Name: Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol 15 K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Öğrenin, 15N metabolik etiketleme, immünopresipitasyon ve kantitatif kütle spektrometrisi kullanarak Chlamydomonas hücrelerinde gerçek protein-protein etkileşimlerini sahte olanlardan nasıl ayırt edeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz CF1β karşı antiserum için Olivier Vallon ederim. Bu çalışma Max Planck Topluluğu ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) ve Bundesministerium für Bildung und Forschung (Sistem Biyolojisi Girişimi FORSYS, proje GoFORSYS) hibe tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+a+macromolecular+complex%3A+the+toolkit+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li>
<li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitations+revisited%3A+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li>
<li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+%28QUICK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li>
<li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li>
<li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones%3A+cellular+functions+and+molecular+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li>
<li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas%3A+two+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li>
<li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li>
<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+EH+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).</li>
<li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSQuant%2C+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li>
<li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li>
<li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Geçici protein-protein etkileşimleri (QUICK-X) yakalamak için bir çapraz adım ve eşitsiz çöktürme verimleri 6 normalleştirmek için bir kontrol Yağış: Biz son zamanlarda HIZLI anlayışın iki iyileştirmeler girmiştik. Burada HIZLI iki fazla iyileştirmeler içeren bir protokol mevcut: birincisi, biz 15 N metabolik etiketleme için SILAC 5 değiştirin. Avantajları 15 N basit inorganik tuz olarak sağlandığı takdirde 15 N metabolik etiketleme, SILAC daha ucuz olmasıdır. Bundan başka, 15 N metabolik etiketleme ile HIZLI birçok bitki, mantar ve bakteri gibi, tüm amino asitler için organizmalar Prototrofik için uygulanabilir. Ve nihayet, SILAC 5,6 doğasında arginin-to-prolin interconversion 15 N etiketli peptidler ölçümü için bir sorun teşkil etmiyor. 15 N proteomik verilerin nicel değerlendirmesi için uygun araçlar için örnekler MSQUANT 12 veya ben vardırOMIQS 13. İkinci olarak, özellikle bir karşı bir örnek olarak, belirli bir hedef proteinle etkileşime protein miktarını azaltmak için bir vasıta olarak yakınlık modülasyon tanıtmak. Bu yaklaşımın avantajı, bir model sistemlerini oluşturmak için zor olan ya da tüm proteinler, elzem hedef durumunda üretilen edilemez devirme mutant inşasında circumvents olduğunu vardır. Ayrıca, potansiyel bir hedef protein yikiyor için hücre bir tepki olarak ortaya çıkan diferansiyel protein ekspresyonu neden yanlış yorumlamaları önler: diğer proteinlerin yanı aşağı-regüle ve immünopresipitasyon için kullanılan antiserum ile çapraz reaksiyona, onlar yorumlanır hedef proteinin gerçek etkileşim ortakları olarak. Son olarak, afinite modülasyon uygun bir antikor-antijen ile-bulma oranı olan ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır. Biz model organizma olarak Chlamydomonas reinhardtii bizim protokol uygulanmasına rağmen, Kolayca hücre kültürü içinde yetiştirilen ve azot kaynağı olarak amonyum nitrat ya da kullanabilir edilebilir herhangi bir diğer organizma için adapte edilebilir. ATP / ADP protein komplekslerinin Affinity modülasyon doğrudan doğruya GroEL/HSP60/Cpn60 ya da HSP90 şaperon sistemleri 14,15 gibi olan etkileşimi ve kohort substrat proteinleri ile ATP durumuna göre değişir diğer şaperonlar uygulanabilir, ya da herhangi bir diğer sistem ile yer edilebilir bağlanma afiniteleri ATP tarafından modüle edilir. Afinite modülasyon aynı zamanda protein etkileşimi ile afiniteleri HSP90 sistemleri 15 söz konusu olduğunda radicicol veya geldanamycin gibi belirli ilaç ile değiştirilmiş olduğu durumlarda için çalışması