Name: PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Keşfedin PDZ bağımlı CFTR makromoleküler sinyal komplekslerinin in vitro analizini. Rekombinant protein ekspresyonu ve western blot ile CFTR etkileşimlerini doğrudan görselleştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışmalarımız Amerikan Kalp Derneği (Büyük Güneydoğu Ortaklık) Başlangıç-devlet yardımı 0765185B, Elsa U. Pardee Vakfı&#39;nın araştırma bursu ve Wayne State Üniversitesi intramural başlangıç ​​fonu ve Damar Araştırma Enstitüsü İsis Girişimi ödülü gelen hibelerle desteklenmektedir. In vitro CFTR makromoleküler karmaşık montaj Bu yöntem başlangıçta Dr AP Naren (Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi) tarafından öncülük edilmiştir.

1. Bakterilerde Rekombinant Takip edilen Fusion Proteinlerin İfade ve Arıtma <ol><li> CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR ve NHERFs (tam boy veya PDZ1 ya PDZ2 etki için C-kuyrukları (C-terminusta PDZ motifleri ihtiva eden son 50-100 amino asitleri) ile tanımlanan bölgeler amplifiye ) PCR yaklaşım. </li><li> GST-füzyon proteinleri için pGEX4T-1 vektör (örneğin GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), MBP-füzyon proteinleri için pMAL-C2 vektör (örneğin MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT içine PCR ürünleri Clone ), ve His-S-füzyon proteinleri (örneğin, His-S-CFTR CT olarak, His-S-PDZK1) için pET30. </li><li> Bir proteaz eksikliği E. Transform coli suşu (BL21-de3) olası rekombinant protein yıkımı en aza indirmek için. </li><li> Uygun antibiyotikler (örneğin, ampisilin, kanamisin veya gibi) içeren Luria-Bertani ortamı (pH 7.0) içinde 37 ° C de bir gece kültüre büyür. 1:10 gece kültürü seyreltilir ve 37 başka bir 2 saat için büyümek ° C Içinde0,5-1 m M 30 ° C&#39;de 4 saat süreyle sonraki IPTG ile Duce 8000 santrifüj ile pelet hücreleri x g 10 dakika süre ile 4 ° C. </li><li> (50 m M Tris-HCl, pH 8.0, 1 m M EDTA, 1 M m PMSF, ve% 10 sukroz) lizozim (1 mg / mL),% 0.2 Triton X-100 ve proteaz ihtiva eden tampon çözeltisi içinde, sakaroz hücrelerini Lyse inhibitörleri. Hücre topağı kültür 1 L kaynaklanan için 20 mL kullanabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika süre ile, bir döner çalkalayıcıda, karıştırın </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle 20,000 x g&#39;de Spin Supernatan toplayın. </li><li> Üstte yüzen berrak madde içinde, aşağıdaki reçine / agaroz boncukları (sükroz tampon çözeltisi içinde% 50 bulamaç) 1 ml: <ul><li> GST füzyon proteinleri Glutatyon agaroz boncuk. </li><li> Onun-S füzyon proteinleri için Talon boncuk. </li><li> MBP füzyon proteinleri için Amiloz reçine. </li></ul></li><li> 4 de 4 saat süreyle karışımı ° döner çalkalayıcıda, C. </li><li> 2 mi için karıştırılması, 1x PBS (15 mL) içinde resuspending ile yıkanır boncuklarn, 800 eğirme × g 2 dk ve atarak supernatant için. Altı kere için bu adımı yineleyin. </li><li> İlgili elüsyon tamponuyla (boncuklar 1 mL başına 2 mL elüsyon tamponuyla) kullanılarak boncuklar proteini elüt edilmesi. <ul><li> GST füzyon proteinleri için işlem tampon maddesi: 25 m M Tris-HCl (pH 8.0), 140 m M NaCl, 20 ve m M glutation azaltılabilir. </li><li> His