Name: Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Keşfedin Protein Misfolding Cyclik Amplifikasyon (PMCA) tekniğini prion dönüşümünü ve tür bariyerlerini in vitro çalışmak için. Bu yöntem, prion suşlarını amplifiye ederek davranışlarını anlamaya ve güvenilir tespit yöntemleri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının eleştirel okuma için Dr Vesper Fe Marie Ramos teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 ve G20RR024001) ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve İnme (2R01 NS052609) tarafından desteklenmiştir.

1. Ekipman hazırlanması <ol><li> Bir Misonix 3000 veya 37 sabit bir sıcaklıkta tutmak için bir Thermo Electron NESLAB EX-7 su banyosu (Newington, NH) bağlı Misonix 4000 sonikatör (Farmingdale, NY) ° C kullanın Thermo Scientific (Waltham, MA) dan elde edilen kubbeli kapak ile 200 ul ince duvarlı tüp PCR şeritler örnekleri sonikasyon. </li><li> Yepyeni sonikatör sürekli çalışma 9 bir &quot;soygun&quot; dönemi gerektirir. Bir iki ay aradan-in dönemi 10 ayarlanmış genlik seviyesi ile 40 saniye sonication patlama ve 10 dakikalık inkübasyon döngüleri oluşur. Bir titanyum mikroplaka boynuz (Şekil 1, panel B) yüzeyi boyunca erozyon uyulması gerekir. Dolaşan su titanyum mikroplak boynuz erozyon nedeniyle beyaz bulanık görünecektir. Günlük bu suyu değiştirin. </li><li> PrP Sc amplifikasyon mikroplak boynuz boyunca değişir. En iyi PrP Sc amplifikasyon verim içinde elde edilebilirmikroplak boynuz (Şekil 1, panel C&#39;ye bakınız) merkezine 5 cm yarıçapında. </li><li> PMCA biri yuvarlak 144 döngüleri oluşur. Her döngü 5 saniye ile 10 dakika sonikasyon inkübasyondan oluşur. Bu kabaca PMCA yuvarlak başına 24 hr gerektirecektir. </li><li> Sonikatör kontrol panelinde görüntülenen sonication ve güç çıkışı, sonikatör en raf ve su banyosundan dolaşan su sıcaklığı mevcut PCR tüpleri sayısına göre değişir. Su 37 ° C&#39;de dengelenmiş olduğundan emin olun, ve sonikatör en tüp raf (Şekil 1, panel C)% 30&#39;dan fazla doldurmayın. Mikroplak boynuzu ile PCR tüpleri duyurun. PCR tüp stripleri arasındaki boş alan en az bir satır var ve (Şekil 1, panel C) şerit başına birbirine bağlı en fazla dört tüpler sağlar. </li><li> Sonikasyon gücü başarılı bir prion suşu amplifikasyonu için kritik önem taşımaktadır. Sonicating iken, bir güç çıkışı için genlik ayarlamak155 ~ 170 watt arasında değişen. Laboratuvarımızda güç seviyesi sırasıyla altı ve Misonix 3000 ve Misonix 4000 için yedi, ayarlanır. </li><li> Sert su lekeleri birikmesini önlemek için su banyosunda distile su kullanın. Bu su haftalık değiştirin. Kuluçka ve sonication çevrimleri sırasında, su yoğuşması mikroplak korna kapağı içinde meydana gelecek. Şekil 1, panel A&#39;da gösterildiği gibi yoğunlaşmayı önlemek için, sonikatör muhafazası kutusunun üstüne küçük bir akvaryumda ısı pedi takın </li></ol> 2. Hazırlanıyor <ol><li> Hayvanların kullanıldığı bütün işlemler Creighton Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan ve Kullanım Kurulu ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ile uyumlu yapılmıştır. Herhangi bir doku toplama önce, hayvan anestetize ve transkardiyal buz gibi soğuk fosfat ile perfüze olmalıdır beyin kan kaldırmak ve inhibisyonu önlemek için pH 7.4, 5 mM EDTA ile tamponlanmış tuz çözeltisiKan 7 tarafından PMCA reaksiyon. Aseptik teknik kullanarak hızla hayvan dokuları toplayın ve her prion suşu için özel diseksiyon araçları vardır. Diseksiyonu sonra, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpünün içindeki doku yerleştirmek, flaş kuru buz üzerinde dondurma ve -80 saklayın ° C homojenizasyon kadar. </li><li> PMCA alt tabaka (PrP C) çözelti hazırlamak için, bir Tenbroeck doku öğütücü kullanılarak buz gibi soğuk tampon dönüştürme ile bir% 10 ağırlık / hacim (ağırlık / hacim) çözeltisi (parça 3) için bir etkilenmemiş beyin hamsteri (BM BH) homojen hale getirilir. Homojenleştirici iken, çözüm köpük aşırı önlemek için taşlama içine hava almak için dikkatli olun. 30 sn ve kısım 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine süpernatant için 500 xg&#39;de santrifüj çözümü netleştirin. -80 ° C&#39;de saklayın, daha sonra kullanmak kadar. </li><li> PMCA tohum (PrP Sc) çözeltisi hazırlamak için, buz