C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

Fenotipleme. C. elegans'ın lokomosyonu, C. elegans davranışında rol oynayan genlerin ve nöronların keşfi için önemli bir araçtır. C. elegans, şekillerini değiştirerek ileri ve geri hareketler ile çeşitli dönüş türleri gibi stereotipik lokomotor davranışlar sergiler. Bu hareketleri uzun mesafelerde ve yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte nicelleştirmek için, C. elegans'ın bir agar plaka yüzeyinde sürünürken hareketlerini kaydetmek amacıyla bir solucan takip sistemi kurduk.

Ayrıca, LabVIEW ve MATLAB kullanılarak laboratuvarda yazılan özel programlar aracılığıyla bu hareketleri izole etmek ve nicel olarak analiz etmek için bir yazılım geliştirdik. Tüm video takip sistemlerinin karşılaştığı zorluk, yüksek boyutlu ve çok büyük miktarda veri üretmeleridir. Görüntü işleme ve veri analiz programımız, solucan formlarını bir dizi bağımsız bileşene indirgeyerek bu zorluğun üstesinden gelmektedir; böylece solucan davranışını yalnızca üç ila dört boyutun bir fonksiyonu olarak kapsamlı bir şekilde yeniden yapılandırdık.

Bir agar plakası, fiber ışık kaynağı ile aydınlatılır ve bir kamera ile görüntülenir. Bu sistem bir XY translasyon tablasına monte edilmiştir. Tabla, bir step motor kontrolörüne bağlı standart step motorlar tarafından hareket ettirilir.

Kontrolcü ve kamera bilgisayara bağlıdır ve LabVIEW ile yazılmış özel programlar aracılığıyla kontrol edilir. Kamera, bir agar plak sayfasının yüzeyini görüntüler ve açık renkli bir arka plan üzerindeki koyu renkli nesneleri tanımlar. Otomatik kalibrasyon işlemi için kullanılan kalibrasyon işareti, agar yüzeyine batırma yapılarak oluşturulur.

Bir solucan toplama çubuğu ile, bilgisayar programının nesneleri gerçek zamanlı olarak sayabilmesi için görüntü kalitesi ayarlanır. Beyaz arka plan üzerinde koyu renkli bir nesne elde etmek için kameranın kazancı, parlaklığı ve perde hızı ayarlanabilir. İzleme programı tarafından kullanılan filtrelenmiş ikili görüntü kontrol edilebilir.

Yazılım, bir test nesnesini sabit bir mesafe boyunca hareket ettirerek kalibrasyon matrisini hesaplayan otomatik bir kalibrasyon özelliğine sahiptir. Piksel cinsinden mesafeler, kalibrasyon matrisi aracılığıyla step motorun attığı adımlara göre kalibre edilir.

Kalibrasyon tamamlandıktan sonra sistem kullanıma hazırdır ve büyütme değiştirilmediği veya kamera yeniden konumlandırılmadığı sürece yeniden kalibre edilmesine gerek yoktur. Solucanları bir arada tutmak ve plakanın kenarlarına göç etmelerini önlemek için bir bakır halka kullanılacaktır. Halkayı önce bir ısıtma bloğuna veya eşdeğerine yerleştirerek ısıtın.

Halka yaklaşık bir dakika boyunca ısıtılmalıdır. Halkayı taze bir agar plakasına yerleştirin ve agar yüzeyine gömülmesi için hafifçe bastırın. L4 ve genç erişkin evredeki solucanlardaki besin kalıntılarını yıkamak için NGM tamponu ile doldurulmuş bir agar plakası kullanılacaktır.

Solucanlar NGM tamponuna alındıktan sonra, birkaç dakika boyunca yüzmelerine izin verin. Yıkanmış solucanlardan birini dikkatlice takip plakasına, halkanın merkezine yakın bir yere yerleştirin. Bu plaka daha sonra solucan takip cihazı için kullanılacaktır.

Hazırlanan plakayı solucan takip cihazının tablasına yerleştirin. LabVIEW programını çalıştırın ve gerekliyse görüntülerin kaydedileceği konum, görüntü türleri, ölçümler ve kamera ayarları gibi seçenekleri belirleyin. Joystick'i kullanarak, bilgisayar ekranındaki görüş alanında solucanın görüntüsü görünene kadar mikroskobu hareket ettirin.

Ardından, takip programını başlatmak için "track" (takip et) düğmesine basın. Burada gerçek zamanlı olarak takip edilen bir solucan gösterilmektedir. Bilgisayar programı, gösterildiği gibi ikili filtrelenmiş görüntülerin hareketlerini ölçer ve bu görüntünün ölçümlerini gerçek zamanlı olarak yapabilir.

Takip işleminin ardından, step motor hareketlerinden yararlanılarak küresel yörüngenin bir yeniden yapılandırması oluşturulabilirken, solucanın yerel şekil değişiklikleri ayrıntılı olarak görülebilir. Solucanlar, dalgalı hareketler yaparak sürünürler. Bu hareketleri, solucanı tek bir merkez eğrisi şeklinde iskeletleştirerek ve ardından bu eğriyi bir dizi açı olarak tanımlayarak yakalarız.

Ardından, iskeletleri temel şekillerine, diğer bir adla öz vektörlerine ayrıştırırız. Bu öz modlar ile solucan şekillerini yeniden oluşturabilir ve solucanın hareketlerini niceliksel olarak belirleyebiliriz. İlk iki modu kullanarak, ikinci panelde görüldüğü üzere solucanın dalgalanma döngüsündeki faz konumunu spesifik olarak yakalayabiliriz.

İlk panel, dairesel bir limit döngüsünü vurgulayarak birinci ve ikinci modların ortak dağılımını göstermektedir. Bir yöndeki faz hareketi ileriye doğru harekete, diğer yöndeki faz hareketi ise geriye doğru harekete karşılık gelir. Bu nedenle, faz hızı solucanın hızına karşılık gelmektedir.

Gerçek uzayda, faz ile gerçek dünya hızı arasındaki güçlü korelasyon son panelde görülebilmektedir. Eigen modundan türetilen faz hızını kullanarak, gözle kaçırılabilecek deniz zarafeti davranışının bazı ince ayrıntılarını ortaya çıkarabiliriz. Örneğin, faz hızı ve fazın ortak dağılımı, solucanların ileri durumdan tercihen hareketin belirli fazlarında çıktıklarını ve bu duruma girdiklerini açıkça göstermektedir.

Burada, silikonların yüzeyler ve ACA plakaları üzerindeki sürünme davranışlarının detaylı görüntülerini kaydeden, kullanımı kolay bir takip sistemini göstermiş bulunmaktayız. Bu görüntülerin içerdiği bilgi miktarı oldukça geniş ve yüksek boyutludur; bu nedenle verilerin boyutunu dört temel ölçüye indirgeyen bir yöntem de geliştirdik. Bu ölçümler, solucan davranışı açısından kolayca yorumlanabilmektedir.

Bu çalışma, düşük modifikasyonlarda solucan davranışlarını ölçmek için oluşturulmuştur ve sistem aynı zamanda genetik olarak işaretlenmiş ve kaplanmış bölgeler kullanılarak nöronal aktiviteyi ölçmek için de kullanılabilir. Sistemin tamamı tasarım açısından esnektir ve Doof law, LOE'ler gibi diğer sürünme sistemleriyle birlikte kullanılabilir.