Azoxymethane (AOM) ve Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) ile Modelleme Kolit-İlişkili Kanser

Sıfırıncı günde, Myer ertesi hafta azoksimetan veya OM enjekte etti. İçme suları, dekstran sülfat sodyum veya DSS içeren bir çözelti ile değiştirilir. Üçüncü haftada, farelere takip eden iki hafta boyunca su verilir.

Bu DSS su döngüsü iki kez daha tekrarlanır. İkinci DSS döngüsünden sonra. Fareler, endoskopiyi yansıtarak tümörler açısından değerlendirilebilir.

10. haftadan sonra fareler sakrifiye edilir ve kolonlar toplanır. Kolonlar kızarır ve uzunlamasına açılır. Kolonlar tümör boyutu ve tümör sayısı açısından değerlendirilir.

Kolonun üçte birlik uzunlamasına bir bölümü gömülebilir ve histolojik analiz için gönderilebilir. Işık mikroskobu kullanılarak tümörler sayılabilir ve sınıflandırılabilir. Genotoksik ajanın bir OM uygulandığı ve ardından pro-inflamatuar ajanın üç döngüsünün uygulandığı bir protokol gösteriyoruz.

DSS, insan koliti ile ilişkili kanserde görülenlere morfolojik ve moleküler benzerlikleri olan farelerde hızlı ve tutarlı bir şekilde kolon tümörleri oluşturur, sıfırıncı günde kuyruk işaretleri veya kulak klipsleri olan fareler ayrı ayrı etiketlenir, her farenin temel ağırlığını bir masaya kaydeder, ardından her fareye bir OM egzersizinin kilogram başına 10 miligram çözeltisi enjekte eder. Yedinci günde genotoksik bir ajan olduğu için bir OM'yi kullanırken dikkatli olun, cimri bir sonraki hafta içme suyu olarak% 2.5'lik bir DSS çözeltisi ile birlikte verilir. Bu çözeltiyi hazırlamak için, damıtılmış suya DSS tozu ekleyin ve eriyene kadar karıştırın.

Çözelti, 0.2 mikron selüloz asetat filtreden geçirildikten sonra hazırdır. Yedi gün boyunca sürekli bir DSS çözümü tedariki sağlamak. DSS'yi her iki ila üç günde bir değiştirin.

Bu süreden sonra, kafesleri iki hafta boyunca tekrar suya geçirin. Fareleri haftada iki ila üç kez tartın ve rektal kanama ve ishal olup olmadığını gözlemleyin. Büyük tümörleri olan fareler geçici olarak rektal prolapsus geliştirebilir, ancak bu genellikle hayatta kalma yüzdesini azaltmaz.

Taban çizgisine göre kilo kaybı, kolit şiddetinin vekil bir ölçüsü olarak kullanılır. Tam bir DSS endoskopi döngüsünü takip eden hafta içinde iki ila üç günlük ishal ve rektal kanama ile birlikte% 10'a varan bir kilo kaybı beklenebilir. Ertesi. DSS'nin ikinci veya üçüncü döngüsü, fedakârlıktan önce in vivo tümör büyümesini doğrulamak için gerçekleştirilebilir.

A-O-M-D-S-S modeli tümör üretiminde oldukça güvenilir olduğundan, bu adım genellikle gerekli değildir. Fare tümörlerini bozma potansiyeline sahip olduğu için bu yöntem kullanılarak sadece birkaç fare değerlendirilmelidir. Çalışma alanınızda steril fosfat, tamponlu salin veya PBS'den oluşan bir beher ve boş bir beher bulunmalıdır.

Kullanılmış PBS'yi atmak için, sekiz ila 10 mililitre PBS'yi bir şırıngaya çekin ve kullanım başına endoskopa takın. İntraluminal içeriklerin yıkanmasında, her fareyi inhale veya enjekte edilebilir sedasyon ile uyuşturun ve fareyi düz bir tahtaya sabitleyin: Kuyruk ve göğüste bant ile fare ayak pedleri sıkıştırılabilir. Yeterli sedasyonu sağlamak için, anüsü ortaya çıkarmak için farenin alt karnını sıkıştırmak için başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın, müren endoskopunu fare rektumuna ilerletin.