füzyon proteinleri için işlem tampon maddesi: 20 m M Tris-HCl (pH 8.0), 500 m M NaCl ve 200 m M imidazol. </li><li> MBP füzyon proteinleri için işlem tampon maddesi: 20 m M Tris-HCl (pH 8.0), 200 m M NaCl, 1 m M EDTA, 1 m M DTT ve 10 m M maltoz. </li></ul></li><li> 4 azından 1x PBS 2 L karşı Elüsyonlanan protein Dialyze ° C (mümkün proteini düşüşü önlemek üzere). PBS dört kez 4 saatte değiştirin. -80 Düzeyinde küçük hacimde bir Centricon filtresi (10,000 MW kesim, Millipore) ve mağaza kullanarak proteini konsantresi ° C </li><li> DetBradford yöntemiyle protein konsantrasyonu ermin. SDS-PAGE standartlar olarak BSA kullanarak protein kalitesini değerlendirin. Proteinin bütünlüğü tatminkar değil ise, bu tür jel filtrasyonu ya da iyon değişimi gibi ikincil saflaştırma işlemleri de kullanılabilir. (Örneğin, biz daha GST-füzyon proteini arındırmak için bir G-75 sepharose kolon kullanılmıştır). </li></ol> 2. Hücre Kültürü ve Hücre Lysate Hazırlık <ol><li> Kültür bebek Hamster böbrek (BHK) hücreleri stabil aşırı ekspres CFTR-wt ve CFTR-his10 veya BHK hücrelerinde geçici aşırı ekspres Bayrak-LPA 2-wt veya Bayrak-LPA 2-ΔSTL ve Madin-Darby canine böbrek (MDCK Eagle minimum gerekli ortamda stabil bir şekilde aşırı ifade MRP2 (MEM)% 5 CO2 ile 37 az% 10 fetal dana serumu ve penisilin / streptomisin polistiren şişeler içerisinde ° C ihtiva eden) hücre. </li><li> Kültür insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri stabil aşırı ekspres CFTR-wt ve Dulbecco CFTR-his10&#39;% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de% 10 fetal bovin serumu ve penisilin / streptomisin polistiren şişeler içinde ilave s değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM). </li><li> Kullanımı; - (% 0.2 Triton X-100-1 m M phenylmethylsulphonyl flor, 1 ug / mL aprotinin, 1 ug / ml löpeptin, 1 ug / ml pepstatin içeren proteaz inhibitörleri oluşan bir karışım ile desteklenmiş PBS) Lysis Buffer hücrelerin Lyse Her 60 mm petri ve her 100 mm petri için 1000 uL lizis tamponu için 500 uL lizis tamponu. </li><li> Hücre ° C, ve 4 de 15 dakika boyunca 16.000 santrifüj ile erimeyen madde x g kaldırmak ° C&#39;de 4 azından 20 dakika boyunca sallayın lizatları Bradford testi ile protein konsantrasyonu belirler. </li></ol> 3. Bir CFTR içeren makromoleküler Kompleksi İn Vitro Kurulu&#39;nda (CFTR-PDZK1-MRP4) <ol><li> Lizis tampon 200 ul (PBS -% 0.2 Triton X-100 + proteaz inhibitörleri) içine, 20 mikrogram arıtılmış GST-MRP4-C terminali ekleyin50 aa (CT50) füzyon proteini. </li><li> Onun-S-PDZK1 füzyon proteini arıtılmış çeşitli miktarlarda (0-40 mg) ekleyin. </li><li> 22 ° C&#39;de 1-2 saat için bir döner mikser üzerinde iki protein karıştırılır. </li><li> Protein karışımı içine 20 uL glutation boncuklar (50% bulamaç) eklenir, ve başka bir 1 saat boyunca karıştırmaya devam edin. Bu aşama, aynı zamanda çift-akıllı bağlanma olarak ifade edilir. </li><li> Bu süre esnasında, HEK293 hücre lizatları hazırlanması yukarıda adım 2&#39;de açıklandığı gibi olarak artmış bayrak-CFTR (wt)). </li><li> Lizis tamponu ile iki kez karmaşık yıkayın. Her yıkama için 1 dakika için 800 × g Spin ve dikkatle her yıkamadan sonra süpernatant