Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol ¹⁵ K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çözünür ve zar proteinleri içeren hücre ekstraktlarında belirli bir hedef protein ile spesifik olarak etkileşime giren proteinleri tanımlamaktır. İlk olarak, nitrojen 14 ve nitrojen 15 ile klamidomonas hücrelerinin tam metabolik etiketlemesini sağlayın ve bir TP içeren ve içermeyen hücre lizatları oluşturun. İsteğe bağlı bir çapraz bağlama adımı, geçici protein protein etkileşimlerini stabilize etmeye yardımcı olur. Daha sonra, hücre lizatlarını, hedef proteinin, spesifik etkileşim ortaklarının bulunduğu zenginleştirilmiş çözünmeyen ve zar proteinlerine ayırın.

Bir kontrol proteini ve kontamine edici proteinler immüno-çökeltilir ve ima edilir. Şimdi, immüno-çökeltilmiş proteinleri karıştırın ve bunları tandem LCMS ile üç kez sindirin ve analiz edin. Sonuçlar, spesifik olarak hedef protein ile etkileşime giren proteinler için farklı nitrojen, 14 nitrojen, 15 peptit oranları ve eşit nitrojen göstererek doğru ve yanlış etkileşim ortakları arasında ayrım yaptı.

Hedef protein, kontrol proteini ve kontamine proteinler için 14 nitrojen 15 peptit oranları. Protein protein etkileşimlerini analiz etmek için tercih edilen yöntem, tercih edilen proteini doğrudan etkileşimi ile immüno-çökeltmektir. Her ikisinin de doğal onay ve konsantrasyonlarında meydana geldiği hücre ekstraktlarından ortaklar.

Bununla birlikte, bunu yaparken, kirletici proteinler de çökeltilir, çünkü modern kütle spektrometreleri son derece hassas olduğu için kullanılan antikorlarla etkileşime girerler. Kirletici proteinleri de kesin olarak tanımlayacaklar ve bu nedenle hatayı gerçek etkileşim ortaklarından ayırt etmek imkansız. Bu sorun, burada gösterilen ve burada A TP durumu ve kantitatif kütle spektrometresinin aracılık ettiği 15 N metabolik etiketleme immünopresipitasyon afinite modülasyonuna dayanan teknikle aşılır.

Teknik, laboratuvarımda son sınıf doktora öğrencisi olan Stefan SCH Malinger tarafından gösterilecek. Hücreleri 10 nesil boyunca etiketledikten sonra, nitrojen 14 ve nitrojen 15 etiketli chlamydomonas hücrelerinin her biri 4G SA tüplerine iki alikot aktarın, santrifüjleme ile hasat edin, Resus, peletleri iki mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda askıya alın ve süspansiyonları 15 mililitreye aktarmak için Falcon tüpleri, kalan hücreleri her birine ek bir mililitre lizis tamponu ile toplayın, her Eloqua'ya. 50 mikrolitre 25 x proteaz inhibitörü ve 12.5 mikrolitre bir molar magnezyum klorür sonikat numunesi ekleyin, tam hücre ISIS için buz üzerinde dört kez 20 saniye ve soğutma için 22. molalar.

SW 41 TI ince duvarlı tüplerde dört adet altı mililitrelik sükroz yastığı hazırlayın. Hücre lizatlarının tüm hacmini dikkatlice sükroz yastıklarının üzerine yerleştirin. Çözünür protein komplekslerini zarlardan ayırmak için lizis, tampon ve santrifüj ile dengeleyin.

Çözünür protein komplekslerini gradyanın tepesinden dört adet 15 mililitrelik şahin tüpüne aktarın. Sükroz yastığının parçalarını aktarmaktan kaçındığınızdan emin olun. Daha sonra her numuneye% 0.5'lik bir nihai konsantrasyona% 10 Triton X 100 ekleyin. Dikkatlice karıştırın ve toplam yedi mililitre hacme lizis tamponu ekleyin.

SDS sayfası ve immün kan analizleri için. Her bir çözünür hücre ekstraktından 70 mikrolitreyi yeni bir 1,5 mililitrelik konik tüpe koyun ve 70 mikrolitre iki XSDS numune tamponu ekleyin. Ardından, sükroz yastıklarını SW 41 TI ince duvarlı tüplerden atın ve her pelete üç mililitre lizis tamponu ekleyin.