İntraluminal görünümü iyileştirmek ve dışkı içeriğini çıkarmak için şişirmek ve sulamak için PBS'yi nazikçe kullanın. Monitörü gözlemlerken endoskopu yavaşça ilerletmeye devam edin. 70. günde brüt tümörlerin varlığı için, A-O-M-D-S-S ile tedavi edilen her fare birden fazla kolon tümörü barındırmalı ve değerlendirmeye hazır olmalıdır.

Daha büyük tümörler isteniyorsa bu durum haftalarca veya aylarca geciktirilebilir. Bir gavaj iğnesine bağlı PBS dolgulu bir şırınga hazırlayın. % 10 formalin temel cerrahi makas, yuvarlak uçlu makas ile yüklü bir şırınga.

% 1 Ian Blue çözeltisi ve ince forseps ile yüklü küçük bir şırınga. Ayrıca, soğuk bir tepsi, bölümlere ayırmak için soğutulmuş PBSA yeni tıraş bıçağı içeren bir uzak tekne ve% 10 formalin ile doldurulmuş bir sabitleme havzası yerleştirin, her fareyi izof, flor ve servikal çıkık veya kurumsal olarak onaylanmış başka bir yöntemle ötenazi yapın. Nihai ağırlık ve diğer ölçümler yapılabilir.

Bu sırada, fareyi ventral tarafı açıkta kalacak şekilde bir kesme tahtası üzerine yerleştirin. Kılları diseksiyon alanından uzak tutmak için karına %70 etanol püskürtün. Karnın orta hattını kavramak için forseps kullanın ve peritonu ortaya çıkarmak için deriden küçük bir kesi yapın.

Cildi peritondan ayırmak ve tüm karın boşluğunu ortaya çıkarmak için hafif çekiş kullanın. Periton içine bir kesi yapın ve bu kesiyi kostal kenar boyunca bilateral olarak uzatın. İnce bağırsağı ve kolonu yana doğru süpürmek için kapalı makas kullanın.

Bu, isteğe bağlı olarak hasat edilebilen mezenterik lenf düğümlerini ortaya çıkaracaktır. Değerlendirme için, inen kolon ve rektumu ortaya çıkarmak için genital idrar yolunu aşağı doğru süpürün, pelvisi daha fazla açığa çıkarmak için mesane ve üreme organlarını gerektiği gibi çıkarın. Bitişik dokuları bozmamaya dikkat etmek.

Anal rektal bileşkeyi ortaya çıkarmak için alt ve üst kasık ramisini kesin. Nazikçe yukarı doğru çekiş sağlarken kolonu serbest bırakmak için anal rektal kavşağın etrafındaki cildi kesin. Forseps mezenterik ile, kolonun ekleri eksize edilebilir veya alay edilebilir.

Anal rektal bileşkedeki cildin bir kısmını tutmak önemlidir, çünkü bu alan genellikle displaziden etkilenir. Kalın bağırsağı ince bağırsaktan çekumun hemen proksimalinden geçirin. Beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı 18 gauge gavaj iğnesi kullanarak secumu bitişik kolondan ayırın.

Kolonu buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, böylece yuvarlatılmış kenarlı makas kullanarak sıvı fizyolojik yönde çıkar. Kolonu mezenteri boyunca açın. Açık iki kolonu soğuk tepsiye boyayın.

Tepsinin dokuyu dondurmayacak kadar çözüldüğünden emin olun. Tümörleri daha iyi görselleştirmek için parmağınızla birkaç damla %1 Ian Blue uygulayın. Tümör sayısını ve boyutunu bir cetvelle değerlendirin veya dijital analiz için fotoğraf çekin.

Bitişik normal dokudaki tümörün küçük bölümleri, RNA proteini veya immünohistokimyasal yöntemlerle gelecekteki analizler için bu noktada eksize edilebilir ve histolojik değerlendirme için kolonun bir kısmı bırakılabilir. Şırınga veya parmakla soğuk tepside kalan kolona% 10 resmi uygulayın ve dokunun en az 30 saniye sabitlenmesine izin verin. Bu sayede fiksasyon havuzuna transferi kolaylaştırır.