gerekir. Bizim protokol açık bir sınırlama gerektirir olmasıdır afiniteyle saflaştırılmış özel bir tedavi / ortağı proteinleri olan yakınlığından modüle ilaca duyarlı olduğu bilinen bir hedef proteine ​​karşı antikorlar. Bu nedenle, herhangi bir yüksek hacimli bir yöntemdir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimetil pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> -20 ° C&#39;de kurutulmuş Mağaza, kullanmadan önce doğrudan çözülür </td></tr><tr><td> (Tam, EDTA-ücretsiz) Proteaz inhibitörü </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adenozin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatin fosfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Kreatin fosfokinaz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP Dithiobis [süksinimidil propionat] </td><td> Sientific Thermo </td><td> 22585 </td><td> 4 at kurutulmuş Mağaza ° C </td></tr><tr><td> 15 NH4CI </td><td> Cambridge izotop laboratuvarları, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteinase Lys-C) </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin boncuklar (Poroszyme Tripsin İmmobilize) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Doğrudan kullanmadan önce kuvvetlice karıştırın </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm Disk </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; k metabolik etiketleme, immünopresipitasyon, kantitatif kütle spektrometrisi ve affinity modülasyon

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein etkileşimleri hücrede birçok biyolojik süreçleri için temel vardır. Bu nedenle, karakterizasyonu araştırmalarını 1 mevcut olduğu için yöntemler mevcut araştırma ve bir bolluk önemli bir rol oynar. Protein-protein etkileşimleri genellikle son derece dinamik ve hücre içi lokalizasyonu, translasyon sonrası modifikasyonlar ve yerel proteini çevreye 2 bağlı olabilir. Bu nedenle, co-immünopresipitasyon yaklaşımlar tercih 3 yöntemi olduğu için, doğal ortamda araştırılması gerekmektedir. Co-Çökelen etkileşim ortakları bir hedeflenmemiş bir şekilde hedefe yönelik bir yaklaşım içinde, ya da kütle spektrofotometresi (LC-MS/MS) ile immünoblot yoluyla tespit edilir. Bu ikinci strateji genellikle olumsuz özellikle güvenli bir unspecifically tetikleyici proteinlerin izlerini tespit çağdaş kütle spektrometre ve yüksek hassasiyet elde edilen sahte pozitif buluşları, çok sayıda tarafından etkilenir. Bir recenBu sorunun üstesinden gelmek için t yaklaşım fikrine dayanır unspecifically tetikleyici protein miktarları etkilenmemiş olması gerekir, belli etkileşim ortak düşük miktarda hücresel konsantrasyon RNAi ile azaltılır, belirli bir hedef proteini ile ortak bir çökelti kalmayacaktır. Bu yaklaşım, Nakavt 4 ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon QUICK adlandırılan yabani tip ve knock-down suşları immunoprecipitated protein miktarları ölçmek için Kararlı İzotop Hücre kültüründe Amino asitlerin Etiketleme (SILAC) 5 ve MS kullanır. 1:1 oranında bulunan kirletici proteinler, hedef proteinin özel etkileşim ortağı olarak yabani tip çökelti içinde zenginleştirilmiş olan olarak kabul edilebilir. Yenilikçi, HIZLI bazı kısıtlamalar taşır rağmen: İlk, SILAC maliyet-yoğun ve ideal arjinin ve / veya lizin için okzotrofik olan organizmalar için sınırlıdır. Addit Bunun yanında, arginin, ağır besleme durumunda, arginin-to-prolin interconversion sonuçional kitlesel bir peptid her prolin için vardiya ve biraz miktar daha sıkıcı ve 5,6 daha az hassas hale ışık arginin, ağır sulandırır. İkincisi, HIZLI antikorlar onlar knock-down mutantlar özler hedef proteini ile doymuş hale gelmez böyle titre gerektirir. Burada 15 N metabolik etiketleme için SILAC değiştirerek ve protein-protein etkileşimleri afinite modülasyonu için RNAi-aracılı knock-down değiştirerek HIZLI ve yukarıda belirtilen sınırlamaları aşan bir modifiye HIZLI protokol tanıtmak. Biz tek hücreli yeşil alg Chlamydomonas model organizma ve hedef protein 7 (Şekil 1) olarak kloroplast HSP70B eşlikçi olarak reinhardtii kullanarak bu protokolün uygulanabilirliğini göstermek. HSP70s özel ko-şaperonlar ve sadece ADP durum 8 yüzeyler ile etkileşim bilinmektedir. Bu özel kontrol etmek için bir araç olarak bu özellik faydalanmakonun nükleotid değişimi faktörü CGE1 9 ile HSP70B etkileşimi.