Wate ile% 10 w / v çözüm bulaşıcı bir malzeme (beyin, dalak, lenf düğümleri, diğer dokulara veya kontamine toprak) homojenize0,6 ml mikrosantrifüj tüpleri r ve kısım çözüm. -80 ° C&#39;de saklayın, daha sonra kullanmak kadar. </li></ol> 3. Dönüşüm Tampon Hazırlanması <ol><li> 50 ml&#39;lik bir balon jojeye (sonuç Triton X-100,% 1 son konsantrasyon) (; Steinheim, Almanya Sigma-Aldrich GmbH) içinde Triton X-100, 0,5093 g tartılır. </li><li> Biri Komple Proteaz İnhibitör Tablet (; Mannheim, Almanya Roche Diagnostics GmbH) ekleyin. </li><li> EDTA 0,0931 g (bu EDTA, 5 mM nihai konsantrasyon neden olur (), Phillipsburg, NJ Mallinckrodt Baker, Inc) ekleyin. </li><li> 1N NaOH ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. </li><li> Dulbecco Fosfat ile 50 ml hacim ayarlama (; Manassas, VA Mediatech Inc) (DPBS) Tamponlu Tuzlu. </li><li> Bir vakumlu filtrasyon cihazı ile bir 0.45 mikron nitroselüloz membran ile çözelti filtre. Dönüşüm tampon fazla bir ay için 4 ° C sıcaklıkta saklanabilir. </li></ol> 4. PMCA kullanma Prion Suşlarının Amplifikasyon <ol><li>PCR tüp içine 1:20 oranında (PMCA tohum ve PMCA alt tabaka 95 ul, yani karışım 5 ul) de PMCA alt tabaka içine PMCA tohum seyreltilir. -80 15 ul kısım çıkarın ve saklayın ° unsonicated kontrolü için C; Bu unsonicated kontrolü Western Blot (WB) analizi takip proteinaz K (PK) sindirim yoluyla PrP Sc amplifikasyon ölçmek için kullanılacaktır. İlave bir kontrol unsonicated PMCA reaksiyon süresi boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir ikinci 15 ul alikot yerleştirilmesi ile oluşturulur olabilir. Üç tekrarları en az istatistiki amaçlar için gereklidir. </li><li> Konu Şekil 1 ile ilgili olarak tarif PMCA bir tur için örnek geri kalanı (70 ul) eklendi Panel A. çalkalayın tüpler PCR tüpün kubbeli kapak üzerinde su yoğuşmayı önlemek için her 5 saat. </li><li> Numune tüpler aşağı döndü ve yavaşça homog sağlamak için herhangi bir işlem sonrası açmadan önce (çözüm kubbeli kapağı girmeyiz dikkatli olmak) vortekslenerek edilmelidireneity ve potansiyel kontaminasyon. </li><li> Kısa bir kuluçka süresi suşları (örneğin, HY TME HaCWD, ya da 263K) seri PMCA (sPMCA) için taze enfekte olmamış 95 ul içine yuvarlak bir ikinci sonicated örnek 5 ul transfer ederek 1:20 oranında sonicated madde seyreltik beyin homojenatı (Şekil 2, Panel B). </li><li> Uzun kuluçka süresi suşları (örneğin, DY TME, 139H, 22CH, 22AH, ya da ME7H) arasında sPMCA için, enfekte olmamış taze 50 ul içine yuvarlak bir ikinci sonicated örnek 50 ul transfer ederek 1:1 oranında sonicated madde seyreltik beyin homojenatı (Şekil 2, Panel B). </li><li> Önceden seyreltilmiş sonicated karışımı (adımlar 4,4 ya da 4,5) iki alikotları 15 ul çıkarın ve -80 az biri depolamak 37 ° C&#39;de ve diğer ° C (PMCA boyunca iki unsonicated kontrol çözümleri). Bir PMCA yuvarlak iki kalıntıları koşuluyla. </li><li> Bu prosedür, süresiz olarak tekrar edilebilir. Laboratuvarımızda, bizdeğişmeden kalan zorlanma özellikleri ile, onbeş PMCA mermi kadar gerçekleştirdik. </li><li> PK örnekleri sindirimi. Tipik bir DB, 5 örnek PK 80 ug / ml ila 5 ul (bu çözelti 40 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon PK sahip olacaktır) ul ve bir saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir karıştırın. Jel yükleme tamponu 10 ul ekle. 10 dakika için bu çözelti kaynatılır. Çözüm soğumasını ve jel içine 10 ul yük olsun. </li><li> Amplifikasyon başarı hesaplamak için ya bunları karşılaştırarak amplifiye PrP Sc miktarını tahmin etmek için PK-sindirilmiş örnekler üzerinde WB analizi gerçekleştirmek, unsonicated kontrolleri 20,21 Şekil 2, Panel C veya bilinen miktarda rekombinant PK-sindirilmemiş PrP. </li></ol> 5. Çapraz bulaşma kaçınmak Kritik adımlar çapraz kontaminasyon ve proteaz dayanıklı ürünler de novo oluşumu nedeniyle yanlış pozitif oluşumunu en aza indirmek için alınması gerekir. </p&gt; <ol><li> Her prion suşu için numune toplama için diseksiyon araçları özel bir kümesi (yani forseps, cımbız, makas) kullanın. </li><li> PMCA bir alt tabaka olarak kullanılmak üzere etkilenmemiş beyin homojenleştirme öncesinde,% 1 çamaşır suyu ile pipetler temizleyin. 