Name: RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi In Situ Hibridizasyon (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Öğrenin, tek hücreli gen transkripsiyon analizi için RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH) yöntemini. Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositlerde çoklu gen ekspresyonunu eş zamanlı tespit edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar mükemmel teknik yardım için parazit ve Christina Holm genotipleme için Michael Alifrangis ve Ulla Abildtrup teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü (hibe 55005511), Lundbeck Vakfı (hibe R9-A840) tarafından ve Niels Bohr Vakfı tarafından finanse edildi.

1. Taze Seçilen Enfekte Eritrositler Nesil PfEMP1 proteininin yüzeyde ekspresyonu için seçilen taze kültür kullanılarak, bu test için, en iyi sonuçlar elde edilir. Bu özel deney 3D7 P. falciparum soyu önce 1 açıklandığı gibi spesifik antikorlar kullanılarak seçildi. 1. Gün <ol><li> Bir S. dan paketlenmiş kan hücrelerinin hasat 200 ul falciparum kültürü oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüj ile% 2-5 geç safha IE içeren. </li><li> 37. 2 ml kan pelet yeniden askıya ° C sıcak% 0.75 jelatin bir steril 14 ml tüp içinde çözelti ve tortu ile enfekte olmamış ve halka-aşamalı IE izin vermek için 37 ° C sıcaklıkta 15-20 dk için bırakın. </li><li> Son aşama IE hasat etmek, yeni bir 14 ml tüp içine, üst faz, yani, 37 ° C sıcak RBC-yıkama ortamı 10 mL ile iki kez yıkanır. </li><li> Belirli bir anti-PfEMP 50 ul seyreltin37 2 ml ° C sıcak RBC yıkama medya ve steril filtre 1 antikorları. </li><li> 37, 30 dakika boyunca 14 ml steril tüp ile inkübe steril seyreltilmiş antiserumlar ° hafif ajitasyon ile C ile yıkanmış son aşama IE karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 800 xg&#39;de aşağı Spin, ve 37 ° C&#39;de sıcak bir RBC-yıkama ortamı 10 mL ile iki kez yıkanır. </li><li> Bir DynaMaq-15 mıknatıs kullanarak RBC-yıkama medya ile bir süspansiyon kez Dynabead Protein 50 ul yıkayın. </li><li> 300 ul RBC yıkama medya Dynabeads süspanse ve yıkanmış geç evre IE ekleyebilirsiniz. Nazik çalkalama ile 37 ° C &#39;de 30 dakika süre ile inkübe edin. </li><li> DynaMaq-15 mıknatıs tüp aktarın. 1-2 dakika bırakın ve tüm sıvı kaldırmak. </li><li> RBC-yıkama ortamı 4-5 ml Dynabeads yeniden süspanse edin. Mıknatıs üzerine tüpü geri aktarın ve tüm sıvı çıkarmadan önce 1-2 dakika bekletin. Kez yıkama adımı yineleyin. </li><li> 25 cm 2 steril kültür f yıkanmış boncuklar aktarın200 ul taze paketlenmiş kırmızı kan hücreleri içeren LASK. Kültürün içine Albumax medyanın 5-6 ml ekleyin. 37% 5 CO2 de bir gece ° C&#39;de saklayın </li></ol> 2. Gün <ol start="12"><li> Seçilen IE bir steril 14 ml tüp için tüm kültür aktararak taze kırmızı kan hücreleri reinvaded olan kültürden Dynabeads çıkarın. DynaMaq-15 mıknatıs üzerine tüpü koyun ve 1-2 dakika bekletin. Daha sonra, bir kültür şişesine tüm sıvı geri dökülür. </li><li> Olduğunca az% 5-10 parazitemi kadar mümkün olduğunca döngüleri ve parazitler için Kültür ringstage altındadır. </li><li> IE doğru yüzey fenotipini ya PFD1235w and/orPF11_0008 yani protein ekspresyonu 1 elde edilmiştir emin olmak için FACS tarafından analiz edilmelidir. </li></ol> 2. Sondalar hazırlanması Antisense RNA probları PFD1235w ve PF11_0008 var olan en değişken bölgelerin elde edildi &lt;P. den / em&gt; genler falciparum 3D7 genomik DNA. DNA, üreticinin tanım (Roche) &#39;ye göre, sırasıyla, PCR ile amplifiye edilir ve transkripsiyon için pSPT18 vektör ya da 19 içine klonlandı. Sondalar (580 baz çifti (bp) ve uzunluğu 590 bp) sırasıyla DIG RNA etiketleme Kiti veya Biyotin RNA etiketleme Mix kullanarak digoxigenin (DIG) veya Biyotin ile işaretlendi. İkimiz de Northern blot analizleri ile ve tek etiketli FISH analizi 1 ile probların özgüllüğü doğruladı. 