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma dayanmaktadır<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolik etiketleme, ATP, immünopresipitasyon ve kantitatif kütle spektrometresi varlığı / yokluğu ile protein-protein etkileşimleri yakınlıklarından modülasyonu.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein etkileşimleri, hücredeki birçok biyolojik süreç için temel teşkil eder. Bu nedenle, bu etkileşimlerin karakterizasyonu ... konusunda önemli bir rol oynamaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çözünür ve membran proteinleri içeren hücre ekstraktlarında, belirli bir hedef proteinle özel olarak etkileşime giren proteinleri tanımlamaktır. İlk olarak, chlamydomonas hücrelerinin nitrojen 14 ve nitrojen 15 ile tam metabolik etiketlemesini gerçekleştirin ve TP içeren ve içermeyen hücre lizatları oluşturun. İsteğe bağlı bir çapraz bağlama adımı, geçici protein-protein etkileşimlerini stabilize etmeye yardımcı olur. Ardından, hücre lizatlarını, hedef proteinin ve onun spesifik etkileşim ortaklarının bulunduğu, çözünmeyen ve membran proteinleri açısından zenginleştirilmiş fraksiyonlara ayırın.Bir kontrol proteini ve kontamine proteinler immün çöktürülür ve elüye edilir. Ardından, immün çöktürülmüş proteinleri karıştırın, üçlü sindirime tabi tutun ve tandem LCMS ile analiz edin. Sonuçlar, hedef proteinle spesifik olarak etkileşime giren proteinler için farklı azot, 14 azot 15 peptid oranları ve eşit azot değerleri göstererek gerçek ve yanlış etkileşim ortaklarını birbirinden ayırmıştır.Hedef protein, kontrol protein ve kontamine proteinler için 14 azot 15 peptit oranları. Protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için tercih edilen yöntem, seçilen proteinin etkileşim ortaklarıyla birlikte, her ikisinin de doğal konformasyon ve konsantrasyonlarda bulunduğu hücre ekstrelerinden doğrudan immünopresipite edilmesidir.Ancak, bunu yaparken, modern kütle spektrometrelerinin son derece hassas olması nedeniyle, esas olarak kullanılan antikorlarla etkileşime girdikleri için kontamine proteinler de çöktürülür. Bu cihazlar kontamine proteinleri de kesin olarak tanımlayacaktır ve bu nedenle hatalı etkileşimler ile gerçek etkileşim ortaklarını ayırt etmek imkansız hale gelir. Bu sorun, burada gösterilen ve 15 N metabolik etiketleme immünopresipitasyon afinite modülasyonuna (burada ATP durumu tarafından aracılık edilen) ve kantitatif kütle spektrometrisine dayanan teknikle aşılmaktadır.Teknik, laboratuvarımdaki kıdemli doktora öğrencisi Stefan SCH Malinger tarafından gösterilecektir. Hücreleri 10 nesil boyunca etiketledikten sonra, azot 14 ve azot 15 ile etiketlenmiş chlamydomonas hücrelerinden ikişer alikotu 4G SA tüplerine aktarın, santrifüj ile hasat edin, peletleri iki mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden süspande edin ve süspansiyonları 15 mililitrelik Falcon tüplerine aktarın; her alikottan kalan hücreleri ek bir bir mililitre lizis tamponu ile toplayın. Her birine 50 µL 25x proteaz inhibitörü ve 12,5 µL 1 M magnezyum klorür ekleyin; hücrelerin tamamen lizisi için numuneleri buz üzerinde, soğutma amacıyla aralarda 20 saniyelik molalar vererek dört kez 20 saniye boyunca sonike edin.SW 41 TI ince duvarlı tüplerde dört adet altı mililitrelik sakkaroz yastığı hazırlayın. Hücre lizatlarının tüm hacmini dikkatlice sakkaroz yastıklarının üzerine yerleştirin. Çözünür protein komplekslerini membranlardan ayırmak için lizis tamponu ile dengeleyin ve santrifüjleyin.Gradyanın üst kısmındaki çözünür protein komplekslerini, sakroz yastığının parçalarını aktarmamaya dikkat ederek dört adet 15 mililitrelik falcon tüpüne aktarın. Ardından her bir örneğe, son konsantrasyonu 0.5% olacak şekilde %10 Triton X 100 ekleyin. Dikkatlice karıştırın ve toplam hacim yedi mililitre olana kadar lizis tamponu ekleyin.SDS-PAGE ve immün kan analizleri için. Her bir çözünür hücre ekstraktından 70 µL'yi yeni bir 1.5 mL konik tüpe ayırın ve üzerine 70 µL 2X