% 2'lik bir son konsantrasyona bir mililitre% 10 tritton X 100 ekleyin Her peleti sonikasyonla çözdükten sonra, toplam beş mililitre ve santrifüj hacmine lizis tamponu ekleyin. Daha önce olduğu gibi, membran protein komplekslerinin üst fraksiyonlarını 15 mililitrelik şahin tüplerine hasat edin. Yedi mililitrelik bir son hacme% 2 tritton X 100 içeren lizis tamponu ekleyin.

SDS sayfası ve immünokan analizleri için bu örneklerden 70 mikrolitre kullanın. İlk olarak, antikora bağlı proteini dengeleyin. İki adet dört mililitrelik lizis tamponu yıkamalı bir sero boncuk, sekiz mililitreye seyreltilir ve alikot.

Bir TP dolgusu ve bir TP tükenmiş nitrojen 14 ve nitrojen 15 etiketli hücrelerden çözünür veya membran protein kompleksleri içeren sekiz adet 15 mililitrelik şahin tüpünün her birine bir mililitre süspansiyon, protein komplekslerini çökeltmek için bir tüp silindiri üzerinde dört santigrat derecede iki saat inkübe edilir, santrifüjleme yoluyla boncukları peletler, Plastik duvarlara yapışan proteinlerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için boncukların üzerinde küçük bir hacimde sıvı bırakarak süpernatantları atın. Şahin tüplerinde kalan tüm boncukları toplamak için numuneleri taze 1,5 mililitrelik konik tüplere aktarın. Her girdaba %0.1 tritton içeren 0.8 mililitre başka bir lizis tamponu ekleyin, nazikçe santrifüjleyin ve artık boncuklu tamponu einor tüplerine aktarın Birkaç yıkama adımından sonra, numuneleri 16, 100 kez G ve dört santigrat derecede 15 saniye santrifüjleyin.

Numune süpernatantlarını önce normal bir pipetle çıkarın. Ardından kalan süpernatanı 50 mikrolitrelik Hamilton şırınga ile tamamen çıkarın. Her numuneye 100 mikrolitre taze hazırlanmış elüsyon tamponu ekleyin ve numuneleri 800 RPM'de bir termo karıştırıcıda inkübe edin, numuneleri 16, 100 kez G ve 25 santigrat derecede 15 saniye santrifüjleyin.

Şimdi her süpernatanı temiz bir 50 mikrolitrelik Hamilton şırıngası kullanarak yeni bir tüpe aktarın. Ayrıca, daha önceki numunelerde olduğu gibi boncuk işlemine 50 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve ilgili elastları bir havuzda toplayın. SDS sayfası ve immün kan analizleri için tüm örnek EIT'lerden 30 mikrolitre ayırmayı unutmayın.

Şimdi, artı ve eksi A TP ile muamele edilmiş nitrojen 14 ve nitrojen 15 etiketli çözünür ve membran proteinlerinden kaçan çökeltileri birleştirin. Ardından, ekteki el yazmasında açıklandığı gibi indirgeme alkilasyonu ve ilk yüksek üre sindirimi gerçekleştirin. En az 16 saat boyunca bir dönme tekerleği üzerinde triptik sindirime devam edin.

37 santigrat derecede. Tripsin boncuklarını 16, 100 kez G ve dört santigrat derecede beş dakikalık bir santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanları taze iki mililitrelik einor tüplerine aktarın.

Eski tüpleri 50 mikrolitre 20 milimolar amonyum bikarbonat,% 0.5 asetik asit ile yıkayın ve ilk süpernatantlarla doldurun. Numuneleri tuzdan arındırmak için ev yapımı C 18 uçları hazırlamak için, bir şırınga iğnesi ile emcor C 18 malzemesinden iki disk kesin ve bunları 200 mikrolitrelik bir pipet ucuna yerleştirin. Daha sonra dört adet iki mililitrelik einor tüpünün kapaklarına delikler açın ve uçları yerleştirin: C 18 aşamalı uçları 50 mikrolitre çözelti B santrifüjü ile 800 G ve 25 santigrat derecede üç dakika boyunca ön koşullandırın.