Aynı tepside yeni açılmış bir kolonu boyamadan önce artık forminin silindiğinden emin olun. Kolonu %10 formin ile doldurulmuş ve kenarlarından sabitlenmiş bir leğene aktarın. Üç saatlik fiksasyondan sonra, atın, formin ve% 70 etanol ile değiştirin.

Kolonlar süresiz olarak% 70 etanolde korunabilir. % 2'lik bir agar çözeltisi yapmak için düşük ısı kullanın ve bir cam plaka üzerinde temiz bir slayt koyun. Sabit kolonu üçe bölün ve kullanılmayan parçaları etanol havuzuna geri koyun.

İki tıraş bıçağı kullanarak bölümleri tek tip bir boyuta kesin. Kolon bölümlerini ve katmanlarını temiz slayttaki agar'a gömün. Bir sonraki iki nokta üst üste için bu işlemi tekrarlayın.

Kesiti, fazla agarı segmentlere ayırın ve gömülü kolonu hematin ve eoin ile işlemek ve boyamak için bir kasete yerleştirin. Şekil bir, kolit ile ilişkili kanser indüksiyonu için protokolü özetlemektedir. Şekil iki, OM ve DSS uygulaması sırasında taban çizgisine göre fare ağırlığını göstermektedir.

Her DSS döngüsünü takip eden haftada, farelerin vücut ağırlıklarının %beş ila %10'unu kaybettiğini unutmayın. Bu deneyde kilo kaybı, kolit şiddeti için vekil bir belirteçtir. Şekil üç, A-O-M-D-S-S tedavisinin 50. gününde müren endoskopisi ile distal kolondaki tümörlerin bir görünümünü göstermektedir.

B ve C panellerinde distal kolonun lümenini tıkayan çoklu polipoid kitlelerin normal kolona kıyasla olduğuna dikkat edin. Panelde, şekil dört, tümörlerin brüt görünümünü gösteren uzunlamasına açılmış bir fare kolonunu göstermektedir. Distal kolondaki daha yüksek tümör yüküne ve çok az tümör büyümesi ile proksimal kolonun karakteristik dokusuna dikkat edin.

Şekil beş, lc ve mavi leke uygulaması ile vurgulanan tümörleri göstermektedir. Boyanın kolonun normal dokusunu ve her bir tümörün sınırlarını nasıl vurguladığına dikkat edin. Bu tür boyama, tümör alanlarının cetvel veya dijital ölçümle hassas ölçümünde yardımcı olabilir.

Şekil altı, bir OM ve DSS ile tedavi edilen fare başına ortalama tümör sayısının temsili dağılımını göstermektedir. Tümörlerin çoğunluğunun distal kolonda bulunduğunu ve iki milimetreden daha küçük olduğunu unutmayın. Şekil yedi, bir kasette kolonun parafine gömülü uzunlamasına bölümlerini ve h ve E leke slaytını göstermektedir.

Artık S ve mavi lekenin h ve e lekesini engellemediğini unutmayın. Slayt görüntüsünde büyük bir tümör daire içine alınmıştır. Atamanın distal, orta ve proksimal kısmı, tüm kolonun çekum ve anüs arasında üçe bölünmesinden kaynaklanır.

Şekil sekiz, distal kolonda OM ve DSS uygulamasından kaynaklanan bir tümörün temsili histolojisini göstermektedir. Gösterilen foto mikrograflar H ve E-B-R-D-U ve beta-katenin ile boyanmıştır ve kolonun insan adenokarsinomlarına benzer displastik değişiklikler göstermektedir. Bu videoda, farelerde inflamasyona bağlı kolonik tümörjenez için tek bir OM enjeksiyonu ve ardından yedi günlük üç DSS döngüsü kullanan bir protokol gösterdik.

10 haftalık bir süre boyunca, bu model, insan koliti ile ilişkili kanserde meydana gelenlere çok benzeyen histolojik ve moleküler değişikliklere sahip tümörleri indükler ve bu hastalıkta onkogenez ve kemoterapi önleme çalışmaları için oldukça değerli bir model sağlar.