SDS örnek tamponu ekleyin. Ardından, SW 41 TI ince duvarlı tüplerdeki sükroz yastıklarını boşaltın ve her bir pelete üç mL lizis tamponu ekleyin.Son konsantrasyon %2 olacak şekilde bir mililitre %10 tritton X 100 ekleyin. Her bir pelet sonikasyonla çözüldükten sonra, toplam hacim beş mililitre olacak şekilde lizis tamponu ekleyin ve santrifüjleyin. Daha önce yapıldığı gibi, membran protein komplekslerinin üst fraksiyonlarını 15 mililitrelik falcon tüplerine toplayın. Son hacim yedi mililitre olacak şekilde %2 tritton X 100 içeren lizis tamponu ekleyin.SDS-page ve immün kan analizleri için bu örneklerden 70 µL kullanın. Önce, antikorla eşleştirilmiş proteini dengeleyin. Bir sero boncuk setini, 8 mL'ye seyreltilmiş lizis tamponu ile iki kez 4 mL'lik yıkamalar yaparak dengeleyin ve alikotlara ayırın.TP açısından zengin ve TP açısından fakir, azot 14 ve azot 15 etiketli hücrelerden elde edilen çözünür veya membran protein komplekslerini içeren sekiz adet 15 mililitrelik falcon tüpünün her birine bir mililitre süspansiyon ekleyin; protein komplekslerini çöktürmek için tüp yuvarlayıcıda dört santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin. Boncukları santrifüj ile çöktürün ve plastik duvarlara yapışan proteinlerden kaynaklanabilecek kontaminasyonu önlemek için boncukların üzerinde az miktarda sıvı bırakarak süpernatantları atın. Falcon tüplerindeki tüm kalan boncukları toplamak için örnekleri taze 1,5 mililitrelik konik tüplere aktarın. Her birine %0,1 tritton içeren 0,8 mililitre daha lizis tamponu ekleyin, hafifçe vorteksleyin, santrifüjleyin ve kalıntı boncuklarla birlikte tamponu einor tüplerine aktarın. Birkaç yıkama adımından sonra, örnekleri 16.100 ×g'de ve dört santigrat derecede 15 saniye boyunca santrifüjleyin.Örnek süpernatanlarını önce normal bir pipetle uzaklaştırın. Ardından, kalan süpernatanı 50 µL Hamilton şırıngası ile tamamen çekin. Her örneğe, taze hazırlanmış 100 µL elüsyon tamponu ekleyin ve termomikserde 800 RPM'de, 25 °C'de 16.100 ×g'de 15 saniye boyunca santrifüjleyerek inkübe edin.Şimdi, temiz bir 50 µL Hamilton şırıngası kullanarak her bir süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Ayrıca, daha önceki örneklerde olduğu gibi boncuk işlemine 50 µL elüsyon tamponu ekleyin ve ilgili elüatları birleştirin. Tüm örnek EIT'lerinin 30 µL'sini SDS-PAGE ve immünolojik kan analizleri için ayırmayı unutmayın.Şimdi, plus ve minus A TP ile işlem görmüş nitrojen 14 ve nitrojen 15 işaretli çözünür ve membran proteinlerinden elüye edilen çökelekleri birleştirin. Ardından, ekteki makalede açıklandığı şekilde redüksiyon alkilasyonu ve başlangıç yüksek üre sindirimini gerçekleştirin. Bir rotasyon tekerleği üzerinde en az 16 saat sürecek olan triptik sindirim aşamasına geçin.37 °C'de. Tripsin boncuklarını 4 °C'de 16.100 ×g'de beş dakikalık santrifüjle çöktürün. Süpernatantları taze 2 mL eppendorf tüplerine aktarın.Eski tüpleri 50 µL 20 mM amonyum bikarbonat ve %0,5 asetik asit ile yıkayın ve ilk süpernatantlarla birleştirin. Numunelerin tuzsuzlaştırması için ev yapımı C 18 uçlar hazırlamak amacıyla, bir şırınga iğnesiyle emcor C 18 materyalinden iki disk kesin ve bunları 200 µL'lik bir pipet ucuna yerleştirin. Ardından, dört adet 2 mL'lik einor tüpün kapaklarına delikler açın ve uçları yerleştirin; C 18 aşama uçlarını 50 µL çözelti B ile ön işlemden geçirin, 800 G ve 25 °C'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, C 18 aşama uçlarını 100 µL çözelti ile dengeleyin, 25 °C'de 800 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Bu dengeleme adımını bir kez daha tekrarlayın. Triptik sindirimlerden elde edilen örnek süpernatantlarından 100 µL'yi C 18 aşama uçlarına yükleyin ve 25 °C'de 800 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.