Name: Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi Ex ovo Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Öğrenin yaşlı tavuk embriyolarına gen transferi yöntemini ex ovo elektroporasyon kullanarak. Bu teknik, gelişimin ileri aşamalarında gen fonksiyonunu ve düzenlenmesini incelemek için etkili bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (; LU1455/1-1 DFG) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Ex ovo Kültürü <ol><li> Taze döllenmiş yumurtalar kuluçka için% 60 nem oranı ile 37.5 bir zorunlu taslak inkübatör (BSS160, Ehret, Almanya) ° C uzun yüzüne serilir. Daha uzun bir hafta boyunca 12 ° C de muhafaza yumurtalar kullanılmamalıdır. </li><li> 2.5 gün (evre HH17 hakkında) inkübasyondan sonra, yumurtalar dışarı almak ve kırmak için yönünü belirtmek için kalem ile üst etiketleyin. </li><li> Çatlama önce, temiz bir büyük Petri (; Greiner Bio-One GmbH, Almanya 145 mm çapında) içine yaklaşık 20 ml steril distile su dökün. </li><li> Büyük Petri kabına; başka küçük steril Petri (Greiner Bio-One GmbH 94 mm çap) yerleştirin. </li><li> Keskin bir metal kenarına altındaki yumurtaları kırın, dikkatli yumurta açın ve küçük Petri kabına her yumurta tüm içerik aktarmak. </li><li> Kapaklı büyük Petri Kapak ve başka bir inkübatör (BINDER GmbH, Tuttlinge, Almanya) koydudaha da kültürü için 37.5 ° C&#39;de yaklaşık% 60 nem. Gün arasında arzu edilen sayıda inkübasyondan sonra, embriyo elektroporasyon için de kullanılabilir. </li></ol> 2. Ex ovo Elektroporasyon Hazırlık <ol><li> 1.0-mm çapında (TW100F-4; Dünya Hassas Aletler) cam tüpler kullanılarak; bir mikroelektrot çektirmenin (Dünya Hassas Aletler, Berlin, Almanya PUL-100 Mikropipet Çektirme) ile cam kılcal çekin ve uygun bir cam içine kılcal damarların ucu kırmak çapı. </li><li> Elektroporasyon için uygun parametreler (yani embriyoların farklı dokuları ve boyut için farklı voltajlar) kurulmuş ve elektroporatörün (CUY21-Düzen; Nepa Gen, Chiba, Japonya) elektrotlar bağlanmak embriyoların hedef doku ve büyüklüğüne göre. </li><li> Ve bir işaretleyici gen, bir hedef genin kodlayan pCAGGS vektör içinde plazmidler, örneğin, cadherin7 (2.0 ug / ml bir konsantrasyona sahip pCAGGS-Cad7 Cad7) içeren bir plasmid çözeltisi hazırlayınörneğin, yeşil floresan protein (GFP; 0.25 mcg / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile pCAGGS-GFP). Sonra yeşil renk ile plazmit çözeltisi etiketlemek için% 0.1 &#39;lik bir son konsantrasyon (Sigma) ile hızlı Green ekleyebilir. </li><li> Bir ağız pipet kullanılarak plazmid çözeltisi ile kılcal cam yerleştirin. </li></ol> 3. Ex ovo Elektroporasyon Chicken Optik Tectum içine Gen Transferi <ol><li> Ex ovo kültürden sonra, örneğin, günde inkübasyon (E) 6 tarafından, tavuk embriyo ex ovo elektroporasyon için kullanılmaktadır. </li><li> Dikkatli bir şekilde ince forseps optik tectum üzerinde vitelline ve amniyon membran yırtılma ve tectum yüzeyinde steril% 0.9 sodyum klorür çözeltisi 3 damla ilave edin. </li><li> Ağız pipet kullanılarak kapiler cam tarafından tectum boşluğu içine plazmid çözeltisi enjekte edilir. </li><li> Tectum yanında bir tungsten iğne katot ve bir dikdörtgen plaka anot (CUY 661-3x7, Nepa Gen) ile elektrotlar yerleştirin vehemen tectum için elektroporatörün tarafından üretilen elektrik dalgaları (altı bakliyat, 25 V, 60 ms darbe uzunluğu, her durumda 100 ms aralıklarla) uygulanır. </li><li> Kapaklı büyük Petri kabı kaplayın ve inkübatör içine döner. Uygun gün (ör., 2 ya da 3 gün sonra, elektroporasyon) inkübasyondan sonra, tectum immüno-(Şekil 1) ve biyolojik tespiti için toplanır ve tespit edilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Ex ovo elektroporasyon ile Cad7 ve GFP bir eksojen proteinleri başarılı bir şekilde aşırı ekspresyonu bir örnek olarak Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Plazmid GFP Cad7 plazmid birlikte E6 az tectum içine electroporated zaman, iki veya üç gün elektroporasyon sonra embriyolar toplanmış ve düzeltildi. E8 de, GFP proteini kuvvetli bütün resimler montaj (Şekil 1A-C) içinde tectum cinsinden ifade edilir. Ayrıca, E9 de tectum ilgili bölümlerin,GFP protein (Şekil 1D yeşil) ve Cad7 protein (Şekil 1E kırmızı) ex ovo elektroporasyon in vivo büyük tavuk embriyo gen transferi için başarılı bir yöntem olduğunu düşündürmektedir (Şekil 1F sarı) coexpressed vardır. <img src="/files/ftp_upload/4078/4078fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Yi kodlayan plasmidin GFP ve Cad7 E6 azından tavuk tectum içine cotransfected zaman, iki ya da üç gün ex ovo elektroporasyon sonra GFP protein (yeşil) kuvvetli olarak E8 azından wholemount görüntü (AC) &#39;de gösterildiği ifade edilir. E9 azından tectum bölümleri içinde, GFP protein (D yeşil) ve Cad7 protein (E kırmızı) (F sarı) coexpressed vardır. BF, parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu: AC için A 200 mikron; DF D 100 mikron.