3. İn Situ Hibridizasyon İnce Smear ve öncesinde Parazitler Fiksasyon 1. Gün Tüm adımlar RNase içermeyen bir ortamda gerçekleştirilir ve tüm reaktifler RNase içermeyen ya da dietil pyrocarbonate (DEPC) ya da RNaz Zap (Invitrogen) ile önceden tedavi edilen vardır. Slaytlar ve kapak camları artık üretim gres kaldırmak için alkol ile temizlenmelidir. Bu adımlar arasında herhangi bir duraklama olmadan protokolü gerçekleştirmek için önemlidirnükleaz kontaminasyon riskini en aza indirmek için. <ol><li> Standart yayma yöntemi 3 ile ince bir kan film yapın. Mikroskop 100x yağı objektif lens kullanarak IE saymak ve kültür IE yüzdesi hesaplanır. Parazit aşamalarını halka ve IE döngüsünün erken trofozoit aşamalarında, yaklaşık senkronize olduğunu kontrol edin. Bu ön-çoğaltma, tek çekirdekli aşamaları, ifade var gen mRNA ve bu tip tek bir hücre FISH transkripsiyon testleri için de uygundur. </li><li> 1.5 ml RNaz ücretsiz Eppendorf tüp,% 5-10 parazitemi de, parazitin kültür 50 ul aktarın. Oda sıcaklığı altında 2.000 rpm hızında 1 dakika için santrifüjleyin. </li><li> Ortamı çıkarın ve DEPC-işlenmiş su 50 ul PBS pH 7.2 ekleyin. Tüpü yavaşça çalkalayın. Medya ve hücre artıkları ücretsiz hücreleri yıkamak için iki santrifüj sedimantasyon adımı yineleyin. </li><li> Dört kaliteli ince smear olun. Her smear için, üzerine bir karalama yapmakiyi bir RNaz ücretsiz kaputu bir 4 sıra slayt, toplam yani dört cam slaytlar, (önemli bir adım) biri 11 mm çapında. Dalga kuru havaya kısaca kayar. Belirli bir prob, RNaz tedavi ve ilgilenilen genin ifade IE içeren üçüncü bir slayt için başka bir slayt kullanarak başka alakasız gen için tek prob boyama için kontroller-bir negatif slayt için üç ekstra slaytlar olun. 10-20 dakika tezgah üzerinde kurumasına slaytlar bırakın. </li><li> Kuyu içine% 4 paraformaldehid ve% 5 asetik asit içeren, tespit solüsyonu 60 ul ilave edilerek ince filmlerin düzeltildi. Oda sıcaklığında, tezgah üzerinde 10 dakika bekletin. </li><li> , Oda sıcaklığında nazik çalkalama ile 5 dakika için 2 x SSPE tampon içinde slaytlar yıkayın. Kısaca bir kağıt mendille hafifçe hücreleri içeren kuyular dokunarak aşırı sıvı kaldırmak. </li><li> 37 ° C&#39;de (çok önemli bir adım 2 dakika süreyle, 0.01 M HCl içinde% 0.01 pepsin ile slaytlar Kapak). Oda sıcaklığında 5 dakika için 2 x SSPE, slaytları yıkayın. </li><li> 10 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar, RNaz çözeltisi ile seyreltilir. RNaz solüsyonu 60 ul ile negatif kontrol yayma kaplayın. 37 ° C de 30 dakika inkübe ve daha sonra da oda sıcaklığında 5 dakika için 2 x SSPE, slaytları yıkayın. </li><li> Hibridizasyon adımı hemen geçin. </li></ol> 4. Sabit Slaytlara RNA problar Hibritleşmesi 1. Gün <ol><li> Böyle bir Thermostar 100 HC4 veya RNaz Zap ile püskürtme ve bir kağıt mendille silerek temizleyin, temiz bir fırın koymak boş bir pipet ucu kutusu olarak hibridizasyon odasının, hazırlayın. Hibridizasyon odasının veya slaytlar hibridizasyon sırasında kurumasına olmayacak emin olmak için DEPC-işlenmiş su ile kutunun alt kanalları doldurun. 