Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol ¹⁵ K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çözünür ve membran proteinleri içeren hücre ekstraktlarında, belirli bir hedef proteinle özel olarak etkileşime giren proteinleri tanımlamaktır. İlk olarak, chlamydomonas hücrelerinin nitrojen 14 ve nitrojen 15 ile tam metabolik etiketlemesini gerçekleştirin ve TP içeren ve içermeyen hücre lizatları oluşturun. İsteğe bağlı bir çapraz bağlama adımı, geçici protein-protein etkileşimlerini stabilize etmeye yardımcı olur. Ardından, hücre lizatlarını, hedef proteinin ve onun spesifik etkileşim ortaklarının bulunduğu, çözünmeyen ve membran proteinleri açısından zenginleştirilmiş fraksiyonlara ayırın.

Bir kontrol proteini ve kontamine proteinler immün çöktürülür ve elüye edilir. Ardından, immün çöktürülmüş proteinleri karıştırın, üçlü sindirime tabi tutun ve tandem LCMS ile analiz edin. Sonuçlar, hedef proteinle spesifik olarak etkileşime giren proteinler için farklı azot, 14 azot 15 peptid oranları ve eşit azot değerleri göstererek gerçek ve yanlış etkileşim ortaklarını birbirinden ayırmıştır.

Hedef protein, kontrol protein ve kontamine proteinler için 14 azot 15 peptit oranları. Protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için tercih edilen yöntem, seçilen proteinin etkileşim ortaklarıyla birlikte, her ikisinin de doğal konformasyon ve konsantrasyonlarda bulunduğu hücre ekstrelerinden doğrudan immünopresipite edilmesidir.

Ancak, bunu yaparken, modern kütle spektrometrelerinin son derece hassas olması nedeniyle, esas olarak kullanılan antikorlarla etkileşime girdikleri için kontamine proteinler de çöktürülür. Bu cihazlar kontamine proteinleri de kesin olarak tanımlayacaktır ve bu nedenle hatalı etkileşimler ile gerçek etkileşim ortaklarını ayırt etmek imkansız hale gelir. Bu sorun, burada gösterilen ve 15 N metabolik etiketleme immünopresipitasyon afinite modülasyonuna (burada ATP durumu tarafından aracılık edilen) ve kantitatif kütle spektrometrisine dayanan teknikle aşılmaktadır.

Teknik, laboratuvarımdaki kıdemli doktora öğrencisi Stefan SCH Malinger tarafından gösterilecektir. Hücreleri 10 nesil boyunca etiketledikten sonra, azot 14 ve azot 15 ile etiketlenmiş chlamydomonas hücrelerinden ikişer alikotu 4G SA tüplerine aktarın, santrifüj ile hasat edin, peletleri iki mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden süspande edin ve süspansiyonları 15 mililitrelik Falcon tüplerine aktarın; her alikottan kalan hücreleri ek bir bir mililitre lizis tamponu ile toplayın. Her birine 50 µL 25x proteaz inhibitörü ve 12,5 µL 1 M magnezyum klorür ekleyin; hücrelerin tamamen lizisi için numuneleri buz üzerinde, soğutma amacıyla aralarda 20 saniyelik molalar vererek dört kez 20 saniye boyunca sonike edin.

SW 41 TI ince duvarlı tüplerde dört adet altı mililitrelik sakkaroz yastığı hazırlayın. Hücre lizatlarının tüm hacmini dikkatlice sakkaroz yastıklarının üzerine yerleştirin. Çözünür protein komplekslerini membranlardan ayırmak için lizis tamponu ile dengeleyin ve santrifüjleyin.

Gradyanın üst kısmındaki çözünür protein komplekslerini, sakroz yastığının parçalarını aktarmamaya dikkat ederek dört adet 15 mililitrelik falcon tüpüne aktarın. Ardından her bir örneğe, son konsantrasyonu 0.5% olacak şekilde %10 Triton X 100 ekleyin. Dikkatlice karıştırın ve toplam hacim yedi mililitre olana kadar lizis tamponu ekleyin.

SDS-PAGE ve immün kan analizleri için. Her bir çözünür hücre ekstraktından 70 µL'yi yeni bir 1.5 mL konik tüpe ayırın ve üzerine 70 µL 2X SDS örnek tamponu ekleyin. Ardından, SW 41 TI ince duvarlı tüplerdeki sükroz yastıklarını boşaltın ve her bir pelete üç mL lizis tamponu ekleyin.

