PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Bu prosedürün genel amacı, in vitro ortamda PDZ bağımlı bir kistik fibrozis transmembran iletkenlik düzenleyici (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) veya CFTR makromoleküler sinyal kompleksini oluşturmaktır. Bunu gerçekleştirmek için, rekombinant etiketli füzyon proteinleri bakterilerde eksprese edilir ve saflaştırılır. Ardından, CFTR veya CFTR bağlayıcı proteinler eksprese eden kültürlerden hücre lizatları elde edilir.

Ardından, CFTR içeren makromoleküler sinyalizasyon kompleksini oluşturmak için CFTR ve bağlanma proteinleri in vitro ortamda birleştirilir. Daha sonra, CFTR makromoleküler komplekslerinin oluşumunu gösteren Western blotting işlemi gerçekleştirilir ve sonuçlar western blotting ile değerlendirilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, CFTR içeren yüksek proteinli bir makromoleküler kompleksin oluşumunu doğrudan tespit edebilmemiz ve görselleştirebilmemizdir.

Böylece bu yöntem, macromolecular complex içeren CT R oluşumuna dair bilgi sağlayabilir. Ayrıca, sex C iki macromolecular signaling complex gibi CFTR ile ilişkili olmayan protein dışı komplekslerin birleştirilmesinde de uygulanabilir. En son olarak, yine aynı yöntemi kullanarak, kemoreseptörümüz CXCR iki'nin downstream efektör ile fiziksel olarak protein kompleksi oluşturduğunu kanıtladık.

PCR kullanarak nötrofillerdeki wild nerve one'i aracılık eden PRC beta three'i belirleyin. C terminusindeki PDZ motiflerini içeren son 50 ila 100 amino asidi kodlayan DNA'yı amplifiye edin. CAMP taşıyıcısı, MRP four ve sodyum hidrojen değiştirici düzenleyici faktör veya N-H-E-R-F'nin PDZ 1 alanı için bunu tekrarlayın.

Ardından, GST füzyon proteinleri üretmek için RP dört PCR ürünlerini pGEX-4T1'e ve N-H-E-R-F'nin PDZ1 domainini pET-30'a klonlayın. His-tag füzyon proteinleri üretmek için bakterileri ısı şokuyla transforme edin. Proteaz eksik bir E. coli suşunu, vektöre uygun antibiyotikleri içeren 50 mL LB besiyerinde, 37 °C'de, çalkalamalı bir inkübatörde gece boyunca SOC besiyerinde büyütün.

Ertesi gün kültürü 1/10 oranında 500 ml Luria Bertani besiyerinde seyreltin ve kültürü 37 °C'de çalkalayarak tekrar inkübe edin; iki saat sonra, 0,5 ile 1 mM IPTG kullanarak 30 °C'de dört saat boyunca rekombinant proteinin transkripsiyonunu indükleyin.

İnkübasyon sonrası, kültürleri 250 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 8.000 ×g hızında santrifüj ederek çöktürün. Santrifüj işleminin ardından süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri liz etmek için içerisine lizozim (mililitre başına bir miligram), %0,2 Triton X 100 ve proteaz inhibitörleri eklenmiş 20 mililitre sükroz tamponu ilave edin; ardından bakteri süspansiyonunu temiz bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.

Dört derece santigrat sıcaklıkta, döner çalkalayıcıda 30 dakika boyunca karıştırın. Ardından dört derece santigrat sıcaklıkta, 20.000 ×g hızında 30 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüjleme işleminden sonra süpernatan berraklaşacak ve tüpün dibinde çözünmez bir APP peleti oluşacaktır.

Berrak süpernatanı yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe toplayın. Ardından süpernatana, uygun reçineden bir mililitre ekleyin. Aero beads, sükroz tampon glutatyon içinde %50'lik bir süspansiyon olarak hazırlanmıştır.

GST füzyon proteinleri için Aero boncuklar, HisS füzyon proteinleri için ise talon boncuklar kullanılmalıdır. Bir döner çalkalayıcıda, 4 °C'de dört saat boyunca karıştırın. Ardından boncukları 800 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hücreleri 15 mililitre PBS içerisinde süspanse ederek yıkayın ve bir rotator üzerinde iki dakika boyunca karıştırın. Son olarak süpernatanı uzaklaştırın. Altıncı yıkamadan sonra bu işlemi toplam altı kez tekrarlayın.

Proteini boncuklardan elüe etmek için, her bir mililitre boncuk için iki mililitre uygun elüsyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karıştırın. Boncuklarla birlikte elüe edilen proteinin tamamını bir kolona dökün ve akış sıvısını elüe protein olarak toplayın. Ardından, UD proteini diyaliz tüpüne aktarın.

Elüye edilen proteinleri, dört santigrat derecede karıştırarak iki litre PBS ilele diyalize edin. Diyaliz sonrası PBS'yi dört kez, her dört saatte bir değiştirin. Proteini 0,5 ile bir mililitreye kadar konsantre edin.

10.000 megawatt cutoff merkezkaç filtresi kullanın. Numuneyi 200 µL'lik porsiyonlara ayırın. Birini analiz için ayırın ve diğerlerini saklama amacıyla -80 °C'ye yerleştirin.