<ol><li>Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li>
<li>Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-20+expression+by+motor+neurons+is+regulated+by+Sonic+hedgehog+during+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Cadherin-20 expression by motor neurons is regulated by Sonic hedgehog during spinal cord development.</a> NeuroReport. 20, 365-370 (2009).</li>
<li>Luo, J., Ju, M. J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionalized+cadherin-7+expression+by+radial+glia+is+regulated+by+Shh+and+Pax7+during+chicken+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regionalized cadherin-7 expression by radial glia is regulated by Shh and Pax7 during chicken spinal cord development.</a> Neuroscience. 142, 1133-1143 (2006).</li>
<li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech. Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li>
<li>Dai, F., Yusuf, F., Farjah, G. H., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+targeted+silencing+of+developmental+control+genes+during+chicken+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced targeted silencing of developmental control genes during chicken embryogenesis.</a> Dev. Biol. 258, 80-90 (2005).</li>
<li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231, 592-600 (2004).</li>
<li>Kos, R., Tucker, R. P., Hall, R., Duong, T. D., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+introducing+morpholinos+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Methods for introducing morpholinos into the chicken embryo.</a> Dev. Dyn. 226, 470-477 (2003).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 10, 391-394 (1974).</li>
<li>Luo, J., Treubert-Zimmermann, U., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+guide+migrating+Purkinje+cells+to+specific+parasagittal+domains+during+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cadherins guide migrating Purkinje cells to specific parasagittal domains during cerebellar development.</a> Mol. Cell. Neurosci. 25, 138-152 (2004).</li>
<li>Luo, J., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+for+gene+transfer+into+older+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 233, 1470-1477 (2005).</li>
<li>Treubert-Zimmermann, U., Heyers, D., Redies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+axons+to+specific+fiber+tracts+in+vivo+by+altering+cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting axons to specific fiber tracts in vivo by altering cadherin expression.</a> J. Neurosci. 22, 7617-7626 (2002).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol ex ovo elektroporasyonla büyük tavuk embriyo (örneğin, E6 de optik tectum içine) gen transferi için bir kılavuz sağlar. Bu yöntem, büyük tavuk embriyo elektroporasyonla kullanılması uzanır ve kolay bir sonraki aşamada, in vivo gen fonksiyonu olarak incelemek için çok laboratuar uygulanabilir. E4 en az E7 için başarılı bir şekilde Embriyolar bu yöntem tarafından electroporated edilebilir ve electroporated embriyosu E15 11 kadar sağkalım olabilir. Beynin yanı sıra, bu yöntem ayrıca...