aspire. Alt boncuk emmek için dikkatli kullanın. </li><li> Boncuklara yukarıda hazırlanmış HEK293 hücre lizatları ekleyin ve yavaşça 3 saat (ya da gece boyunca) için 4 ° C&#39;de karıştırılır. </li><li> Adım boncuklar 3.6) içinde tarif edildiği gibi lizis tamponu ile yaygın üç kez yıkanır. </li><li> 30 uL numune tamponu (5 x) kullanılarak proteinleri elüt edilmesi: 0.6 M<html> Tris-HCl (pH 6.8),% 50 gliserol,% 2 SDS, ve% 0.1 mavi Bromofenol; içeren% 5 β-merkaptoetanol. </li><li> 5.000 az 10-15 dakika ve spin ° C su banyosunda × g 30 s için boncuk çöktürmek için 37 inkübe edin. </li><li> 4-15% jel üzerine tüm eluat yükleyin. </li><li> 30-40 dakika için SDS-PAGE çalıştırın. </li><li> 1.5 saat için, PVDF membran protein bantları aktarın. </li><li> % 5 yağsız süt ihtiva eden olmayan TBS-Tween içindeki membran bloke eder. </li><li> 4 azından primer antikor (anti-IgG CFTR, R1104 gibi) ile membran ° C, bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 5 dk, altı kez TBS-Tween ile membran yıkanır. </li><li> 22 ° C&#39;de 45 dakika süreyle sekonder antikor (örneğin, keçi anti-fare HRP bağlı 2. antikoru gibi) ile inkübe membran </li><li> 5 dk, altı kez TBS-Tween ile membran yıkanır. </li><li> ECL yoluyla protein bantları gözünüzde canlandırın. </li><li> Temsilci veriler Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Temsilcisi Sonuçlar In vitro olarak monte edilmiştir CFTR-içeren makromoleküler sinyalleşme karmaşık bir örnek Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. A makromoleküler kompleksi MRP4 C-terminal 50 amino asitleri (MRP4-CT50), PDZK1, ve tam uzunlukta CFTR (Şekil 1, alt) arasında oluştu. Kompleks oluşumu aracılık protein, PDZK1 (Şekil 1, alt) 18 artan miktarlarda ile doza bağımlı arttı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" /> Şekil 1. Makromoleküler karmaşık testin bir resimsel gösterimi (üstte). Bir makromoleküler karmaşık bir doza bağımlı (alt) 18 üç protein (GST-MRP4-CT50, O&#39;nun-S-PDZK1 ve Bayrak-CFTRwt) ile in vitro olarak tespit edildi. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; CFTR-NHERF1-β 2 AR (bkz. 14) </td><td> CFTR-NHERF2-LPA 2 (bkz. 15) </td><td> CFTR-PDZ proteinler-MRP 2 (bkz. 17) </td><td> CFTR-PDZK1-MRP4 (bkz. 16) </td></tr><tr><td> Affinity boncuk </td><td> Amiloz reçine </td><td> G-proteinine agaroz </td><td> Amiloz reçine </td><td> Glutatyon agaroz </td></tr><tr><td> Protein-1 Saf </td><td> MBP-β 2 AR CT </td><td> His-S-CFTR CT </td><td> MBP-CFTR CT </td><td> GST-MRP4 CT </td></tr><tr><td> Protein-2 saflaştırılmış </td><td> GST-NHERF1 </td><td> GST-NHERF2 </td><td> GST-PDZ proteinleri </td><td> His-S-PDZK1 </td></tr><tr><td> (Veya hücre lizatları) Protein-3 saflaştırılmış </td><td> CFTR-wt ya CFTR-his10 (BHK ya HEK hücre lizatları) </td><td> BayrakLPA-2-wt ya bayrak-LPA 2-ΔSTL (BHK hücre lizatları) </td><td> MRP2 (MDCK hücre lizatları) </td><td> Bayrak-CFTR-wt veya CFTR-his10 (veya hücre lizatları) Saf </td></tr><tr><td> Antikor </td><td> Anti-CFTR IgG </td><td> Anti-Flag HRP </td><td> Anti-MRP2 IgG </td><td> Anti-Flag HRP </td></tr></tbody></table> In vitro monte çeşitli CFTR içeren makromoleküler kompleksleri Tablo 1. Özeti.