10 dakika süreyle% 1 çamaşır suyu ile sonikatör en PCR tüp raf, doku homojenizatör ve PCR tüp depolama rafları ıslatın ve distile su ile iyice durulayın. </li><li> Bir taze Versi-kuru Lab Soaker yeni bir numune homojenize edilmesi için her zaman birlikte çalışma alanı Kapak, bir yeni deneme PMCA hazırlanması için, ya da sPMCA mermi arasında aliquoting. </li><li> Yeni eldivenler yeni örnekler (sPMCA mermi arasında alikotları aktarırken özellikle) ele alınır, her zaman kullanın. </li><li> Her PMCA döngü için kısa sonication patlamaları kullanın. 10 dakika inkübasyon ile birlikte 5 saniye sonication döngüleri de novo PrP Sc 1,20,21,23,24 oluşturmadan prionlar yükseltmek için yeterlidir. Diğer laboratuarlar gösterildiği gibi, artansonikasyon zaman, sonication genlik artırmak ve PMCA döngü sayısı uzanan de novo PrP Sc oluşumu 2 için olasılığını arttırmaktadır. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+properties+of+the+prion+protein+from+two+strains+of+the+transmissible+mink+encephalopathy+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent.</a> J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+PrP+properties+suggest+the+molecular+basis+of+strain+variation+in+transmissible+mink+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy.</a> J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+biologically+distinct+strains+of+transmissible+mink+encephalopathy+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters.</a> J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).</li>
<li>Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134, 757-768 (2008).</li>
<li>Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+propagation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cell-free propagation of prion strains.</a> EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).</li>
<li>Caughey, B., Raymond, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie-associated+form+of+PrP+is+made+from+a+cell+surface+precursor+that+is+both+protease-+and+phospholipase-sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive.</a> J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).</li>
<li>Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+native+prions+from+minimal+components+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation of native prions from minimal components in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+different+scrapie+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Competition between different scrapie agents in mice.</a> Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).</li>
<li>Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+prions+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious prions in urine.</a> FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).</li>
<li>Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high+fidelity+prion+amplification+within+and+across+prion+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers.</a> PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yükseltici bulaşıcı prion proteinlerin Zorluklar in vivo deneyler uzun inkübasyon süreleri ve giderleri vardır. PMCA tekniği bulaşıcı prion ajanları güçlendirmek için uygun maliyetli bir yoludur. Birkaç laboratuar doğru vitro 7, 9, 12, 14, 19,24 içinde prion suşları yükseltmek için PMCA yeteneğini doğruladı. Prion hastalıkları türler arasında aktarılabilir. Bessen ve Marsh etkili iki ayrı hamsterden türetilmiş prion suşları 5 üretilen bulaşıcı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman </td><td> Üretici </td><td> Kedi. Numara </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck Doku Öğütücü </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> NESLAB EX-7 Su Banyosu </td><td> Thermo Electron </td><td> NESLAB EX-7 </td></tr><tr><td> 0.2 ml PCR Tüp Şeritler </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> Komple Proteaz İnhibitör </td><td> Roche </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT Baker </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt Baker Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Versi-Kuru Lab soakers </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Repti Therm Isıtıcı </td><td> Zoo Med Laboratories, Inc </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

