Azoxymethane (AOM) ve Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) ile Modelleme Kolit-İlişkili Kanser

Sıfırıncı günde, farelere azoksimetan veya OM enjekte edilir ve takip eden haftada işlem tekrarlanır. İçme suları, dekstran sülfat sodyum veya DSS içeren bir çözelti ile değiştirilir. Üçüncü haftada, farelere sonraki iki hafta boyunca normal su verilir.

Bu DSS su döngüsü iki kez daha tekrarlanır. İkinci DSS döngüsünden sonra, fareler aynalı endoskopi ile tümörler açısından değerlendirilebilir.

10. haftadan sonra fareler sakrifiye edilir ve kolonlar toplanır. Kolonlar yıkanır ve boylamsal olarak açılır. Tümör boyutu ve tümör sayısı açısından kolon değerlendirmeleri yapılır.

Kolonun üçte birlik boyuna kesitleri gömülebilir ve histolojik analiz için gönderilebilir. Işık mikroskopisi kullanılarak tümörler sayılabilir ve sınıflandırılabilir. Genotoksik ajan OM'nin uygulanmasını, ardından üç döngü proinflamatuar ajanın uygulanmasını içeren bir protokol sunuyoruz.

DSS, farelerde insan kolit ilişkili kanserinde görülenlerle morfolojik ve moleküler benzerlikler taşıyan kolon tümörlerini hızlı ve tutarlı bir şekilde oluşturur; sıfırıncı günde fareleri kuyruk işaretleri veya kulak klipleriyle tek tek etiketleyin, her farenin başlangıç ağırlığını bir tabloya kaydedin, ardından her fareye 10 mg/kg çözelti şeklinde bir OM uygulaması enjekte edin. Genotoksik bir ajan olduğu için OM ile çalışırken dikkatli olun; yedinci günde, takip eden hafta boyunca içme suları olarak %2,5'lik DSS çözeltisi sağlayın. Bu çözeltiyi hazırlamak için, DSS tozunu distile suya ekleyin ve çözünene kadar karıştırın.

Çözelti, 0,2 mikron selüloz asetat filtreden geçirildikten sonra hazır hale gelir. Yedi gün boyunca sürekli DSS çözeltisi kaynağı sağlamak için DSS'yi her iki ila üç günde bir değiştirin.

Bu sürenin ardından, kafesleri iki hafta boyunca tekrar suya geri döndürün. Fareleri haftada iki ila üç kez tartın ve rektal kanama ile diyare açısından gözlemleyin. Büyük tümörleri olan farelerde geçici olarak rektal prolapsus gelişebilir, ancak bu durum genellikle hayatta kalma yüzdesini düşürmez.

Bazal değere göre kilo kaybı, kolit şiddetinin sürrogat bir ölçümü olarak kullanılır. Tam bir DSS endoskopisi döngüsünü takip eden haftada, iki ila üç günlük diyare ve rektal kanama ile birlikte %10'a kadar kilo kaybı beklenebilir. Sakrifikasyon öncesinde in vivo tümör büyümesini doğrulamak için ikinci veya üçüncü DSS döngüsü gerçekleştirilebilir.

A-O-M-D-S-S modeli tümör üretimi konusunda oldukça güvenilir olduğundan, bu adım genellikle gerekli değildir. Bu yöntem fare tümörlerini bozma potansiyeline sahip olduğundan, yalnızca birkaç fare bu yöntemle değerlendirilmelidir. Çalışma alanınızda steril fosfat tamponlu salin veya PBS içeren bir beher ile boş bir beher bulunmalıdır.

Kullanılmış PBS'yi uzaklaştırmak için, her kullanımda bir şırıngaya 8 ila 10 mililitre PBS çekip endoskopa takın. İntralüminal içerikleri yıkamak için her fareyi inhale veya enjekte edilebilir sedasyonla anesteziye alın ve fareyi düz bir tahtaya sabitleyin; kuyruk ve göğüs kısımları bantla sabitlenebilir, fare ayak pedleri sıkıştırılabilir. Yeterli sedasyon sağlandığından emin olmak için başparmak ve işaret parmağınızı kullanarak farenin alt karın bölgesini sıkıştırıp anüsü açığa çıkarın ve muren endoskopunu farenin rektumuna ilerletin.