<ol><li>Anderson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+CFTR+is+a+chloride+channel+by+alteration+of+its+anion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity.</a> Science. 253, 202-205 (1991).</li>
<li>Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR.</a> Cell. 68, 809-818 (1992).</li>
<li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+impermeability+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chloride impermeability in cystic fibrosis.</a> Nature. 301, 421-422 (1983).</li>
<li>Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+intracellular+transport+and+processing+of+CFTR+is+the+molecular+basis+of+most+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis.</a> Cell. 63, 827-834 (1990).</li>
<li>Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+heterozygote+resistance+to+cholera+toxin+in+the+cystic+fibrosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model.</a> Science. 266, 107-109 (1994).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+chloride+channel+in+the+apical+compartments%3A+spatiotemporal+coupling+to+its+interacting+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners.</a> Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).</li>
<li>Chao, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+intestinal+CFTR+Cl-+channel+by+heat-stable+enterotoxin+and+guanylin+via+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase.</a> Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+and+outward+rectifying+chloride+channels+are+distinct+proteins+with+a+regulatory+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship.</a> Nature. 363, 263-268 (1993).</li>
<li>McNicholas, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+a+renal+K%2B+channel+%28ROMK2%29+to+the+inhibitory+sulfonylurea+compound+glibenclamide+is+enhanced+by+coexpression+with+the+ATP-binding+cassette+transporter+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).</li>
<li>Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+activates+aquaporin+3+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).</li>
<li>Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+drives+Na%2B-nHCO-3+cotransport+in+pancreatic+duct+cells%3A+a+basis+for+defective+HCO-3+secretion+in+CF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF.</a> Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).</li>
<li>Ahn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interaction+between+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+HCO3-+salvage+mechanisms+in+model+systems+and+the+mouse+pancreatic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct.</a> J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).</li>
<li>Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Cl-+channel+and+CFTR-associated+ATP+channel%3A+distinct+pores+regulated+by+common+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates.</a> Embo. J. 17, 898-908 (1998).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+chloride+channels+by+syntaxin+and+Munc18+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms.</a> Nature. 390, 302-305 (1997).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+1A+is+expressed+in+airway+epithelial+cells%2C+where+it+modulates+CFTR+Cl%28-%29+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents.</a> J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+complex+of+beta+2+adrenergic+receptor%2C+CFTR%2C+and+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin-binding+phosphoprotein+50+is+regulated+by+PKA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+inhibits+cholera+toxin-induced+secretory+diarrhea+through+CFTR-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions.</a> J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+coupling+of+cAMP+transporter+to+CFTR+chloride+channel+function+in+the+gut+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia.</a> Cell. 131, 940-951 (2007).</li>
<li>Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+carcinogen+NNK+transporter+MRP2+regulates+CFTR+function+in+lung+epithelia%3A+implications+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer.</a> Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).</li>
<li>Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+motif+found+in+the+beta2-adrenergic+receptor%2C+P2Y1+receptor+and+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+determines+binding+to+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger+regulatory+factor+family+of+PDZ+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).</li>
<li>Short, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apical+PDZ+protein+anchors+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+to+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton.</a> J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).</li>
<li>Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+protein+facilitated+CFTR-CFTR+interaction%2C+a+molecular+mechanism+to+potentiate+the+chloride+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity.</a> Cell. 103, 169-179 (2000).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3KARP+mediates+the+association+of+ezrin+and+protein+kinase+A+with+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+airway+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells.</a> J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golgi-associated+PDZ+domain+protein+modulates+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+plasma+membrane+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression.</a> J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).</li>
<li>Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PDZ+protein+regulates+the+activity+of+guanylyl+cyclase+C%2C+the+heat-stable+enterotoxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).</li>
<li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+by+competitive+interactions+of+molecular+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).</li>
<li>Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+DeltaF508-CFTR+trafficking+via+a+GRASP-dependent+unconventional+secretion+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway.</a> Cell. 146, 746-760 (2011).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+intermolecular+and+intramolecular+interactions+regulating+CFTR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function.</a> Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).</li>
<li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokolde Bu şekilde, daha önce 16-19,29,30 bildirilen in vitro monte edilmesi ve saflaştırılmış protein (ya da proteininin parçacıkları) ve / veya hücre lizatları kullanılarak makromoleküler sinyalleşme kompleksi ihtiva eden bir CFTR tespiti için bir yöntemi göstermektedir. Hazırlık sürecinde iyi sonuçlar aşağıdaki kritik noktalar elde etmek için özel dikkat gerektirir: <ul><li> Bu işlem tampon maddesi ile pH adım 1) &#39;de anlatıldığı gibi GST-füzyon proteinin saflaştırılması sırasında glu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> pGEX4T-1 vektör </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td> Eskiden Amersham Biosciences </td></tr><tr><td> pMAL-C2 vektör </td><td> New England Biolabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pET30 vektör </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 69077-3 </td><td> Eskiden Novagen </td></tr><tr><td> Glutatyon agaroz boncuk </td><td> BD Biosciences </td><td> 554780 </td><td></td></tr><tr><td> Amiloz reçine </td><td> New England Biolabs </td><td> E8021S </td><td></td></tr><tr><td> Talon boncuk </td><td> Clontech&#39;in </td><td> 635501 </td><td></td></tr><tr><td> indirgenmiş glutatyon </td><td> BD Biosciences </td><td> 554782 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> imidazol </td><td> Balıkçı </td><td> BP305-50 </td><td></td></tr><tr><td> maltoz </td><td> Balıkçı </td><td> BP684-500 </td><td></td></tr><tr><td> G-proteinine agaroz </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 69704-3 </td><td> Eskiden Novagen </td></tr><tr><td> Anti-Flag HRP </td><td> Sigma </td><td> A8592 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CFTR IgG </td><td> Ismarlama </td><td> R1104 </td><td> aa 722-734 de CFTR epitop tanıma mAb </td></tr><tr><td> Anti-MRP2 IgG </td><td> Chemicon Uluslararası </td><td> MAB4148 </td><td> Millipore şimdi bir parçası </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Özel reaktifleri ve ekipmanları.

