Bir Lollipop-Like Ultrafiltrasyon Probe Kullanımı İnsan Yerli Tükürük Peptidome Örnekleme: Klinik Kütle Spektrometresi için Peptid Algılama basitleştirin ve geliştirin

Tükürük peptidlerini inceleyen bu çalışmada, lolipopa benzer bir ultrafiltrasyon probu ve ardından doğrudan nano lc LT Q kütle spektrometrisi analizi kullanılmıştır. İlk olarak, bir polieter sülfon membran ve bir etilen propilen tüp kullanarak LLUF probunu monte edin. Ardından, gönüllülerden tükürük örnekleri toplayın ve tükürükten örnekleme yapmak için bunları LLUF probu aracılığıyla işleyin.

Ardından, doğrudan nano L-C-L-T-Q kütle spektrometrisine geçin ve LLUF prob işlemi uygulanmış ve uygulanmamış tükürük örneklerinden elde edilen verileri analiz edin. Nihayetinde, L-C-M-S-S verileri analiz edilip tanımlanan peptitler iki örnek arasında karşılaştırılarak tükürük peptitleri elde edilebilir. Lolipop benzeri bir ultrafiltrasyon probunun doğrudan nano lc LTQ kütle spektrometrisi analiziyle birleştirildiği bu yaklaşım, tükürük proteinlerinin peptitlere sindirilmesi gibi diğer yöntemlere göre temel avantajlar sunar.

Kütle spektrometrisi analizini takiben, LUF PRO tükürüğü basitleştirip temizler ve klinik uygulama için tüm tükürükteki peptidlerin MS tespitini artırır. Epoksi yapıştırıcı kullanarak polieter hücre telefonu membranlarını üçgen polipropilen küreklerin kenarlarına mühürleyin. Ardından, bir Teflon florlanmış etilen propilen tüpü üçgenin bir silindir çıkışına takın.

Polipropilen kürekler; uygun sızdırmazlığı değerlendirmek için probları %70 alkol ile gece boyunca sterilize edin, LLUF problarını iki saat boyunca 50 mg/mL mavi dekstran çözeltisine daldırın. Toplanan örneklerde mavi dekstran bulunmadığını doğrulayın.

20 ila 40 yaş arası sağlıklı gönüllüler belirleyin. Su ile ağız çalkalamasından sonra, denekten tüm tükürük örneklerini buzla soğutulmuş bir kaba tükürmesini isteyin. Tüm örnekleri birleştirin ve buz üzerinde saklayın.

Toplamanın hemen ardından, LLUF probları ile örnekleme yapmak üzere 200 µL tükürükle birlikte 4 °C'lik bir odaya geçiniz. Şimdi, bir kültür kabı içindeki insan tükürüğüne polieter hücre membranını daldırınız. Tükürükten örnekleme için bir ultrafiltrasyon sürecini simüle etmek amacıyla, bir şırıngayı geri çekerek negatif basınç oluşturunuz.

Ardından, protein konsantrasyonlarını belirleyin. Nano LC kütle spektrometresi analizi için tükürük protein örneklerini mikrolitre başına bir mikrogram olacak şekilde hazırlayın. Örnek analizi için, bir Finnegan LTQ kütle spektrometresine çevrimiçi olarak bağlı bir Exigent nano LC kullanıyoruz. İlk olarak, sindirilmemiş tükürük örneklerinden beş mikrolitreyi otomatik örnekleyici aracılığıyla nano LC sisteminin tuzak kolonuna yükleyin.

Yıkama adımından sonra valfi değiştirin ve tuzağa ile C 18 ayırma kolonuna %0'dan %50'ye lineer bir tampon B gradyanı uygulayın. Excalibur'un veri bağımlı modunu kullanarak, 1 × 10⁴ yoğunluğun üzerindeki en güçlü dört MS iyonunun ms ms spektrumlarını toplayın. Her örnek için, üç farklı ayrı hazırlığın çift tekrarlı analizlerini gerçekleştirin.