İntralüminal görünümü iyileştirmek ve dışkı içeriğini temizlemek için PBS kullanarak nazikçe şişirme ve irigasyon yapın. Monitörü izlerken endoskopu yavaşça ilerletmeye devam edin. 70. günde kaba tümörlerin varlığı açısından, her bir A-O-M-D-S-S ile tedavi edilen farede çok sayıda kolon tümörü bulunmalı ve değerlendirmeye hazır olmalıdır.

Daha büyük tümörler isteniyorsa, bu aşama haftalarca veya aylarca geciktirilebilir. Gavage iğnesi takılmış, PBS ile doldurulmuş bir şırınga hazırlayın. %10 formalin yüklü bir şırınga, temel cerrahi makaslar ve küt uçlu makaslar.

%1 Ian Blue çözeltisi yüklü küçük bir şırınga ve ince pens hazır bulundurulur. Ayrıca, soğuk bir tepsi, soğutulmuş PBSA içeren bir transfer kabı, kesim için yeni bir jilet ve %10 formaldehit ile doldurulmuş bir fiksasyon havuzu hazırlanır. Her fare, izofloran ve servikal dislokasyon veya kurum tarafından onaylanmış diğer bir yöntemle ötanize edilir. Final ağırlık ve diğer ölçümler yapılabilir.

Bu aşamada, fareyi ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir kesim tahtasına yerleştirin. Tüylerin diseksiyon alanından uzak tutulması için karna %70 ethanol püskürtün. Karın orta hattını tutmak için bir pens kullanın ve peritonyumu açığa çıkarmak için deri üzerinden küçük bir insizyon yapın.

Cildi peritonyumdan ayırmak ve tüm abdominal kaviteyi açığa çıkarmak için hafif traksiyon uygulayın. Peritonyuma bir insizyon yapın ve bu insizyonu her iki tarafta kostal marj boyunca uzatın. İnce bağırsak ve kolonu kenara itmek için kapalı makas kullanın.

Bu işlem, isteğe bağlı olarak toplanabilen mezenterik lenf düğümlerini açığa çıkaracaktır. Değerlendirme için, inen kolon ve rektumu açığa çıkarmak amacıyla genital üriner sistemi aşağıya doğru süpürün; pelvisi daha fazla açığa çıkarmak için gerektiği şekilde mesaneyi ve üreme organlarını eksize edin. Bitişikteki dokulara zarar vermemeye dikkat edin.

Anal rektal bileşkeyi açığa çıkarmak için inferior ve superior pubik rami'leri kesin. Kolonu serbest bırakmak için nazikçe yukarıya doğru traksiyon uygularken anal rektal bileşke etrafındaki cildi kesin. Mezenterik forsepsle kolonun bağlantıları eksize edilebilir veya ayıklanabilir.

Bu bölge sıklıkla displaziden etkilendiği için anoraktaal bileşkedeki derinin bir kısmını korumak önemlidir. Kalın bağırsağı, sekumun hemen proksimalinden ince bağırsaktan ayırın. Beş mililitrelik bir şırıngaya takılı 18 gauge gavage iğnesi kullanarak sekumu komşu kolondan ayırın.

Yuvarlatılmış uçlu makas kullanarak, sıvının fizyolojik yönde çıkmasını sağlayacak şekilde kolon buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Kolonu mezenteri boyunca açın. Açılan kolonu soğuk tepsiye yayın.

Dokunun donmaması için tepsinin yeterince çözündüğünden emin olun. Tümörleri daha iyi görüntülemek için parmağınızla birkaç damla %1'lik Ian Blue uygulayın. Tümör sayısını ve boyutunu bir cetvelle değerlendirin veya dijital analiz için fotoğraflarını çekin.

Tümörün ve bitişikteki normal dokunun küçük kesitleri, RNA, protein veya immünohistokimyasal yöntemlerle gelecekte analiz edilmek üzere bu aşamada çıkarılabilir; kolonun bir kısmı ise histolojik değerlendirme için bırakılmalıdır. Kalan kolon dokusuna, soğuk tabla üzerindeyken şırınga veya parmak yardımıyla %10 formal uygulayın ve dokunun en az 30 saniye boyunca fikslemesine izin verin. Bu işlem, fiksasyon havuzuna aktarımı kolaylaştıracaktır.