48 odası ve ön ısıtma kapatın ° C. </li><li> 12 ng / ul nihai konsantrasyon için hibridizasyon probları çözelti içine seyreltilir. Bir ısıtma bloğu içinde 5 dakika için 65 ° C sonda çözelti denatüre. Hemen buz üzerinde soğutun. </li><li> Kısaca hava 2x SSPE yıkamadan sonra slaytları kurulayın. Dikkatlice bir kağıt mendille kuyu çevresinde aşırı sıvı kaldırmak. </li><li> Hibridizasyon odasının açın ve odasında slayt yerleştirin. Bir ya da kuyu başına 60 ul toplam hacim içinde, her iki sensör uygulanır. Dikkatlice steril forseps kullanarak bir RNaz içermeyen kapak kayma ile sıvı damlası kapsamaktadır. </li><li> Oda kapatın ve gece boyunca en az 16 saat süreyle 48 ° C &#39;de slaytlar melezleşir. </li></ol> 5. Antikor Konjugasyon ve Floresans Amplifikasyon 2. Gün Aşağıdaki adımları Perkin Elmer dan TSA Artı Flüoresans Palet sistemi dayanmaktadır. Tüm adımlar oda sıcaklığında yapılır. <ol><li> Nazik ajitasyon ile 5 dakika boyunca TNT tampon slaytlar 3 kere yıkayın. </li><li> 30 dakika için TNB tampon 150 ul kuyu Blok. </li><li> 1:500 oranında, TNB tamponu içinde 1:100 &#39;lük bir oran ile HRP-eşlenikli α-biotin antikor de TNB tampon içinde HRP-eşlenikli α-DIG antikoru seyreltilir. Bir kağıt mendille slaytlar emdiği TNB tampon çıkarın. Aynı anda iki transkript tespit edildiğinde her iki antikor seferde gidebilirsiniz. Kuyu başına antikor-TNB çözeltisinden 100 ul toplam miktar uygulanır ve dikkatli bir şekilde bir kapak slipi ile kaplayın. 2 saat için slaytlar inkübe edin. </li><li> Dikkatle kapak camları çıkarın. 5 dakika boyunca 3 kez TNT tampon slaytlar yıkayınız. </li><li> 1:500 oranında tyramide amplifikasyon reaktif içinde FITC-fluorofor seyreltilir ve her oyuğa 100 ul çözelti uygulanır. Kapağı makbuzları ile kuyu örtün ve 12 dakika inkübe edilir. </li><li> Dikkatlice kapağı fişleri çıkarın ve yavaşça sallanarak TNT tamponu içinde 5 dakika boyunca slaytlar 3 kere yıkayın. </li><li> 1:500 oranında tyramide amplifikasyon reaktif olarak Cyan3-fluorofor seyreltilir. Başına 100 ul ekleyinBu çözüm de. Kapağı makbuzları ile kuyu örtün ve 12 dakika inkübe edilir. </li><li> Kapağını çıkarın dikkatli kayıyor ve sonra TNT tampon batırılarak hızla slaytlar durulayın. </li><li> 5 dk için TNT tampon ile slaytlar 3 kere yıkayın. </li><li> DEPC-işlenmiş su hızlı bir şekilde slaytlar daldırın. </li><li> Kurumaya slaytlar bırakın. DAPI içeren anti-solmaya reaktifi ile slaytlar monte edin. Oje ile kapak camları köşelerinde mühürleyin. </li><li> Slaytlar artık mikroskopi için hazırız. Ol 4&#39;te alüminyum folyo ile kaplanmış ve mağaza slaytlar ° C deney ertesi gün tamamlanması için ise. Slaytlar iki tam bir sızdırmazlık solmaya karşı reaktif uygulamadan sonra 24 saat üzerinden gerçekleştirilebilir. Bu protokol tamamlandıktan sonra, slaytlar bir hafta için yansıma sağlar. </li></ol> 6. Melezleşmiştir Sondalar Görselleştirme <ol><li> Mikroskop açın. Standart bir immünofloresan mikroskop suffic olduğunuEğer bir konfokal mikroskop erişiminiz varsa deney bu tür ient, ama aynı zamanda 3D görüntüleri için kullanabilirsiniz ya da boyanmış hücrelerin videolar elde etmek. Mikroskop 15-30 dakika ısınmasını bekleyin. Bilgisayar ve yazılım açın. </li><li> Immünofloresan mikroskop boyama kalitesini kontrol edin. Birkaç parazitler içeren bir nokta seçin. </li><li> Elle her lazerin kazanç ayarlayın. Piksel 4-6 m -1 s -1 ve 512 x 512 piksel adımları yaşamak ayarlayın. </li><li> Çerçeve Lambda kullanarak bir test resim çekin. Lazer kazanç yeniden ayarlayın. </li><li> Floresan tek hücre 20 iyi resimler en az atın. 5-20 parazitler içeren bir alanda en az 2-5 fotoğraf pozitif parazitlerin yüzdesi adil bir bakış elde etmek için gereklidir. </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheeseborough%2C+M+%22District+Laboratory+Practice+in+Tropical+Countries%22">District Laboratory Practice in Tropical Countries</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).</li>