Bradford Yöntemi ile protein konsantrasyonunu belirleyin. BSAS standartlarını kullanarak SDS-PAGE ile protein kalitesini değerlendirin. Proteinin bütünlüğü tatmin edici değilse, jel filtrasyonu veya iyon değişimi gibi ikincil saflaştırma prosedürleri kullanılabilir.

Yaban tip flag CFTR eksprese eden HEK 2 93 hücreleri, beraberindeki dokümanda belirtildiği şekilde kültüre edilmelidir. Hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve PBS ile yıkayın. Ardından hücreleri liz etmek için, her bir 60 milimetrelik kültür kabına 500 microliter liz tamponu ekleyin ve hücre lizatlarını dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca sallayın.

Lizatları yeni mikro santrifüj tüplerine aktarın. Ardından, çözünmez proteinleri uzaklaştırmak için 4 °C'de, 16.000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantları toplayın. CFTR içeren makromoleküler kompleksleri in vitro ortamda bir araya getirmek için Bradford testi ile protein konsantrasyonunu belirleyin.

Önce, 20 µg saflaştırılmış G-S-T-M-R-P dört C-terminali 50 amino asit füzyon proteini ile 0 ile 40 µg arasında değişen miktarlarda saflaştırılmış hiss S PD zk bir füzyon proteinini, 200 µL lizis tamponu içeren 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpünde birleştirerek başlayın. İki proteini 22 °C'de, bir döner karıştırıcı üzerinde bir ila iki saat boyunca karıştırın. Ardından, protein karışımına 20 µL %50'lik glutatyon boncuk süspansiyonu ekleyin ve bir saat daha karıştırmaya devam edin.

Bu adım aynı zamanda, G-S-T-M-R-P dört CT 50'nin SPD zk birine bağlandığı çiftli bağlanma olarak da adlandırılır. Bu süre zarfında, çiftli bağlanma adımını takiben, videonun önceki bölümünde açıklandığı şekilde vahşi tip flag CFTR'yi aşırı eksprese eden HEK 2 93 hücre lizatlarını hazırlayın. Kompleksi, her yıkama için bir dakika boyunca 800 ×g'de santrifüj ederek lizis tamponu ile iki kez yıkayın ve her yıkamadan sonra süpernatantı dikkatlice aspire edin.

Boncukların alttan aspire edilmemesine dikkat edin. HT K 2 93 hücre lizatlarını boncuklara ekleyin ve inkübasyon sonrası 4 °C'de, döner bir karıştırıcıda üç saat boyunca veya gece boyunca nazikçe karıştırın. Boncukları üç kez lizis tamponu ile yıkayın; her yıkamadan sonra ve son yıkamanın ardından, daha önce olduğu gibi santrifüj işlemi uygulayın.

Proteinleri elüe etmek için 30 µL beş x örnek tamponu ekleyin ve 37 °C su banyosunda 10 ila 15 dakika inkübe edin. Ardından, boncukları çöktürmek için 5.000 ×g'de bir dakika santrifüjleyin. Sonrasında, tüm elüatı %4-15 SDS-PAGE jeline yükleyin ve jel sonuna kadar 200 V'da yürütün. Yürütme işleminin ardından, protein bantlarını BioRad transfer cihazında 60 V'da 1,5 saat boyunca PVDF membrana transfer edin.

Transfer işlemi tamamlandıktan sonra, membranı %5 yağsız süt içeren TBS tween içerisinde bir saat boyunca bloke edin. CFTR ile etkileşime giren proteinleri görüntülemek için beraberindeki belgede açıklandığı şekilde western blotting işlemine devam edin. Bu görsel temsilde gösterildiği ve bu videoda anlatıldığı üzere, A-C-F-T-R içeren makromoleküler sinyal kompleksi in vitro olarak oluşturulmuştur.

Makromoleküler kompleks oluşumunun doz bağımlılığını belirlemek için Mr.RRP four PD zk one'ın C terminalindeki 50 amino asit ile tam uzunluktaki CFTR arasında bir makromoleküler kompleks oluşturuldu. Burada gösterildiği üzere, artan miktarlarda ara protein PD ZK one eklendi. Kompleksin doz bağımlı olarak artması, ara protein PD ZK one'ın CCF TR ve Mr.Rrp four arasındaki etkileşime aracılık ettiğini göstermiştir.

Bu prosedürü uygularken, FTR agregasyonu yaygın bir sorun olduğundan, western blotting için hazırlanan FTR konteyner mikromolekül kompleks örneklerinin kaynatılmaması gerektiğini unutmamak önemlidir. Bunun yerine, bu prosedürü takip ederek, örnekler jele yüklenmeden önce 37 derece'de 10 ila 15 dakika boyunca ısıtılmalıdır. Hava yolu epitel hücreleri ve bağırsak epitel hücreleri gibi hücrelerdeki endojen CFTR komplekslerini değerlendirmek için ko-presipitasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, in vitro ortamda PTC bağımlı bir CFDR Makromoleküler Sinyal Kompleksi'nin nasıl bir araya getirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.