti 250 mikromolar boya çalışma solüsyonu ile doldurun. Pipet ucunda kabarcık olmadığından ve mikro manipülatörün üzerine yerleştirildiğinden emin olun. Şimdi pipeti ilgilendiğiniz bölgeye indirin.

Pipet, ucu dilimlenmiş yüzeyin birkaç mikrometre üzerinde olacak şekilde veya yüzeyin birkaç mikrometre altına, ancak kaydedilen bölgeden uzağa gömülecek şekilde yerleştirilebilir. Pico spritzer'ı inç kare başına üç pound'dan daha az verecek şekilde ayarlayın ve boyayı bir ila iki dakika boyunca uygulayın. Göz tarafından değerlendirilen etiketlemeye bağlı olarak tekrarlanan uygulamalar gerekli olabilir.

Dilimin yüzeyine uygulandığında, bu protokol tercihen yüzeyin altına uygulandığında nöroblastı etiketleyecektir, bu teknik tercihen astrositleri etiketleyecektir, ancak 500 °C'lik bir konsantrasyonda üç dakikadan fazla uygulanırsa, mikromolar nöroblast etiketlenecektir. Pipet ucunun yerleşiminden bağımsız olarak, dilimin 30 ila 45 dakika boyunca A BOS'ta yıkanmasına ve toparlanmasına izin verin. Daha düşük güç hedefiyle ilgilenilen bölgeyi bulun, ardından daha yüksek güçlü bir suya daldırma hedefine geçin ve ilgili bölgedeki hücrelerin sağlığını değerlendirin.

Diferansiyel girişim kontrastı altında, sağlıklı hücreler yuvarlak ve dolgun görünür ve hafif grip oh dört yükleme gösterir. Perfüzyon ve vakumun yeterince çalıştığını doğruladıktan sonra, hızlandırılmış çözünürlüğü ve uzamsal çözünürlüğü istenen oranlara ayarlayın. Bu durumda, yaklaşık olarak her saniye bir kare beş 12 x beş 12 piksel çözünürlükle görüntülenir.

Süreyi iki ila 10 dakika arasında ayarladıktan sonra çalıştırmayı başlatın. Farmakolojik ajanlar beş ila 10 dakika boyunca yıkanır ve daha sonra beş ila 10 dakika daha yıkanır. Bu temsili, subventriküler bölgedeki astrositlerden sonra kalsiyum aktivitesinin hızlandırılmış bir kaydından elde edilen ortalama görüntüdür.

Basınçla yüklendi. Grip oh saat 04:00'te dilimin derinliklerine uygulanması. Filmler 0.5'te satın alındı.

İkinci kez adımlarla, ilgilenilen bölgeler aktivite sergileyen hücrelerin üzerine yerleştirilir. Daha önce gösterilen numaralandırılmış ilgi alanlarından izler aşağıda verilmiştir. İzler hareketli bir ortalama ile filtrelendi ve normalleştirildi.

Dikey ölçek, F'nin sinyal yoğunluğu olduğu ve F sıfırın ortalama temel sinyal olduğu ve delta F'nin F eksi F sıfıra eşit olduğu F sıfıra göre iki kez delta F'yi temsil eder. Bir kez ustalaştı. Bu teknik doğru yapılırsa dört ila beş saat içinde yapılabilir.