<li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117(2009).</li>
<li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li>
<li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li>
<li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li>
<li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li>
<li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li>
<li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

RNA FISH analizi, bu gibi Northern blot ve RT-PCR gibi yöntemlerin tersine, tek bir hücre düzeyinde spesifik mRNA transkriptlerinin ayrımı izin verir. Bu, P., bu örnekte, bu mümkün transkripsiyonel olarak aktif ve aktif olmayan hücreler arasında ayrım yapan falciparum parazitik insan kırmızı kan hücreleri içinde protozoa. Böyle tam hücreli gözlemler genelde gereklidir ve önemlidir ve roman transkripsiyonel desenler 1 çözülmeye olabilir. Diğer RNA FISH yöntemler <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Asetik asit </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax medya: RPMI 1640 Glutamine çözümü </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml çözelti glutamin </td></tr><tr><td> Albumax medya: Gentamisin sülfat Albumax-çözüm </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 ml gentamisin sülfat 50 ml Albumax çözelti </td></tr><tr><td> Albumax çözelti: Hipoksantin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hipoksantin </td></tr><tr><td> Albumax çözelti: AlbuMAX II </td><td> Bennvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax çözelti: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litre RPMI 1640 Max mıknatıslı çözülür. 50 ° C. Filtre sterilize ve alikotları -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td> Amberlit </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G&#39;nin </td><td> Formamid Deiyonize için Reçine. </td></tr><tr><td> Anti-biotin keçi pAb Peroksidaz Konjugat </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Dig antikoru </td><td> Novus Biyolojik </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI ile Anti-solmaya reaktifi </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> Montaj medya tamamen slayt sızdırmazlık önce 24 saat boyunca tedavi vardır. </td></tr><tr><td> Biotin RNA Etiketleme Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Kamera dijital </td><td> Nikon dijital görme DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Menzel-Glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> kültürü şişesi 25 cm 2 Nunclon yüzey </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32490-100ml </td><td> 1000 ml su içinde deinonized 1 mL DEPC. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 12 saat için karıştırın. 30 dakika süreyle otoklav. </td></tr><tr><td> Dijital fotoğraf makinesi </td><td> Nikon dijital görme DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads Protein A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Mıknatıs </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamid bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Deiyonize formamid: formamid 100 ml iyon değiştirme reçinesi 5 g. 30 dakika karıştırın. Whatman kağıt süzülür. </td></tr><tr><td> . Jelatin 0 75% çözüm: Jelatin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 500 ml RPMI 1640 içerisinde 3.75 g jelatin. 