Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma C. elegans

Aşağıdaki deneyin amacı, sürekli bir akış yöntemi kullanarak bir hipoksi odası kurmak ve sürdürmektir. Bu, prosedür için gerekli tüplerin, şişelerin ve odaların elde edilmesi ve üretilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, oksijen tankını bağlayın ve istenen hipoksi seviyesini oluşturmak için akış hızını seçin.

Gazı, deiyonize su ile doldurulmuş bir baloncuk şişesinden geçirerek nemlendirin. Hidratlı gazı hipoksi odasına bağlayın ve test numunelerini hipoksik koşullara maruz bırakmak için odaya yerleştirin. Yetişkinliğe kadar yaşayabilirliğin gözlemlenmesine dayalı olarak hipokside Hi F1'e bağlı embriyonik ölümcüllüğü gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin eldiven kutuları gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, laboratuvarda üretilmesinin kolay ve ucuz olması ve çevre odasında doğru ve tekrarlanabilir bir gaz konsantrasyonu sağlamasıdır. Bu yöntem, nematod C zarafetindeki hipoksik yanıt hakkında bilgi sağlarken, daha büyük model organizmalar ve hücre kültürü dahil olmak üzere diğer sistemlere de uyarlanabilir. Ek olarak, karbondioksit ve hidrojen sülfür dahil olmak üzere diğer gazları incelemek için kullanılabilir.

Bu protokol, bir hipoksi odasının nasıl inşa edileceğini gösterir. Gaz, tanımlanmış oksijen konsantrasyonlarına sahip sıkıştırılmış gaz tanklarında depolanır ve iki aşamalı bir regülatör bağlanır. Gaz, akış borusunun altına girer ve doğru akış hızında üstten çıkar.

Gaz daha sonra gazı nemlendiren kabarcık şişesine akar. Hidro gaz daha sonra giriş valfindeki hipoksi odasına geçer ve numuneleri hipoksiye maruz bırakır. Gaz nihayet haznede açılan bir egzoz deliğinden odaya girer.

Bir Pyrex kristalizasyon kabı veya bir ok paketi kutusu, çevre odasının gövdesi olarak kullanılabilir. Kabın hacmi minimumda tutulmalı ve malzeme gaz geçirimsiz olmalıdır. Kabın bir tarafına karbon veya elmas uçla bir delik açın, delin ve plastik bir hortum ucu bağlantısı ile takın.

Epoksiyi kutuya ve bağlantı parçasına uygulamadan önce karıştırın. Ardından, ikinci delik birinciden kaydırılmış olarak kabın karşı tarafında aynı işlemi tekrarlayın. Türbülanslı karıştırmayı artırmak için, sıkıştırılmış gaz tanklarını kütle akış kontrolörü veya rotor ölçer gibi bir akış kontrol cihazına bağlamak için sekizde bir inç dış çap, FEP veya naylon boru kullanın.

Gaz tankları, oksijen içeriği veya anoksik koşullar için sertifikalı bir standart olan nitrojen ile dengelenmiş tanımlanmış oksijen konsantrasyonlarına sahip olmalıdır. Saf nitrojen, ikinci aşama istenen basınca ayarlanmış iki aşamalı bir regülatör kullanır. Uygun bir akış hızı seçmek için yazılı protokoldeki talimatlara bakın.

Ardından, iki kademeli regülatörden gelen boruyu, odaya giren gazın akış hızını kontrol eden akış borusuna bağlayın. Akış borusunun çıkışları, damıtılmış su içeren fritlenmiş silindirli bir gaz yıkama şişesine bağlanır. Ardından, yıkama şişesinin diğer tarafındaki boruyu çevre haznesindeki bağlantı parçalarından birine bağlayın.

Bu, çevre odasına giren gazı hidratacaktır. Hazneyi kapatmak için vakumlu gres kullanın. Ardından, hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için haznenin kapağına ağırlıklar yerleştirin.

Eldivenli bir elin avucunda az miktarda suyu haznedeki gaz egzoz bağlantısına tutarak ve kabarcık olup olmadığını kontrol ederek contayı test edin. İlk olarak, senkronize deniz Elgan popülasyonları oluşturun. Bir ila 100 GR yetişkini, tohumlanmamış bir nematod büyüme ortamı plakasının yüzeyine bir damla alkali ağartıcı solüsyona yerleştirin.

En az sekiz saatlik bir inkübasyon süresinden sonra ağartıcı çözeltisinin plakaya emilmesine izin verin. Senkronize L one larvalarını canlı OP 50 bakteri ile tohumlanmış plakaya aktarın. Alternatif olarak, GRA yetişkinlerinin eşzamanlı olarak gelişecek bir solucan grubu oluşturmak için iki ila üç saat boyunca tabağa yumurta bırakmasına izin verin veya genç embriyoları toplamak için karışık bir popülasyondan L dört larva toplayın.