Son konsantrasyon %2 olacak şekilde bir mililitre %10 tritton X 100 ekleyin. Her bir pelet sonikasyonla çözüldükten sonra, toplam hacim beş mililitre olacak şekilde lizis tamponu ekleyin ve santrifüjleyin. Daha önce yapıldığı gibi, membran protein komplekslerinin üst fraksiyonlarını 15 mililitrelik falcon tüplerine toplayın. Son hacim yedi mililitre olacak şekilde %2 tritton X 100 içeren lizis tamponu ekleyin.

SDS-page ve immün kan analizleri için bu örneklerden 70 µL kullanın. Önce, antikorla eşleştirilmiş proteini dengeleyin. Bir sero boncuk setini, 8 mL'ye seyreltilmiş lizis tamponu ile iki kez 4 mL'lik yıkamalar yaparak dengeleyin ve alikotlara ayırın.

TP açısından zengin ve TP açısından fakir, azot 14 ve azot 15 etiketli hücrelerden elde edilen çözünür veya membran protein komplekslerini içeren sekiz adet 15 mililitrelik falcon tüpünün her birine bir mililitre süspansiyon ekleyin; protein komplekslerini çöktürmek için tüp yuvarlayıcıda dört santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin. Boncukları santrifüj ile çöktürün ve plastik duvarlara yapışan proteinlerden kaynaklanabilecek kontaminasyonu önlemek için boncukların üzerinde az miktarda sıvı bırakarak süpernatantları atın. Falcon tüplerindeki tüm kalan boncukları toplamak için örnekleri taze 1,5 mililitrelik konik tüplere aktarın. Her birine %0,1 tritton içeren 0,8 mililitre daha lizis tamponu ekleyin, hafifçe vorteksleyin, santrifüjleyin ve kalıntı boncuklarla birlikte tamponu einor tüplerine aktarın. Birkaç yıkama adımından sonra, örnekleri 16.100 ×g'de ve dört santigrat derecede 15 saniye boyunca santrifüjleyin.

Örnek süpernatanlarını önce normal bir pipetle uzaklaştırın. Ardından, kalan süpernatanı 50 µL Hamilton şırıngası ile tamamen çekin. Her örneğe, taze hazırlanmış 100 µL elüsyon tamponu ekleyin ve termomikserde 800 RPM'de, 25 °C'de 16.100 ×g'de 15 saniye boyunca santrifüjleyerek inkübe edin.

Şimdi, temiz bir 50 µL Hamilton şırıngası kullanarak her bir süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Ayrıca, daha önceki örneklerde olduğu gibi boncuk işlemine 50 µL elüsyon tamponu ekleyin ve ilgili elüatları birleştirin. Tüm örnek EIT'lerinin 30 µL'sini SDS-PAGE ve immünolojik kan analizleri için ayırmayı unutmayın.

Şimdi, plus ve minus A TP ile işlem görmüş nitrojen 14 ve nitrojen 15 işaretli çözünür ve membran proteinlerinden elüye edilen çökelekleri birleştirin. Ardından, ekteki makalede açıklandığı şekilde redüksiyon alkilasyonu ve başlangıç yüksek üre sindirimini gerçekleştirin. Bir rotasyon tekerleği üzerinde en az 16 saat sürecek olan triptik sindirim aşamasına geçin.

37 °C'de. Tripsin boncuklarını 4 °C'de 16.100 ×g'de beş dakikalık santrifüjle çöktürün. Süpernatantları taze 2 mL eppendorf tüplerine aktarın.

Eski tüpleri 50 µL 20 mM amonyum bikarbonat ve %0,5 asetik asit ile yıkayın ve ilk süpernatantlarla birleştirin. Numunelerin tuzsuzlaştırması için ev yapımı C 18 uçlar hazırlamak amacıyla, bir şırınga iğnesiyle emcor C 18 materyalinden iki disk kesin ve bunları 200 µL'lik bir pipet ucuna yerleştirin. Ardından, dört adet 2 mL'lik einor tüpün kapaklarına delikler açın ve uçları yerleştirin; C 18 aşama uçlarını 50 µL çözelti B ile ön işlemden geçirin, 800 G ve 25 °C'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, C 18 aşama uçlarını 100 µL çözelti ile dengeleyin, 25 °C'de 800 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Bu dengeleme adımını bir kez daha tekrarlayın. Triptik sindirimlerden elde edilen örnek süpernatantlarından 100 µL'yi C 18 aşama uçlarına yükleyin ve 25 °C'de 800 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Örnek süpernatanlarının tamamını uygulamak için kolona yükleme işlemini tekrarlayın. C 18 aşama uçlarını yıkadıktan sonra, 50 µL çözelti B kullanarak tripsitik peptitleri taze bir 1.5 mL eppendorf tüpüne elüye edin; 800 G ve 25 °C'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Elüsyon adımını bir kez daha tekrarlayın ve ardından peptitleri bir SpeedVAC cihazında tamamen kurutun.