Ardından, veri dosyasını Sequester Sorcerer 2 sistemine aktarın ve enzim spesifitesi kullanmadan uygun bir insan NCBI protein veri tabanına karşı arama yapmayı seçin. Sequester araması tamamlandıktan sonra sonuçlar otomatik olarak filtrelenir, doğrulanır ve Sequester sonuçlarına dayanarak peptid profili ile protein profilinde görüntülenir. Peptid profili, bir peptid atamasının yanlış olma ihtimaline karşı doğru olma ihtimalini gösteren kapsamlı bir olasılık P skorunu tahmin eder ve ayrıca her bir peptid dizisi hakkında ek bilgiler tanımlar.

Protein profit, Ms.Ms spektralarına atanan peptitlere dayanarak her bir protein için sıfırdan bire kadar bir olasılık puanı hesaplar. Bu bölüm, bakteriyel tespit kültürü için LLUF problarının oral bakterileri temizleme kapasitesini belirler; aerobik bakteri testi için LLUF prob toplamı öncesi ve sonrası tükürük örnekleri agar plaklara ekilir. Bir gün boyunca 37 °C'de antibiyotiksiz LB agar plaklar kullanın ve anaerobik bakteriler için kültürleme işleminde gaz paketi kullanın.

Numuneler, anaerobik koşullar altında 37 °C'de bir gün boyunca BHI besiyeri ve agar plaklarında inkübe edilir. Lolipopa benzeyen ultrafiltrasyon cihazlarının üretimi, taklit edilmiş bir ağız ortamında tükürük örneklemesini kolaylaştırır. Bu sistemde, 30 kilodalton moleküler ağırlık kesme noktasına sahip negatif yüklü bir polietersülfon membran, bir polipropilen küreğe yapıştırılmış ve tükürükteki daha büyük proteinleri filtrelemek için LLUF probunun önüne yerleştirilmiştir.

İnsan ağız ortamını taklit etmek için, bir şırınga kullanılarak bir sünger tükürüğe emdirilir. Tükürük, bağlı olan tüp aracılığıyla filtrelenir ve toplanır. LLUF örneklemesi öncesi ve sonrası tükürük LC kromatogramlarının karşılaştırılması, nano L-C-L-T-Q kütle spektrometrisi ile yerli tükürük peptidlerinin tanımlanmasını sağlamıştır.

Bu diferansiyel kromatogramlar kimyasal veya enzimatik sindirim olmadan elde edildiği için klinik amaçlı numune hazırlama sürecini basitleştirirler. Bu numunede, farklı protein kompozisyonlarının LLUF ile açıklığa kavuşturulmasının ardından, sindirilmemiş tükürükte 131 peptit tanımlanmıştır.

Bu peptitler, çeşitli prolin bakımından zengin proteinlerden türetilen fragmanlardır. Aktin alfa amilaz alfa bir globin beta globin, his sustain bir keratin, bir müsin yedi polimerik immünoglobulin reseptörü serin ve S 100. LLUF probları ile filtreleme sonrası tükürükte tanımlanan 9 26 benzersiz peptit, temel olarak çeşitli prolin bakımından zengin proteinlerden türetilen fragmanlardır.

Alfa amilazdan türetilen bu peptit, LLUF probları ile toplama yapılmayan bir tükürük örneğinde münhasıran tespit edilmiş olup, bu durum LLUF problarının büyük proteinleri uzaklaştırma kapasitesini kanıtlamaktadır. En dikkat çekici olanı ise, daha büyük proteinler uzaklaştırıldıktan sonra LLUF probu ile örneklenen tükürükte birkaç sekans peptidi tespit edilebilmiş; özellikle ultrafiltrasyon LLUF probları sonrası örneklerde prolin açısından zengin C-terminallere sahip peptitler tanımlanmıştır. Artık kütle spektrometrisi için basit tükürük örneklerinde A-L-L-L-L-U-F PRO'nun nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Tutarlı koşullar altında basit tükürük örnekleri toplamak için daha iyi bir analiz süreci oldukça önemlidir. Bu tekniğe hakim olunduğunda, işlemin üç saat içinde uygun şekilde gerçekleştirilebileceğine inanıyorum. Lolipop benzeri ultrafiltrasyon probunun doğrudan nano L-C-L-T-Q-M-S ile birleştirildiği bu yaklaşım, insan hastalıklarının teşhisinde biyobelirteçlerin klinik uygulamalarını kolaylaştıran spektrum zincir analizine olanak tanır.