pdz bağımlı cftr makromoleküler sinyal kompleksleri İn vitro analizi

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), öncelikle epitel hücrelerinin apikal hücre zarlarında bulunan bir klor kanalı, 1-3 transepitelyal sıvı dengesinin önemli bir rol oynar. Kistik fibrozis (CF) 4 ve sekretuar ishal 5: CFTR iki önemli hastalıklarla ilişkisi olmuştur. CF, CFTR Cl-kanalının sentez ya da işlevsel aktivitesini azalır. Bu hastalık Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 2500 Kafkasyalılar 6 yaklaşık 1 etkiler. Aşırı CFTR etkinliği de cAMP veya bağırsak 7 cGMP üretimini uyarır toksin kaynaklı sekretuar ishal (örneğin, kolera toksini ve ısıya dayanıklı enterotoksin tarafından E. coli) durumlarında ortaya konmuştur. Biriken deliller CFTR ve taşıyıcılar, iyon kanalları, reseptörler, kinazlar, fosfatazlar, sinyal dahil olmak üzere diğer proteinler giderek artan sayıda, arasındaki fiziksel ve fonksiyonel etkileşimlerin varlığını aklaING molekülleri ve sitoskeletal elemanları ve CFTR ve bağlayıcı protein arasındaki bu etkileşimlerin kritik in vitro ve in vivo da 8-19 CFTR-aracılı transepitelyal iyon taşıma düzenleyen dahil edilmesi gösterilmiştir. Bu protokol, biz sadece yöntemleri üzerinde durulacak bir protein bağlayan bir motif sahip CFTR karboksil terminal kuyruk arasındaki etkileşimlerin çalışmada yardım ve [motifi PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) olarak anılacaktır] Belirli bir bağlayıcı modülü ihtiva iskelesi proteinlerin grubu PDZ etki olarak anılacaktır. Şimdiye kadar, birkaç farklı PDZ iskele proteinler gibi NHERF1 gibi çeşitli akrabalıklar, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR ilişkili ligand), Shank2 ile CFTR karboksil terminal kuyruk bağlamak ve 20-27 ÇIKAN bildirilmiştir. PDZ iskele proteinler tarafından tanınır CFTR içinde PDZ motifi C terminus (yani, insan KFTR 1477-DTRL-1480) 20 son dört amino asitler olduğu. İlginç bir şekilde,CFTR akrabalıklar 22 farklı da olsa, NHERFs ve PDZK1 hem birden fazla PDZ alanı bağlayabilirsiniz. CFTR bağlayıcı bakımından Bu çok-değerliğine PDZ iskelesi proteinleri hücreleri 16-18 seçici / spesifik ve verimli bir sinyalleşme için kompleksleri sinyalleşme CFTR makromoleküler oluşumunu kolaylaştıran olabileceğini düşündürmektedir işlevsel bir öneme sahip olduğu gösterilmiştir. Çoklu biyokimyasal testler incelemek için geliştirilmiştir CFTR-içeren bu işbirliğinin immünopresipitasyon, açılan tayini, çifti-bilge birleştirme testi, kolorimetrik çifti-bilge birleştirme testi ve makromoleküler karmaşık bir montaj test 16-19,28,29 gibi protein etkileşimleri, . Burada protein-protein ya da CFTR 16-19,28,29 içeren etki alanı etki alanı etkileşimlerini incelemek için laboratuvar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır in vitro, karmaşık bir PDZ motifi bağımlı CFTR içeren makromoleküler montaj ayrıntılı yordamlar odaklanın.

Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), epitelyal bir klor kanalı, çeşitli proteinler ile etkileşim ve önemli hücre süreçlerini düzenleyen bildirilmiştir; aralarında CFTR PDZ motifi aracılı etkileşimleri de belgelenmiştir. Bu protokol bizim karmaşık bir sinyal PDZ bağımlı CFTR makromoleküler birleştirmek için geliştirilen yöntemler açıklanır<em&gt; In vitro</em&gt;.

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Öncelikle epitelyal hücrelerin apikal membranlarında yer alan bir klor kanalı olan kistik fibrozis transmembran iletkenlik düzenleyicisi (CFTR), ... oynamaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, in vitro ortamda PDZ bağımlı bir kistik fibrozis transmembran iletkenlik düzenleyici (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) veya CFTR makromoleküler sinyal kompleksini oluşturmaktır. Bunu gerçekleştirmek için, rekombinant etiketli füzyon proteinleri bakterilerde eksprese edilir ve saflaştırılır. Ardından, CFTR veya CFTR bağlayıcı proteinler eksprese eden kültürlerden hücre lizatları elde edilir.Ardından, CFTR içeren makromoleküler sinyalizasyon kompleksini oluşturmak için CFTR ve bağlanma proteinleri in vitro ortamda birleştirilir. Daha sonra, CFTR makromoleküler komplekslerinin oluşumunu gösteren Western blotting işlemi gerçekleştirilir ve sonuçlar western blotting ile değerlendirilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, CFTR içeren yüksek proteinli bir makromoleküler kompleksin oluşumunu doğrudan tespit edebilmemiz ve görselleştirebilmemizdir.Böylece bu yöntem, macromolecular complex içeren CT R oluşumuna dair bilgi sağlayabilir. Ayrıca, sex C iki macromolecular signaling complex gibi CFTR ile ilişkili olmayan protein dışı komplekslerin birleştirilmesinde de uygulanabilir. En son olarak, yine aynı yöntemi kullanarak, kemore

in-vitro-analysis-pdz-dependent-cftr-macromolecular-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil...

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Tek-geçişli transmembran etki oligomerization eğilimi (TMDS) değerlendirmek için etkili bir prosedür açıklanmıştır. E. coli muhabiri zorlanma ToxR için erimiş TMD oluşan Kimerik proteinleri ifade edilir. TMD-kaynaklı oligomerization ToxR, transkripsiyon ve muhabir protein üretimi,-galaktosidaz aktivasyonu dimerization neden olur.

ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır.

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Keşfedin PDZ bağımlı CFTR makromoleküler sinyal komplekslerinin in vitro analizini. Rekombinant protein ekspresyonu ve western blot ile CFTR etkileşimlerini doğrudan görselleştirin.

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Daha fazla video keşfet