Örnek süpernatanlarının tamamını uygulamak için kolona yükleme işlemini tekrarlayın. C 18 aşama uçlarını yıkadıktan sonra, 50 µL çözelti B kullanarak tripsitik peptitleri taze bir 1.5 mL eppendorf tüpüne elüye edin; 800 G ve 25 °C'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Elüsyon adımını bir kez daha tekrarlayın ve ardından peptitleri bir SpeedVAC cihazında tamamen kurutun.Kurutulmuş peptitleri 20 µL çözelti A içinde süspanse edin ve buz üzerinde en az bir saat inkübe edin; bu süreci, sonikat banyolu santrifüjde 4 °C'de, 16.100 ×g hızında 20 dakika boyunca yapılan iki adet 15 dakikalık inkübasyonla kesin ve Senna'yı nano C-M-S-M-S HSP 70'e uygulayın. Isı şoku proteinlerinin, sadece ATP yokluğunda spesifik ko-şaperonlar ve substratlarla etkileşime girdiği bilinmektedir; bu nitrojen 14 işaretli hücre ekstraktlarında hsp 70 B ve cge 1, ATP durumundan bağımsız olarak neredeyse tamamen çözünür fraksiyonda lokalize olmuştur. Buna karşılık, CF 1 beta hem çözünür hem de membran zenginleştirilmiş fraksiyonlarda lokalize olmuştur.Sonikasyon, ATP sentazda bulunan membrandan CF₁ beta'nın bir kısmını kopardığı için, her iki fraksiyon için yükleme kontrolü görevi görür. ATP durumundan bağımsız olarak, nitrojen 14 ve nitrojen 15 işaretli çözünür ekstraktlardan anti-HSP70B antikorları ile benzer miktarlarda H HSP 70 B çöktürülmüştür. Buna karşılık, membran fraksiyonlarından düşük düzeylerde HSP 70 B proteini çöktürülmüş olup, CGE E one'ın hs'ye olan beklenen afinitesine paralel olarak, ATP'den yoksun membran fraksiyonlarından köken alan miktarlar, ATP bakımından zengin fraksiyonlara kıyasla biraz daha yüksek bulunmuştur.HSP 70 B bağlama bağımlıdır. TP ile doyurulmuş çözünür veya membran fraksiyonlarında hiçbir CGE 1, HSP 70 B ile birlikte çöktürülmemiştir. TP'den yoksun çözünür fraksiyonlardan ve TP'den yoksun membran fraksiyonlarından HSP 70 B ile birlikte çöktürülen CGE 1 protein miktarları, çöktürülen HSP 70 B miktarı ile kantitatif olarak korelasyon göstermektedir. CGE 1'in HSP 70 B ile yalnızca ADP durumunda etkileşime girdiği kütle spektrometrisi analizi ile de gözlemlenmiştir.Bu deneyde, TP eksik olan azot 14 işaretli ekstratlar ile A TP içeren azot 15 işaretli ekstratların karışımları için çöktürmeler hazırlanmıştır. HS P 70 B peptidinin ağır ve hafif işaretli formları eşit yoğunluklarda tespit edilirken, A TP'den arındırılmış ekstratlardaki CGE one peptidinin sadece hafif işaretli formu tespit edilmiştir. Karşılıklı olarak işaretlenmiş çözünür hücre ekstratlarının karışımlarından elde edilen anti HS P 70 D DB çöktürmesindeki aynı peptidler burada gösterilmiştir. Buna paralel olarak, TP'den arındırılmış ekstratlarda CGE one peptidinin sadece ağır işaretli formu ile HSP 70 B peptidlerinin hem hafif hem de ağır işaretli formları tespit edilmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometrisi analizi için örnek hazırlama aşamasını içeren bir çöktürme deneyinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir izlenim edinmiş olmalısınız. İnsan proteini, özellikle de keratin kontaminasyonlarının kütle spektrometresindeki profil ölçümlerinizi bozacağını unutmayın; bu nedenle, bu prosedürü uygularken eldiven kullanımı, temiz ortam ve LCMS sınıfı reaktifler gibi güvenlik önlemleri kritik öneme sahiptir.

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Böl-BioID, BioID yakınlık etiketleme tekniğine dayalı bir protein parçaları-uluslara tahlil için adım adım bir protokol sağlar. İki verilen protein etkileşimi harekete geçirmek, o kendi yerel hücresel ortamlarında içerik bağımlı protein kompleksleri proteomik analiz sağlar. Yöntemi basit, uygun maliyetli ve yalnızca standart Laboratuar donanımları gerektirir.

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Öğrenin, 15N metabolik etiketleme, immünopresipitasyon ve kantitatif kütle spektrometrisi kullanarak Chlamydomonas hücrelerinde gerçek protein-protein etkileşimlerini sahte olanlardan nasıl ayırt edeceğinizi.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol 15 K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon (Video) | JoVE Journal

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol

Daha fazla video keşfet