prionlar protein misfolding döngüsel amplifikasyon

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prionlar hayvan ve insanlarda 9,18 olarak kaçınılmaz ölümcül bulaşıcı süngerimsi ensefalopati (TSE) neden bulaşıcı ajanlardır. Prion proteini iki farklı izoformu, bulaşıcı olmayan ana-kodlanmış protein (PrP C) ve enfeksiyöz protein (PrP Sc), PrP C 8 anormal katlanmış izoformu vardır. Prion ajanlar ile çalışan zorluklardan biri öncesinde ev sahibi inokülasyon 13 sonrasında klinik bulguların gelişimi uzun bir kuluçka dönemidir. Bu geleneksel olarak uzun ve pahalı hayvan biyoassay çalışmaları görevlendirdi. Ayrıca, PrP Sc biyokimyasal ve biyofiziksel özelliklere kötü onların sıradışı konformasyon ve agregasyonu devletler nedeniyle karakterize edilir. PrP Sc in vitro 14 PrP Sc PrP C tohum dönüşüm yapabilirsiniz. PMCA Adva alır bir in vitro bir tekniktirPrP C ve PrP Sc tohum 19 dakika miktarları aşan miktarda içeren bir sistem, giderek artan bir oranda, PrP Sc büyük miktarlarda üretmek için sonication ve inkübasyon döngüleri kullanarak bu yeteneği ntage. Bu teknik, etkili prion zorlanma girişime taklit etmek, PrP C PrP Sc dönüştürme türleri ve gerilme özgüllük özetlemek için, ve enfekte dokuları, sıvıları ve çevresel örneklerde 6,7,16 gelen PrP Sc çok düşük seviyelere yükseltmek için kanıtlanmıştır 23. , Kontaminasyonu en aza tutarlı sonuçlar üreten, ve bu sonuçların ölçülmesi için öneriler içeren bu kağıdı ayrıntıları PMCA protokolü. Biz de bulaşıcı prion suşları, prion zorlanma girişim, ve çevre Prionların algılama üretimi ve karakterizasyonu gibi çeşitli PMCA uygulamaları tartışmak.

Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) İn vitro 7 PrP, Sc, 12, 14, 19, 24, yükseltmek için kullanılır. Başarılı amplifikasyon PrP Sc, Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi PK-dirençli prion proteini (hamsterden türetilmiş prion suşları için 19 ila 30 kDa geçiş) Western blot üzerinde bant yoğunluğunda bir artış ile gösterilmiştir. Kendi bant yoğunluk artışı sonra PMCA PK-dirençli PrP Sc malzeme amplifikasyon gösterir. Hamsterden türet...