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Elektroporatör </td><td> Nepa Gen, Japonya </td><td> CUY21-Düzenle </td></tr><tr><td> Elektrotlar </td><td> Nepa Gen, Japonya </td><td> CUY661-3x7 </td></tr><tr><td> Kuluçka </td><td> Ehret, Almanya </td><td> BSS160 </td></tr><tr><td> Embriyo inkübatör </td><td> BINDER GmbH, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> Floresan mikroskop </td><td> Keyence, Deutschland GmbH </td><td> BZ-8000 </td></tr><tr><td> Petri </td><td> Greiner Bio-One GmbH, Almanya </td><td></td></tr><tr><td> Mikroelektrod çektirmenin </td><td> Dünya Hassas Aletler, Almanya </td><td> PUL-100 </td></tr></tbody></table>

tarafından eski tavuk embriyolar içine gen transferi<em&gt; ex ovo</em&gt; elektroporasyon

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

Tavuk embriyo embriyonik gelişim sırasında gen fonksiyonu ve regülasyonu çalışmak için mükemmel bir model sistemi sağlar. Ovo elektroporasyon içinde güçlü bir aşırı-express ekzojen genlerin yöntemi veya tavuk embriyo 1 in vivo olarak endojen genlerin aşağı düzenlenmesi. DNA plazmid kodlama genleri 2-4, küçük müdahale RNA (siRNA) plazmidleri 5, küçük sentetik RNA oligos 6 ve morfolino antisens oligonükleotidler 7 gibi farklı yapılar kolaylıkla elektroporasyonla tavuk embriyosu transfekte edilebilir. Ancak, ovo elektroporasyon yılında uygulanması erken kuluçka evrelerinde (evre HH20 daha genç - Hamburg ve Hamilton göre) az embriyo ile sınırlıdır 8 ve sonraki aşamalarında embriyo yılında uygulama için bazı dezavantajları (evre HH22 büyük var - yaklaşık 3.5 kalkınma gün). Örneğin, daha sonraki aşamalarda vitellin membran usu olanshall membran yapışmış ve kabuk bir pencere açarak müttefiki embriyoların ölümle sonuçlanan, damarların yırtılması neden olur; eski embriyolar bu embriyolar erişmek ve işlemek için zordur vitellin ve allantoik damarları ile kaplıdır; eski embriyo hareket kabuk nispeten küçük bir pencereden yönü şiddetle kontrol etmek zordur ve olup. Bu protokol; geç evrede (evre HH22 daha eski) az tavuk embriyosu gen transferi için bir ex ovo elektroporasyon yöntemi göstermektedir. Ex ovo elektroporasyon için, embriyolar Petri 9 kültüre ve vitellin ve allantoik damarları yaygın olarak yayılır. Bu koşullar altında, büyük tavuk embriyo kolayca erişilebilir ve manipüle edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntem, daha eski tavuk embriyo uygulanan ovo elektroporasyon in bir sakıncaları ortadan kaldırmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, plazmidler kolayca farklı bölüme transfekte edilebilirbüyük tavuk embriyo 10-12.

