C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

Deniz zarafetinin hareketi, deniz zarafeti davranışında yer alan genlerin ve nöronların keşfinde önemli bir araçtır. Deniz zarafeti, ileri ve geri hareketler ve çeşitli dönüş türleri gibi kalıplaşmış lokomotor davranışlara şekil değiştirerek maruz kalır. Bu hareketleri uzun mesafelerde ve yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte ölçmek için, bir agar plakasının yüzeyinde sürünürken deniz zarafetinin hareketini yakalamak için bir solucan izleyici yaptık.

Ayrıca, laboratuvar görünümünde ve matlab'da yazılmış özel programları kullanarak bu hareketleri kantitatif olarak izole etmek ve analiz etmek için yazılımlar geliştirdik. Tüm video izleme sistemlerinin bir zorluğu, son derece boyutlu olan muazzam miktarda veri üretmeleridir. Görüntü işleme ve veri analizi programımız, bu zorluğun üstesinden gelerek, solucan şekillerini bir dizi bağımsız bileşene indirgeyerek, solucan davranışını yalnızca üç ila dört boyutun bir fonksiyonu olarak kapsamlı bir şekilde yeniden yapılandırdık.

Bir agar plakası, bir fiber ışık kaynağı ile aydınlatılır ve bir kamera ile görüntülenir. Bu sistem bir XY çeviri aşamasına monte edilir. Sahne, bir step motor kontrolörüne bağlı olan standart step motorlar tarafından hareket ettirilir.

Denetleyici ve kamera bilgisayara bağlanır ve laboratuvar görünümünde yazılmış özel programlar tarafından kontrol edilir. Kamera, bir agar plakasının yüzeyini görüntüler ve açık renkli bir arka plan üzerindeki karanlık nesneleri tanımlar. Otomatik kalibrasyon işlemi için bir kalibrasyon işareti, agar yüzeyi dürtülerek yapılır.

Bir solucan penası ile, görüntü kalitesi, bilgisayar programının nesneleri gerçek zamanlı olarak ölçebilmesi için ayarlanır. Kameranın kazancı, parlaklığı ve deklanşör hızı, beyaz bir arka plan üzerinde karanlık bir nesne sağlamak için ayarlanabilir. İzleme programı tarafından kullanılan filtrelenmiş ikili görüntü kontrol edilebilir.

Yazılım, bir test nesnesini hareket ettirerek kalibrasyon matrisini hesaplayan bir otomatik kalibrasyon özelliğine sahiptir. Sabit bir mesafe. Piksel cinsinden mesafeler, kalibrasyon matrisi tarafından step motor tarafından atılan adımlara göre kalibre edilir.

Kalibrasyondan sonra sistem kullanıma hazırdır ve büyütme değiştirilmedikçe veya kamera yeniden konumlandırılmadıkça yeniden kalibre edilmesine gerek yoktur. Solucanları toplamak ve plakanın kenarına göç etmelerini önlemek için bakır bir halka kullanılacaktır. Halkayı önce bir ısı bloğu veya eşdeğeri üzerine yerleştirerek ısıtın.

Halka yaklaşık bir dakika ısıtılmalıdır. Halkayı yeni bir agar plakasına yerleştirin ve agar yüzeyine gömmek için hafifçe aşağı bastırın. Ve NGM tamponu ile doldurulmuş bir agar plakası, L dört ve genç yetişkin aşama solucanlarını yiyecek artıklarından yıkamak için kullanılacaktır.

Solucanları NGM tamponuna topladıktan sonra, birkaç dakika yüzmelerine izin verin. Yıkanmış solucanlardan birini dikkatlice halkanın ortasına yakın bir izleme plakasına yerleştirin. Bu plaka daha sonra solucan izleyici için kullanılacaktır.

Hazırlanan plakayı solucan izleyici aşamasına yerleştirin. Laboratuvar görünümü programını çalıştırın ve gerekirse görüntülerin konumu, görüntü türleri, ölçümler ve kamera ayarları gibi seçenekleri belirleyin. Joystick'i kullanarak, solucanın bir görüntüsü bilgisayar ekranında görüş alanına girene kadar mikroskobu hareket ettirin.

Ardından izleme programını devreye sokmak için izle'ye basın. Burada gerçek zamanlı olarak izlenen bir solucanı gösteriyoruz. Bilgisayar programı, gösterildiği gibi ikili filtrelenmiş görüntülerin hareketlerini ölçer ve bu görüntünün ölçümlerini gerçek zamanlı olarak yapabilir.

İzlemeden sonra, step motor hareketlerinden küresel yörüngenin yeniden yapılandırılması yapılabilirken, solucanın yerel şekil değişiklikleri ayrıntılı olarak görülebilir. Solucanlar dalgalı hareketler yaparak sürünürler. Bu hareketleri, solucanı tek bir merkez eğrisine iskeletleştirerek ve ardından bu eğriyi bir dizi açı olarak tanımlayarak yakalarız.

Daha sonra iskeletleri, aksi takdirde özvektörler olarak bilinen temel şekillerine ayrıştırırız. Bu özit modları ile solucan şekillerini yeniden yapılandırabilir ve solucanın hareketlerini ölçebiliriz. İlk iki modu kullanarak, ikinci panelde görüldüğü gibi solucanın dalgalanma döngüsünün faz konumunu özellikle yakalayabiliriz.

İlk panel, dairesel bir limit döngüsünü vurgulayarak birinci ve ikinci modların ortak dağılımını gösterir. Bir yöndeki faz hareketi ileri harekete karşılık gelir ve diğer yöndeki faz hareketi geriye doğru harekete karşılık gelir. Bu nedenle, faz hızı solucanın hızına karşılık gelir.

Gerçek uzayda, faz ve gerçek dünya hızının güçlü korelasyonu son panelde görülebilir. Eigen modundan türetilen faz hızını kullanarak, deniz zarafeti davranışının gözle gözden kaçacak bazı ince ayrıntılarını ortaya çıkarabiliriz. Örneğin, faz hızının ve fazın ortak dağılımı, solucanların tercihen belirli hareket aşamalarında ileri duruma ayrıldığını ve girdiğini açıkça gösterir.

Burada, yüzeyde ve ACA plakalarında tarama olarak silikonların davranışının ayrıntılı görüntülerini kaydeden, kullanımı kolay bir izleme sistemi gösterdik. Bu görüntülerde yer alan bilgi miktarı çok geniş ve oldukça boyutludur ve bu nedenle dört temel ölçümde verilerin boyutsallığını azaltmak için bir yöntem de oluşturduk. Bu önlemlerin solucan davranışına göre yorumlanması kolaydır.

Bu çalışma, davranışsal solucanları daha düşük modifikasyonlarda ölçmek için üretilmiştir ve sistem, gen genetik ve kaplanmış bölgeleri kullanarak nöronal aktiviteyi ölçmek için de kullanılabilir. Sistem bir bütün olarak tasarım açısından esnektir ve Doof yasası, LOE'ler gibi diğer tarama sistemleriyle birlikte kullanılabilir.