Protein misfolding siklik amplifikasyon (PMCA) Prion dönüşüm ve zorlanma ve tür engellerin çalışma için bir in vitro testtir. Aynı zamanda, bir prion saptama sistemi olarak da kullanılabilir.

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Prionlar, hayvanlarda ve insanlarda kaçınılmaz olarak ölümle sonuçlanan bulaşıcı spongiform ensefalopatiye (BSE) neden olan enfeksiyöz ajanlardır9,18. Prion proteini ...

Bu prosedürün amacı, hamster adapte PreOn suşlarını in vitro ortamda başarıyla çoğaltmaktır. Bu işlem, öncelikle substrat olarak kullanılacak enfekte olmamış hamster beyninin homojenize edilmesi ve ardından tohum olarak kullanılacak enfekte dokunun hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, substrat ve tohum PCR tüplerinde karıştırılır ve ardından sonikasyon ve inkübasyon döngüleri aracılığıyla protein katlanma bozukluğu döngüsel amplifikasyonu veya PMCA uygulanır.Ardından, amplifiye edilen materyal taze substrat ile seyreltilir, in vitro ortamda seri olarak amplifiye edilir ve ardından PMCA uygulanır. Son olarak, örnekler proteinaz K ile digeste edilir ve ardından western blot ile analiz edilir. Nihayetinde, western blot'taki bant yoğunluğundaki artış, prion suşunun in vitro amplifikasyonunu belirlemek için kullanılabilir.Bu yöntem, PreOn amplifikasyonunda yer alan önemli ko-faktörler nelerdir gibi PreOn alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, bu yöntemi yeni deneyimleyen kişiler, tekniğe ilişkin küçük ama önemli detaylarda zorluk yaşayabilir ve numuneler arası çapraz kontaminasyonu önleme konusunda sıkıntı çekebilirler. Homojenizasyondan önce pipetleri %1'lik çamaşır suyu ile silin; aynı şekilde sonikat PCR tüp rafı, doku homojenizatörleri ve PCR tüp saklama raflarını da çamaşır suyu ile doyurun.10 dakika sonra, her bir ekipmanı distile su ile iyice durulayın ve ardından çalışma alanını taze bir Verly dry lab Soaker ile kaplayın. Şimdi, enfekte olmamış bir hamster beynini %10 ağırlık/hacim oranında bir çözeltiye getirmek için bir 10 buric doku parçalayıcı ve taze hazırlanmış buz gibi soğuk konversiyon tamponu kullanarak homojenize edin. PMCA substrat çözeltisini kullanın, ardından homojenatı 15 mililitrelik konik tüplere yerleştirin ve homojenize edilmiş çözeltiyi 500 ×g'de 30 saniye boyunca santrifüj ederek berraklaştırın.Ardından, büyük pelet alikotuna değmemeye dikkat ederek, elde edilen süpernatantı 1,5 ml'lik mikro santrifüj tüplerine aktarın. PMCA tohum çözeltisini hazırlamak için, hasat edilen enfeksiyöz materyali, az önce gösterildiği gibi %10 ağırlık/hacim oranında bir çözelti haline gelecek şekilde homojenize edin; ancak konversiyon tamponu yerine daros fosfat tamponlu salin veya DPBS kullanın ve ardından çözeltiyi 0,6 ml'lik mikro santrifüj tüplerine alikotlayın. Amplifikasyon prosedürüne başlamadan önce, çalışma alanını taze, steril bir laboratuvar emici havlusuyla kaplayın; PMCA substratını 200 µL'lik ince duvarlı PCR tüp şeridine aktarın ve PMCA tohumunu bunun içine 1:20 oranında seyreltin; toplam dört replikayı kırmızı etiketli tüplere yerleştirin.Her örneğin 15 µL'lik iki tekrar alikotunu, -80 °C doyurulmamış kontrol olarak kullanmak üzere mavi etiketli PCR tüplerine yerleştirin. Her örnekten 15 µL'lik iki tekrar alikotunu daha, ek bir doyurulmamış kontrol olarak 37 °C'de saklanmak üzere PCR tüplerine yerleştirin. Ardından, -80 °C doyurulmamış kontrolleri -80 °C bir dondurucuya ve diğer doyurulmamış kontrolleri PMCA reaksiyonu süresince 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.