Kurutulmuş peptitleri 20 µL çözelti A içinde süspanse edin ve buz üzerinde en az bir saat inkübe edin; bu süreci, sonikat banyolu santrifüjde 4 °C'de, 16.100 ×g hızında 20 dakika boyunca yapılan iki adet 15 dakikalık inkübasyonla kesin ve Senna'yı nano C-M-S-M-S HSP 70'e uygulayın. Isı şoku proteinlerinin, sadece ATP yokluğunda spesifik ko-şaperonlar ve substratlarla etkileşime girdiği bilinmektedir; bu nitrojen 14 işaretli hücre ekstraktlarında hsp 70 B ve cge 1, ATP durumundan bağımsız olarak neredeyse tamamen çözünür fraksiyonda lokalize olmuştur. Buna karşılık, CF 1 beta hem çözünür hem de membran zenginleştirilmiş fraksiyonlarda lokalize olmuştur.

Sonikasyon, ATP sentazda bulunan membrandan CF₁ beta'nın bir kısmını kopardığı için, her iki fraksiyon için yükleme kontrolü görevi görür. ATP durumundan bağımsız olarak, nitrojen 14 ve nitrojen 15 işaretli çözünür ekstraktlardan anti-HSP70B antikorları ile benzer miktarlarda H HSP 70 B çöktürülmüştür. Buna karşılık, membran fraksiyonlarından düşük düzeylerde HSP 70 B proteini çöktürülmüş olup, CGE E one'ın hs'ye olan beklenen afinitesine paralel olarak, ATP'den yoksun membran fraksiyonlarından köken alan miktarlar, ATP bakımından zengin fraksiyonlara kıyasla biraz daha yüksek bulunmuştur.

HSP 70 B bağlama bağımlıdır. TP ile doyurulmuş çözünür veya membran fraksiyonlarında hiçbir CGE 1, HSP 70 B ile birlikte çöktürülmemiştir. TP'den yoksun çözünür fraksiyonlardan ve TP'den yoksun membran fraksiyonlarından HSP 70 B ile birlikte çöktürülen CGE 1 protein miktarları, çöktürülen HSP 70 B miktarı ile kantitatif olarak korelasyon göstermektedir. CGE 1'in HSP 70 B ile yalnızca ADP durumunda etkileşime girdiği kütle spektrometrisi analizi ile de gözlemlenmiştir.

Bu deneyde, TP eksik olan azot 14 işaretli ekstratlar ile A TP içeren azot 15 işaretli ekstratların karışımları için çöktürmeler hazırlanmıştır. HS P 70 B peptidinin ağır ve hafif işaretli formları eşit yoğunluklarda tespit edilirken, A TP'den arındırılmış ekstratlardaki CGE one peptidinin sadece hafif işaretli formu tespit edilmiştir. Karşılıklı olarak işaretlenmiş çözünür hücre ekstratlarının karışımlarından elde edilen anti HS P 70 D DB çöktürmesindeki aynı peptidler burada gösterilmiştir. Buna paralel olarak, TP'den arındırılmış ekstratlarda CGE one peptidinin sadece ağır işaretli formu ile HSP 70 B peptidlerinin hem hafif hem de ağır işaretli formları tespit edilmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometrisi analizi için örnek hazırlama aşamasını içeren bir çöktürme deneyinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir izlenim edinmiş olmalısınız. İnsan proteini, özellikle de keratin kontaminasyonlarının kütle spektrometresindeki profil ölçümlerinizi bozacağını unutmayın; bu nedenle, bu prosedürü uygularken eldiven kullanımı, temiz ortam ve LCMS sınıfı reaktifler gibi güvenlik önlemleri kritik öneme sahiptir.