Aynı tepside yeni bir açılmış kolon boyamadan önce, kalıntı forminin silindiğinden emin olun. Kolonu %10 formin ile doldurulmuş bir kaba aktarın ve kenarlarından iğneleyin. Üç saatlik fiksasyondan sonra, formini dökün ve yerine %70 ethanol ekleyin.

Kolonlar %70 etanol içinde süresiz olarak saklanabilir. %2 agar çözeltisi hazırlamak için düşük ısı kullanın ve cam bir plaka üzerinde temiz bir lam hazırlayıp kenara ayırın. Sabitlenmiş kolonu üç parçaya bölün ve kullanılmayan parçaları etanol havuzuna geri koyun.

İki jilet kullanarak bölümleri tek tip boyuta getirin. Kolon bölümlerini ve katmanlarını temiz lam üzerindeki agara gömün. Bu işlemi bir sonraki kolon için tekrarlayın.

Segmenti kesin, fazla agarı uzaklaştırın ve gömülü kolon parçasını işleme ile hematoksilin ve eozin ile boyama için bir kasete yerleştirin. Şekil bir, kolitle ilişkili kanser indüksiyonu protokolünü özetlemektedir. Şekil iki, OM ve DSS uygulaması sırasında fare ağırlığının başlangıç değerine göre değişimini göstermektedir.

Her bir DSS döngüsünü takip eden hafta boyunca farelerin vücut ağırlıklarının %5 ila %10 oranında azaldığına dikkat edin. Bu deneydeki kilo kaybı, kolit şiddeti için yedek bir belirteçtir. Şekil üç, A-O-M-D-S-S tedavisinin 50. gününde muren endoskopisi yoluyla distal kolondaki tümörlerin görünümünü göstermektedir.

B ve C panellerinde, normal kolonla karşılaştırıldığında distal kolon lümenini tıkayan çok sayıda polipoid kütleye dikkat ediniz. Şekil dört'ün a panelinde, tümörlerin genel görünümünü gösteren, boylamasına açılmış bir fare kolonu görülmektedir. Distal kolondaki daha yüksek tümör yüküne ve az tümör büyümesiyle birlikte proksimal kolonun karakteristik dokusuna dikkat ediniz.

Şekil beş, lc ve mavi boyama uygulanarak belirginleştirilmiş tümörleri göstermektedir. Boyanın, her bir tümörün sınırlarının yanı sıra kolonun normal dokusunu nasıl vurguladığına dikkat edin. Bu tür bir boyama, tümör alanlarının cetvel veya dijital ölçüm ile hassas bir şekilde ölçülmesinde yardımcı olabilir.

Şekil altı, OM ve DSS ile tedavi edilen fare başına ortalama tümör sayısının temsili dağılımını göstermektedir. Tümörlerin çoğunluğunun distal kolonda yer aldığına ve boyutlarının iki milimetreden küçük olduğuna dikkat ediniz. Şekil yedi, bir kaset içindeki kolonun parafin gömülü boylamasına kesitlerini ve H&E boyama lamını göstermektedir.

Kalıntı S ve mavi boyanın h ve e boyamasını etkilemediğine dikkat edin. Slayt görüntüsünde büyük bir tümör daire içine alınmıştır. Distal, orta ve proksimal tanımlamaları, tüm kolonun sekum ve anüs arasında üçte bir oranında kesilmesinden kaynaklanmaktadır.

Şekil sekiz, distal kolonda OM ve DSS uygulaması sonucunda oluşan bir tümörün temsili histolojisini göstermektedir. Gösterilen fotomikrograflar H ve E-B-R-D-U ile beta-catenin ile boyanmıştır ve insan kolon adenokarsinomlarına benzer displastik değişiklikleri göstermektedir. Bu videoda, tek bir OM enjeksiyonunu takip eden üç adet yedi günlük DSS döngüsü kullanarak, farelerde inflamasyon kaynaklı kolonik tümorigenez için bir protokol sunduk.

Bu model, 10 haftalık bir süre boyunca, insan kolit ilişkili kanserinde meydana gelenlere çok benzeyen histolojik ve moleküler değişikliklere sahip tümörler oluşturur ve bu hastalıkta onkogenez ile kemopreventif çalışmalar için oldukça değerli bir model sunar.