Daha sonra, C 18 aşamalı uçları 100 mikrolitre çözelti, 800 G ve 25 santigrat derecede üç dakika boyunca bir santrifüj ile dengeleyin. Bu dengeleme adımını bir kez daha tekrarlayın. 800 G ve 25 santigrat derecede üç dakika boyunca C 18 aşamalı uç santrifüjüne triptik çürütmelerden 100 mikrolitre numune süpernatantı yüklemeye devam edin.

Numune süpernatantlarının tam uygulaması için sütunu yüklemeyi tekrarlayın. C 18 aşamalı uçları yıkadıktan sonra, triptik peptitleri, 800 G ve 25 santigrat derecede üç dakika boyunca 50 mikrolitre çözelti B santrifüjü ile 1.5 mililitrelik taze bir einor tüpe boşaltın. Elucian adımını bir kez tekrarlayın ve ardından peptitleri bir hızlı VAC reus'ta tamamlanana kadar kurutun.

Kurutulmuş peptitleri 20 mikrolitre çözelti A'da süspanse edin ve buz üzerinde en az bir saat inkübe edin, 16, 100 kez G ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca bir sonikat banyosu santrifüjünde iki adet 15 dakikalık inkübasyon ile kesintiye uğratın ve Sinameki'yi nano CMSMS HSP 70'e uygulayın. Isı şoku proteinlerinin, yalnızca bu nitrojen 14 etiketli hücre ekstraktlarında bir TP yokluğunda spesifik cos şaperonları ve substratları ile etkileşime girdiği bilinmektedir: hs P 70, B ve CGE bir, neredeyse yalnızca A TP durumundan bağımsız olarak çözünür fraksiyona lokalizedir. Buna karşılık, CF bir beta hem çözünür hem de zarla zenginleştirilmiş fraksiyonlara lokalizedir.

Sonikasyon, CF bir beta'nın bir kısmını A TP Synthes'te bulunan membrandan kestiğinden, her iki fraksiyon için de yükleme kontrolü görevi görür. Benzer miktarlarda H HSP 70 B, A TP durumundan bağımsız olarak nitrojen 14 ve nitrojen 15 etiketli çözünür ekstraktlardan anti HSP 70 B antikorları ile çökeltildi. Buna karşılık, düşük HS P 70 B proteini seviyeleri, hs için CGE E'nin beklenen afinitesi olarak bir TP dolu fraksiyonlarına kıyasla, bir TP tükenmiş membran fraksiyonlarından kaynaklanan biraz daha büyük miktarlara sahip membran fraksiyonlarından çökelti

P 70 B bağlama bağlıdır. Hiçbir CGE, HS P 70 B.In bir TP tam çözünür veya membran fraksiyonları ile birlikte çökeltilmedi. Bir TP tükenmiş, çözünür fraksiyonlardan ve bir TP tükenmiş membran fraksiyonlarından HS P 70 B ile çökeltilen CGE bir protein ko'sunun miktarları, çökelmiş HSP 70 B miktarı ile kantitatif olarak ilişkilidir.

Bu deneyde, TP içermeyen nitrojen 14 işaretli ekstraktlar ve nitrojen, A TP içeren 15 etiketli ekstrakt karışımları için çökeltiler hazırlandı. HS P 70 B peptidinin ağır ve hafif işaretli formları eşit yoğunluklarda tespit edilirken, sadece A, TP tükenmiş ekstraktlardan bir peptit olan CGE'nin hafif etiketli formu tespit edildi. Karşılıklı olarak etiketlenmiş çözünür hücre ekstraktlarının karışımlarından türetilen anti HS P 70 D DB çökeltisinden elde edilen aynı peptitler burada gösterilmektedir. Buna göre, TP tükenmiş ekstraktlarda CGE bir peptitin sadece ağır etiketli formu ve ayrıca hem hafif hem de ağır etiketli HSP 70 B peptitleri tespit edildi.

Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometresi analizi için numune hazırlama ile bir ülke yağış deneyinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir izlenime sahip olmalısınız. Unutmayınız ki insan proteini, özellikle keratin ile yapılan kontaminasyonlar kütle spektrometresindeki profilasyon ölçümlerinizi bozacaktır ve bu nedenle bu işlem yapılırken eldiven, temiz ortam ve LCMS dereceli bölgeler gibi güvenlik önlemleri çok önemlidir.