Şimdi, her bir örneğin geri kalan 70 µL'sini içeren PCR tüp şeridini, 37 °C sabit sıcaklığa ayarlanmış bir sirkülasyonlu su banyosuna bağlı bir sonikatöre yerleştirerek ilk PMCA amplifikasyon turuna başlayın. Çapraz kontaminasyonu kontrol etmek için sadece PMCA substratı içeren bir PCR tüpü yalancı kontrol olarak eklenebilir; PCR tüplerini mikroplaka boynuzuna yayarak sonikatör tüp kapasitesinin %30'undan fazlasını doldurmayın. PCR tüp şeritleri arasında en az bir sıra boşluk bırakın ve şerit başına en fazla dört tüpün birbirine bağlı olmasına izin verin.P-R-P-S-C amplifikasyonu, mikroplaka horn boyunca farklılık göstermektedir. En iyi P-R-P-S-C amplifikasyon verimliliği, mikroplaka horn merkezinden beş santimetrelik bir yarıçap içinde elde edilir. Bir PMCA turu, her döngüde beş saniyelik sonikasyon ve 10 dakikalık inkübasyon olmak üzere toplam 144 döngüden oluşur ve bir PMCA turu yaklaşık 24 saat sürer; sonikasyon sırasında genlik, güç çıkışının 155 ile 170 watt arasında olacağı şekilde ayarlanmalıdır.Su yoğunlaşmasını ve buna bağlı olarak numunelerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için sonikat kapağına bir akvaryum ısıtma pedi yerleştirin. Döngü tamamlandıktan sonra PCR tüplerinin kubbe şeklindeki kapaklarında su yoğunlaşmasını önlemek için tüpleri her beş saatte bir çalkalayın. Tüp şeridini cihazdan çıkarın ve numuneleri santrifüj ederek dibe çöktürün.Ardından, tüpler açıldığında kontaminasyonu daha da en aza indirmek için çözeltiyi kapakta tutarak tüpleri nazikçe vorteksleyin. Kenarlara dokunmaktan kaçının ve kapağı temiz bir Kim wipe üzerine yerleştirin. Daha sonra, PreOn suşunun seri PMCA işlemi için sonikasyon uygulanmış örnekten 5 µL alarak 95 µL taze PMCA substratına aktarın.Her örnek için yeni eldiven kullanın. Ardından, sonikasyona uğramış örneklerin her birinden iki adet 15 µL'lik alikot alın; alikotlardan birini -80 °C'de, diğerini ise 37 °C'de saklayın. PMCA ikinci turu için sonikasyona uğratılmamış kontrol çözeltilerinin kalan kısımlarını, az önce gösterildiği gibi ikinci bir PMCA turuna tabi tutun.Bu adım istenilen sayıda tekrarlanabilir. Çapraz kontaminasyonu kontrol etmek için yalnızca enfekte olmamış beyin PMCA substratı içeren bir PCR tüpü dahil edilebilir; numuneler istenen tur sayısı kadar sonikasyona tabi tutulduktan sonra, 18 µg/mL proteinaz K'den 5 µL'yi; sonike edilmiş numune, -80 °C kontrolü ve 37 °C kontrolü ile ayrı PCR tüplerinde 5 µL oranında karıştırın ve numuneyi 37 °C'de bir saat boyunca sindirin.Ardından, sindirilmiş örneğe 10 µL jel yükleme tamponu ekleyin ve çözeltiyi 10 dakika boyunca kaynatın. Soğuduktan sonra, örnek ve jel yükleme tamponu karışımından 10 µL'yi bir Western blok jeline yükleyin. Amplifiye edilen P-R-P-S-C miktarını belirlemek için, Western blot'taki proteinaz K ile sindirilmiş örnek miktarını, sindirilmemiş kontrollerle veya bilinen proteinaz miktarlarıyla karşılaştırın.K sindirilmemiş rekombinant. P-R-P-C-P-M-C-A, P-R-P-S-C'yi in vitro ortamda amplifiye etmek için kullanılır; hamster uyumlu PreOn proteini, hamster CWD ve uyuşuk TME'nin başarılı amplifikasyonu, PMCA öncesi ve sonrası bant yoğunlukları karşılaştırılarak bu Western BLO analizinde görülebilir. P-R-P-S-C'nin proteinaz K sindirimini takiben yapılan Western BLO analizi; sırasıyla diglikozillenmiş, monoglikozillenmiş ve glikozillenmemiş prion proteinine karşılık gelen üst, orta ve alt bantları göstermektedir. Bazı PreOn suşları, elektroforetik hareketliliklerine göre birbirinden ayırt edilebilir.Örneğin, hamster CWD ve drowsy TME PreOn suşlarının migrasyonu arasında iki kilodaltonluk bir fark vardır. Bu yüksek sadakatli amplifikasyon, PMCA ile amplifiye edilen PreOn hamster CWD suşunun ilgili hamster CWD tohumuyla benzer elektroforetik migrasyon göstermesiyle ve aynı şekilde drowsy TME suşunun kendi drowsy TME tohumuyla karşılaştırıldığında benzer şekilde migrasyon göstermesiyle gözlemlenir. Çapraz kontaminasyon veya de novo P-R-P-S-C oluşumu meydana gelmezse, Western blot analizinde OFM kontrol PMCA örnekleri proteinaz k sindiriminden sonra temiz kalmalıdır.Bu prosedürü uygularken, çapraz kontaminasyonu önlemek amacıyla her yeni numune öncesinde tüm ekipmanların temizlenmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