İki ila dört hücre aşamasında, GR yetişkinlerini küçük bir hacimde suda doğramak için bir tıraş bıçağı kullanın ve daha sonra solucanları hipoksik koşullara maruz kalmak için plakaya aktarmadan önce embriyoları ağız pipeti ile aktarın. Plakaların kenarına etanol içinde mililitre palmitik asit başına 10 miligramlık bir halka yerleştirin. Solucanların agar plakasının yüzeyinden kaçmasını önlemek için.

Palmitik asit çözelti çıkacaktır. Etanol buharlaşarak homojenliği sağlamak için fiziksel bir bariyer oluştururken, çevre odasına maruz kalmadan önce gaz yıkama şişesindeki suyu değiştirdiğinizden emin olun. Solucanları plakalara aktardıktan sonra, plakaları çevre haznesine kapatın, gaz akışını başlatın ve tahlil için istenen süre boyunca maruz kalmayı sürdürün.

Embriyoların yetişkinliğe kadar yaşayabilirliği için, solucanların oda havasına döndükten 48 saat sonra gelişmesine izin verin, bu noktada olmaları gerekir. Dördüncü aşama larvaları veya bir günlük yetişkinler yetişkinliğe yaşayabilirlik için puan alır. Solucanların hipoksik maruziyet oluşturduğunu görselleştirmek için, solucanları 22 milimetre karelik bir örtü kaymasında M dokuzluk bir damlaya aktarın ve gerekirse M dokuzda %2'lik bir aros pedine ters çevirin.

Anestezik olarak 25 milimolar amol veya 10 milimolar sodyum azid kullanılabilir. Alternatif olarak, hipoksiye maruz kaldıktan sonra, şeffaf çevre odası doğrudan bir diseksiyon dürbünü aşamasına yerleştirilebilir. Biri tüm gaz akışı kurulumu dahil olmak üzere iki görünüm gösterilir.

Diğeri ise sadece mikroskop sahnesinde bulunan hazne ile. Bristol N iki solucanı, solucanların çoğunluğu GR yetişkinleri olana kadar 10 santimetre yüksekliğindeki dört büyüme plakasında büyütün. Solucanları bir ila beş alkali ağartıcı solüsyonu ile 15 mililitrelik konik bir tüpe yıkayın ve solucanlar çözülmeye başlayana kadar rotasyonla inkübe edin.

Beş dakikadan fazla değil. Solucanları üç kez yıkayın, M dokuz her yıkama arasında 1.500 kez G'de dönerek kırılma plakası olmadan. Ağartılmış embriyolar 8 adet 150 milimetrelik NGM plakasına yerleştirilir ve embriyoların yaklaşık 48 saat boyunca L dört larvaya dönüşmesine izin verilir.

22 santigrat derecede, plakaları çevre odasına taşıyın ve dört saat veya deneysel tasarım tarafından belirtilen süre boyunca hipoksik ve anoksik koşullara maruz bırakın. Numuneleri hızlı bir şekilde toplamak için, kapağı hipoksik odaya çıkarın. Bir numune plakası alın ve hazne süresini yeniden kapatın ve adımları kaydedin.

Solucanları hipoksiden çıkardıktan sonra, tüm bu işlem iki dakikadan az sürmelidir. Solucanları naylon bir filtreye yıkamak için damıtılmış su kullanın ve ardından 100 mikrolitre% 1 SDS santrifüjü içeren etiketli 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Bir masaüstü santrifüjündeki SDS'deki solucanlar, 15 ila 20 saniye boyunca 1.500 kez G'dir.

Kırılma ile, supinatın çoğunu tüpten çıkarmak için bir vakum kullanın ve solucan peletine dokunulmadan bırakın. Bir pipet kullanarak, solucan peletini önceden belirlenmiş bir hacimde sıvı ile etiketli 1,5 mikro çöp tüpüne aktarın. Numune SDS sayfası için kullanılacaksa, bu tüp eşit hacimde iki kez protein yükleme boyası içerebilir, tüpü kapatın ve sıvı nitrojene daldırın.

Tüm numuneler izole edilene kadar tekrarlayın. Tutarlılık numuneleri için ev hava kontrol numuneleri için bu prosedürleri izleyin, numuneler eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. Bu rakam, milyonda 1000 parça, milyonda 5.000 parça oksijen ve milyonda 210.000 parça oksijen civarında normoksiye maruz kalan embriyoların canlılığını göstermektedir.

Embriyolar sürekli akışlı oksijen odalarında 24 saat boyunca her koşula maruz bırakılır. Solucanlar, 48 saat boyunca yetişkinliğe kadar gelişmesine izin verilen normoksik koşullara taşındı ve daha sonra yetişkinliğe yaşayabilirlik için puanlandı. Bu prosedürü takiben, Western blot QPCR veya yaşam süresi veya döl üretimi gibi fizyolojik tahliller ile daha sonraki analizler için numuneler toplanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi laboratuvarınızda sürekli akışlı bir hipoksi odasının nasıl kurulacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.