56 Isı ° C eritin. Zaman 56 ° C sterilize Filtre Alikots içinde -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td> . Jelatin 0 75% çözüm: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 içerisinde 3.75 g jelatin. 56 Isı ° C eritin. Zaman 56 ° C sterilize Filtre Alikots içinde -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td> Glutamin çözüm: L-glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 500 ml% 0,9 NaCl içinde 14,6 g L glutamin. Dağılma, filtre sterilize ve alikotları -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td> Glutamin çözüm: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 500 ml% 0,9 NaCl içinde 14,6 g L glutamin. Dağılma, sterilize filtre ve alikotları -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td> Hibritleşme çözüm: Formamid Bio ultra% 99 SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Toplam 20 ml -20 donmuş tutmak ° C alikotları 10 ml deiyonize formamid </td></tr><tr><td> Hibritleşme çözüm: Denhardt kullanıcısının 50x konsantresi </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> Hibritleşme çözüm: Maya tRNARoche engelleme reaktif </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt sitesi Ml maya tRNA başına 250 ul 20 mg </td></tr><tr><td><sSomon Sperm DNA:&gt; Hibridizasyon çözümü Trong </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31149-106GF </td><td> 0,4 g Roche reaktif engelleme Ml somon spermi DNA başına 10 mg (: denatüre somon spermDNA 96 5 dakika için ° C hibridizasyon çözeltisi ilave edilmeden önce Kritik) 1 mL </td></tr><tr><td> Hybridizer Thermostar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Hibridizasyon fırın ve DEPC su ile doldurulur RNaz ücretsiz hibridizasyon odaları tarafından değiştirilebilir. </td></tr><tr><td> Daldırma yağı UV şeffaf floresans ücretsiz </td><td> Sigma </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> İmmünofloresan veya konfokal mikroskop </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> Herhangi bir eczane mevcuttur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deiyonize H 2 O </td><td></td><td></td><td> PH 7.4 &#39;e Ajust 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 80 ml PBS / DEPC içinde 4 g PFA. PFA eriyene ° C kadar 65 Isı. 20 ml PBS ekleyin, çözüm soğumasını bekleyin. PH 7.4 &#39;e ayarlayın. Filtre. -20 ° C&#39;de alikotları Mağaza </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde% 4 / Asit asetik 5% </td><td></td><td></td><td> 950 ul paraformaldhyde + 50 ul asetik asit </td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Peroksidaz-konjuge anti-biotin </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC yıkama ortamı: RPMI 1640 Glutamine çözümü </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 çözeltisi 5 ml glutamin </td></tr><tr><td> RBC yıkama ortamı: Gentamisin sülfat </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2.5 ml gentamisin sülfat </td></tr><tr><td> RNaz </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Bir 10 mg / ml stok çözeltisi edin. </td></tr><tr><td> RNaz ücretsiz 1.5 ml tüp </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> 11mm 4 kuyu Slaytlar </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l), 0,3 M Na sitrat, 3 x H2O (88 g / l), 1M HCI ile pH 7.0 &#39;a ayarlayın </td></tr><tr><td> SSC 20x: Sodyum sitrat dihidrat </td><td> Sigma / aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l), 0,3 M Na sitrat, 3 x H2O (88 g / l), 1M HCI ile pH 7.0 &#39;a ayarlayın </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175.3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27.6 g NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA toz </td><td></td><td></td><td> 9.4 g EDTA tozu DEPC su ekleyin, pH 7.4 ayarlayın. Oto20 dakika için Clave </td></tr><tr><td> TNB tampon: TNT tampon </td><td></td><td></td><td> 10 ml tampon TNT </td></tr><tr><td> TNB tampon: Engelleme reaktifi </td><td></td><td></td><td> 0.05g Engelleme reaktifi Bloke edici reaktif çözmek için, bir taraftan karıştırılarak bir saat süreyle 60 ° C ila çözelti ısıtın. -20 ° C&#39;de saklayın (Perkin Elmer TSA-protokol türetilen.) </td></tr><tr><td> TNT tamponu: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1 M Tris / HCl, pH 8.0 </td></tr><tr><td> TNT tamponu: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT tamponu: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl içeren 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Oda sıcaklığında, pH 7.5 &#39;e ayarlayın. (Perkin Elmer TSA-protokol türetilen.) </td></tr><tr><td> TSA artı Cyanine3 / Floresein sistemi </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Deney başlamadan önce dikkatlice TSA Artı Flüoresans Palet Sistemi protokolü okuyun. </td></tr><tr><td> Steril tüpler 14 ml </td><td> Almeco - CM LAB Aps </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

rna floresan tarafından tek hücreli gen transkripsiyon analizi<em&gt; in situ</em&gt; hibridizasyon (fish)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Sıtma enfeksiyonları sırasında insan endotel reseptörlerine Plasmodium falciparum enfekte eritrositler (IE) Yapışma var genler tarafından kodlanan PfEMP1 protein varyantları ifade aracılık etmektedir. Haploid P. falciparum genom tek bir enfeksiyonun kan aşaması sırasında her defasında hücre başına transkribe olduğu düşünülmektedir edilmiş olan yaklaşık 60 farklı var genler barındırır. Nasıl var gen transkripsiyonu gibi birbirini dışlayan düzenleme elde edilir belirsizdir, bireysel var genleri veya P. klinik sonuçlar üzerinde farklı reseptörleri ve diferansiyel bağlama sonucu ile ilişkili var genlerin alt gruplarının tanımlanmasıdır falciparum enfeksiyonlar. Son zamanlarda, birbirini dışlayan transkripsiyon paradigması bireysel P. esas transkripsiyon analizleri ile şüphe içine adı olmuştur Tek inf içinde falciparum transkript tespitiP. bireysel çekirdeklerinde parazit var gen transkripsiyonu in situ hibridizasyon RNA floresan kullanarak ected eritrotik hücreleri (FISH) analizi falciparum IE 1. Burada, P. tek-çekirdekleri var in gen transkripsiyonu analizi için RNA FISH yöntemi gerçekleştirmek için bir protokol ayrıntılı sunmak falciparum insan eritrosit etkilemiştir. Yönteminin kullanımını esas digoxigenin-ve TSA Artı Flüoresans Palet Sistemi 2 (Perkin Elmer), mikroskopik analiz ile taze seçilmiş S. antisens RNA probları kullanılarak biyotin-etiketli falciparum IE. In situ hibridizasyon metodu ile de P. farklı aşamaları sırasında ifade edilen genlerin transkripsiyonu ve çeşitli düzenleme izlemek için kullanılabilecek falciparum yaşam döngüsü ve diğer sıtma parazit türlerinin ve diğer organizmalar ve hücre tipleri uyarlanabilir.

Şekil 1, büyük adımlar ve RNA FISH yöntemin zaman süresinin bir akış şeması gösterilmektedir. Tek P. kullanarak iyi ve kötü korunmuş lekeli mRNA BALIK deneyler temsili görüntüleri bir dizi falciparum IE Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bu intrasellüler protozoon DAPI ile mavi lekeli bir küçük (1-1.5 mikron çapında) çekirdeğe sahip. Yirmi dört saat P. eritrosit işgalinden sonra falciparum schizogony, yani nükleer bö...

