Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi Ex ovo Elektroporasyon

Daha sonra kuluçka dönemlerinde (Hamburger ve Hamilton evresi (SS) 22 yaşından büyük) az tavuk embriyosu gen transferi yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, dezavantajların üstesinden

Bu prosedürün genel amacı, daha eski gelişim aşamalarında gen fonksiyonunu ve regülasyonunu incelemek için in vivo olarak yaşlı tavuk embriyolarına gen transferi gerçekleştirmektir. Bu, ilk olarak yaklaşık 2.5 kuluçka gününde bir yumurtanın kırılması ve tüm embriyonun bir Petri kabı sistemine aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, ilgilenilen geni kodlayan plazmidi embriyonun uygun kısmına enjekte etmektir.

Plazmid yerleştirme elektrotlarını embriyonun yanına enjekte ettikten ve X ovo elektroporasyon gerçekleştirdikten sonra, son adım elektroporasyonlu embriyoların analiz için toplanmasıdır. Sonuç olarak, immünohistokimya, embriyoda transfer edilen genlerin ekspresyonunu tespit etmek için kullanılır. Bugün size tavuk BUL'leri kullanarak X oval elektroporasyonun nasıl yapılacağını göstereceğiz.

Bu tekniğin ana avantajı, X aşırı elektroporasyonun, yaşlı tavuk embriyolarında gen transferi için kullanılan aşırı elektroporasyon sorunlarının üstesinden gelebilmesidir. Tavuk embriyolarının başarılı X ovo kültürü, taze döllenmiş yumurtaların kullanılmasını gerektirir. 12 santigrat derecede saklanan yumurtaları bir haftadan daha uzun süre kullanmayın.

Yumurtaları, 2,5 gün kuluçka sonrası %60 nem ile 37,5 santigrat derecede zorunlu taslak kuluçka makinesinde uzun kenarlarına koyun. Embriyolar hamburger ve Hamilton hakkındayken. Aşama 17, kuluçka makinesinden yumurtaları çıkarın.

Her yumurtanın çatlama yönünü belirtmek için her yumurtanın üstünü bir kalemle etiketleyin. Yaklaşık 20 mililitre steril damıtılmış suyu 145 milimetre çapında temiz, büyük bir Petri kabına dökün. Büyük Petri kabına 94 milimetre çapında küçük bir steril Petri kabı yerleştirin.

Ardından, alttaki her bir yumurtayı keskin bir metal kenara karşı kırın. Yumurtayı dikkatlice açın ve tüm içeriğini küçük Petri kabına aktarın. Embriyonun iyi kalitede olmasını sağlamak için, yumurtanın tüm içeriği, vilin zarına herhangi bir zarar vermeden bir Petri kabı sisteminde normal yuvarlak bir formda tutulmalıdır.

Her yumurtanın içindekileri küçük bir tabağa aktardıktan sonra, büyük tabağı bir kapakla örtün. Petri kabı sistemlerini, X ovo elektroporasyondan önce yaklaşık %60 nem ile 37,5 santigrat derecede daha fazla kültür için başka bir inkübatöre koyun. 1.0 milimetre çapındaki cam tüplerden cam kılcal damarları çekmek için bir mikro elektrot poları kullanın.

Cam kılcal damarların ucunu uygun bir çapta kırın. Ardından, embriyoların farklı dokusu ve boyutu için farklı voltajlar gibi elektroporasyon için uygun parametreleri ayarlayın. Hedef dokuya ve embriyoların büyüklüğüne göre uygun elektrotları elektroya bağlayın.

Bir hedef geni ve bir işaretleyici geni kodlayan plazmitler içeren bir plazmit çözeltisi hazırlayın. Bu gösteride, kaderin yedi veya CAD yedi hedef ve yeşil floresan proteini veya GFP işaretleyicidir. Plazmit çözeltisini yeşil olarak etiketlemek için %0.1'lik nihai konsantrasyona hızlı yeşil ekleyin.

Son olarak, cam kılcal damarı plazmit solüsyonu ile doldurmak için bir ağız pipeti kullanın. Altı gün boyunca inkübe edilen X ovo kültüründen elde edilen tavuk embriyoları, X ovo elektroporasyonu için kullanılır. Bu işleme başlamak için, tilen ve amniyon zarlarını optik tektum üzerinde dikkatlice yırtmak için ince forseps kullanın ve tektumun yüzeyine üç damla steril% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyin.

Bir ağız pipeti kullanarak, plazmid çözeltisini cam kılcal damardan tektumun boşluğuna enjekte edin. Elektrotları bir tungsten iğne katodu ve bir dikdörtgen plaka anot ile tektumun yanına yerleştirin. Tektuma elektrik darbeleri uygulamak için hemen elektroyu kullanın.

Büyük Petri kabını kapakla örtün ve inkübatöre geri koyun İki veya üç gün sonra GFP ve CAD yedi'yi kodlayan plazmitlerin E altıda tavuk tektumuna elektroporasyonundan sonra, tektum toplanır ve immünoboyama için sabitlenir. Sonuçlar bu şekilde E sekizde gösterilmiştir. GFP proteini, buradaki tüm montaj görüntüleri ile gösterildiği gibi, tumda güçlü bir şekilde ifade edilir.

Panel A, parlak bir alan görüntüsüdür. Panel B, bir GFP görüntüsüdür ve panel C ortaya çıkar. Görüntü ayrıca, E'deki tektumun bölümlerinde, Panel D'de yeşil renkte görselleştirilen dokuz GFP proteini ve panel E'de kırmızı ile görselleştirilen CAD yedi proteini, panel F'de sarı renkle temsil edildiği gibi birlikte ifade edilir.Doğru yapıldığında, X ovo elektroporasyonun etkinliği %60 ila %100'dürBu sonuçlar, X ovo elektroporasyonun in vivo olarak yaşlı tavuk embriyolarına gen transferi için başarılı bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, yaşlı tavuk embriyolarına gen transferinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalı ve deneyinizde iyi şanslar