Daha sonra kuluçka dönemlerinde (Hamburger ve Hamilton evresi (SS) 22 yaşından büyük) az tavuk embriyosu gen transferi yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, dezavantajların üstesinden<em&gt; Ovo içinde</em&gt; Elektroporasyon büyük tavuk embriyo uygulanan ve gen fonksiyonu ve büyük gelişim aşamalarında yönetmelik çalışmak için yararlı bir tekniktir.

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

Tavuk embriyosu, embriyonik gelişim sırasındaki gen fonksiyonlarının ve düzenlenmelerinin incelenmesi için mükemmel bir model sistem sunar. In ovo elektroporasyon...

Bu prosedürün genel amacı, daha ileri gelişim aşamalarında gen fonksiyonunu ve düzenlemesini incelemek için yaşlı tavuk embriyolarına in vivo gen transferi gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle inkübasyonun yaklaşık 2,5. gününde bir yumurtanın kırılması ve tüm embriyonun bir Petri kabı sistemine aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, ilgili geni kodlayan plazmidin embriyonun uygun kısmına enjekte edilmesidir.Plazmidi enjekte ettikten sonra elektrotları embriyonun yanına yerleştirip in ovo elektroporasyon uyguladıktan sonraki son adım, elektropore edilmiş embriyoları analiz için toplamaktır. Nihayetinde, embriyoda aktarılan genlerin ekspresyonunu saptamak için immünohistokimya kullanılır. Bugün size tavuk BL'leri kullanarak in ovo elektroporasyonun nasıl yapılacağını göstereceğiz.Bu tekniğin temel avantajı, X'in, yaşlı tavuk embriyolarında gen transferi için kullanılan elektroporasyondaki sorunların üstesinden gelebilmesidir. Başarılı bir tavuk embriyosu X ovo kültürü için taze döllemiş yumurtaların kullanılması gerekir. 12 °C'de bir haftadan fazla saklanmış yumurtaları kullanmayın.2,5 günlük inkübasyonun ardından yumurtaları, 37,5 °C sıcaklık ve %60 nem oranına sahip z

gene-transfer-into-older-chicken-embryos-by-ex-ovo-electroporation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ovo elektroporasyon Civciv kuş embriyonun genetik manipülasyon sağlayan bir tekniktir. Bu tekniğin yaygın uygulamalar genlerin fonksiyonel analiz ve olası artırıcı unsurları içerir. Bu video HH 10 civciv embriyosunda nöral tüp elektroporasyon göstermektedir. Enjeksiyon tekniği ve uygun yumurta taşıma tartışılmıştır.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için...

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Embriyonik civciv retinal hücre kültürleri fotoreseptör biyoloji çalışma için değerli araçlar oluşturmaktadır. Biz kültür öncesinde retina plazmid elektroporasyon ovo ex dayalı etkin gen transferi tekniğini geliştirdi. Bu teknik önemli ölçüde bu sistem için uygun genetik manipülasyon yaparak, mevcut protokoller üzerinde transfeksiyon verimliliği artırır.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir Eski-ovo Elektroporasyon Yaklaşımı

İşitme organı işitmeye aracılık eder. Burada, gelişmekte olan tavuk işitme organında işitsel progenitör hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını incelemek için optimize edilmiş modifiye edilmiş bir in ovo mikro-elektroporasyon yöntemi sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em&gt; Ovo olarak</em&gt; Mikro-elektroporasyon

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Biz bıldırcın embriyo modeli sistemde çoklu proteinlerin hızlı ve verimli ifade izin veren bir yöntem olarak haberci RNA (mRNA) elektroporasyonu rapor. Bu yöntem floresan hücreler için kullanılabilir ve Elektroporasyon kısa bir süre sonra zaman atlamalı mikroskopinin in vivo hareketlerini kaydetmek.

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Öğrenin yaşlı tavuk embriyolarına gen transferi yöntemini ex ovo elektroporasyon kullanarak. Bu teknik, gelişimin ileri aşamalarında gen fonksiyonunu ve düzenlenmesini incelemek için etkili bir alternatif sunar.

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi

Daha fazla video keşfet