Floresan<em&gt; In situ</emBireysel hücrelerde mRNA transkriptleri tanımlamak için&gt; hibridizasyon (FISH) bu tür birden fazla üyesinin eşzamanlı olarak transkripsiyon aktivitesi polijenik analizinin yapılmasını mümkün kılar<em&gt; Var</em&gt; Multigen aile<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Enfekte eritrositler<sup&gt; 1</sup&gt;. Bu teknik uyarlanabilir ve genler, hücreler ve organizmalar farklı türlerde kullanılır.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Sıtma enfeksiyonları sırasında Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositlerin (IE) insan endotelyal reseptörlerine yapışması, var genleri tarafından kodlanan PfEMP1 protein varyantlarının ekspresyonu aracılığıyla gerçekleşir. Haploit P. falciparum genomu, yaklaşık 60 farklı var geni barındırır ve enfeksiyonun kan aşamasında, her hücrede aynı anda yalnızca bir tanesinin transkribe edildiğine inanılmaktadır. var geni transkripsiyonunun bu şekilde karşılıklı olarak dışlayıcı düzenlemesinin nasıl sağlandığı, farklı reseptörlerle ilişkili bireysel var genlerinin veya var genlerinin alt gruplarının tanımlanması ve farklı bağlanmanın P. falciparum enfeksiyonlarının klinik sonucu üzerindeki etkisi belirsizdir. Son zamanlarda, tekil enfekte eritrositik hücrelerdeki bireysel P. falciparum transkriptlerinin tanımlanmasına dayanan transkripsiyon deneyleri ve P. falciparum IE'lerinin bireysel çekirdeklerindeki parazit tarafından gerçekleştirilen var geni transkripsiyonunun RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) analizi ile, karşılıklı dışlayıcı transkripsiyon paradigması sorgulanmaya başlanmıştır. Burada, P. falciparum ile enfekte insan eritrositlerinin tekil çekirdeklerinde var geni transkripsiyonunun analizi için RNA-FISH metodolojisinin uygulanmasına yönelik detaylı bir protokol sunuyoruz. Yöntem, TSA Plus Fluorescence Palette System (Perkin Elmer) kullanılarak digoksigenin ve biyotin işaretli antisens RNA problarının kullanımına, mikroskobik analizlere ve taze seçilmiş P. falciparum IE'lere dayanmaktadır. In situ hibridizasyon yöntemi, P. falciparum yaşam döngüsünün farklı aşamalarında eksprese edilen çeşitli genlerin transkripsiyonunu ve düzenlemesini izlemek için kullanılabilir; ayrıca diğer sıtma paraziti türlerine, diğer organizmalara ve hücre tiplerine de uyarlanabilir.

Benim adım Elena Rand ve Danimarka'daki Kopenhag Üniversitesi Tıp Patolojisi Merkezi'nde çalışıyorum. Burada, dünyanın çeşitli bölgelerinden yaklaşık 60 kişi sıtma üzerine çalışmaktadır. Grubumuz plasmodium foci parazitleri ile çalışmaktadır.İnsanlarda sıtma hastalığına neden olan en şiddetli türlerdir. Plasmodium falciparum, konak hücrelere adezyon gibi çeşitli işlevlere sahip yüzey proteinleri eksprese eder. Adezyon proteinlerinin en büyük grubunu, PfMP1 olarak adlandırılan Plasmodium falciparum eritrosit membran proteini 1 oluşturur.Enfeksiyonun kan aşaması sırasında, hücre başına aynı anda yalnızca bir tanesinin transkribe edildiğine inanılan en az 60 varyant bulunmaktadır. Bölümümüzde, parazitlerde aynı anda birden fazla proteinin transkribe edilebileceğine inanıyoruz. Bu tür bir aktiviteyi tespit etmenin bir yöntemi, mRNA floresan yerinde hibridizasyon balıklamasıdır.Burada, odum FCI enfekte eritrositlerin tek bir nüklüsünde iki farklı genin mRNA transkriptlerinin tespitine yönelik özel olarak hazırlanmış bir yöntem sunuyoruz. Yöntemin tamamlanması iki gün sürmektedir. İlk gün, RNA problarının hazırlanmasını, bunların cam slaytlardaki fikse edilmiş parazitlere eklenmesini ve

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücre içinde kendi doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar. Burada fare embriyonik kök hücreleri X kromozomu inaktivasyon incelemek için kullanılabilir FISH vasıtasıyla RNA ve DNA birleşik, eş zamanlı olarak saptanması için bir protokol açıklar.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Trofoblast dev hücreleri (TGC'ler), sağlıklı bir hamilelik sağlamak için plasentada anahtar bir rol oynar. İmplantasyon sonrası embriyoların kriyostat kesitleri veya embriyonik 7. gün ektoplasental konilerin kısa süreli kültürleri üzerinde yeni ortaya çıkan floresan in situ hibridizasyon ile TGC'lerdeki genlerin transkripsiyonel durumunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Trofoblast Dev Hücreler ya da<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Öğrenin, tek hücreli gen transkripsiyon analizi için RNA floresan in situ hibridizasyonu (FISH) yöntemini. Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositlerde çoklu gen ekspresyonunu eş zamanlı tespit edin.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi

Daha fazla video keşfet