protein-misfolding-cyclic-amplification-of-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

SDD-YAŞ hücrelerde polimerler gibi amiloid algılama ve karakterizasyonu için yararlı bir tekniktir. Burada, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamalarda mükellef kılar bir uyum göstermektedir.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Burada, son derece aktif Hsp104 hexameric AAA + protein mayası, protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi arıtma için bir protokol açıklar. Bu düzeni yakınlık arıtma için His6 etiketli inşa...

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Normal prionları sindirmek için proteolitik bir enzim ile inkübe edin ve dirençli agregaları sağlam bırakın.

Fare Beyin Dokusunda Yanlış Katlanmış Prion Protein Agregatlarının Western Blotting Kullanılarak Saptanması

Bu videoda, deterjan fraksiyonlaması ile birlikte sikloheksimid muamelesi kullanılarak yanlış katlanmış proteinler için bir bozunma testi açıklanmaktadır. Bu yöntem, yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemeye ve protein döngüsünün derinlemesine mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Protein agregatlarının prion benzeri yayılımı, son zamanlarda birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu protokolün amacı, nematod C. elegans'ın protein yayılımını izlemek ve prion benzeri olayları araştırmak için bir model sistem olarak nasıl kullanılacağını açıklamaktır.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Burada, bir basit, hızlı ve verimli prion amplifikasyon tekniği, gerçek zamanlı dönüştürme (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı yöntemi açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

Kanıt biriken patojenik protein toplamları deli dana gibi özelliklere sahip hücreleri arasında yaymak nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili fikir destekler. Burada, hücre hücre yayılma model organizma, Drosophila melanogasterdeli dana gibi toplamları görselleştirme sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır.

Drosophila Melanogaster deli dana gibi Protein toplamları izleme hücre hücre iletim

Süpürücüleri hastalıksız bölgelere kendi dışkılarıyla bulaşıcı bulaşıcı süngerimsi ensefalopati prionları translokasyonunda potansiyele sahiptir. Biz fare adapte skrapi prıonlar Amerikan kargalar sindirim sisteminde (Corvus brachyrhynchos), ölü hayvanların ortak bir tüketici olsa geçtikten sonra bulaşıcı kalırsa belirlemek için kullanılan ayrıntı yöntemleri.

Bir Kuş Türlerinin Sindirim Sistemi geçtikten sonra Bulaşıcı prions belirlenmesi için prosedürler

Keşfedin Protein Misfolding Cyclik Amplifikasyon (PMCA) tekniğini prion dönüşümünü ve tür bariyerlerini in vitro çalışmak için. Bu yöntem, prion suşlarını amplifiye ederek davranışlarını anlamaya ve güvenilir tespit yöntemleri geliştirmeye yardımcı olur.

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Daha fazla video keşfet