Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Bu prosedürün genel amacı, DNA vektör tabanlı RNA interferansı kullanımı yoluyla gen fonksiyonunu belirlemektir. Bu işlem, öncelikle spesifik genleri hedefleyen S-H-R-N-A konstrüktlarının tasarlanması ve üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, SH RNA ekspresyon kasetini taşıyan lentivirüs üretmektir.

Ardından, hücreler lentivirüs ile enfekte edilerek stabil hücre hatları oluşturulur ve lentivirüsle enfekte edilmiş bu hücreler, ilgilenilen genin susturulmasının etkilerini belirlemek amacıyla çeşitli in vitro ve in vivo analizlerde kullanılır. Nihayetinde, kullanılan analizlere bağlı olarak sonuçlar; in vitro proliferasyon, migrasyon ve invazyon analizlerinin yanı sıra in vivo zenograft oluşum modelleri aracılığıyla, gen nakavtunun bir sonucu olarak hücrelerin tümörjenisitesindeki değişiklikleri gösterebilir. Prosedürü uygulamayı gösterecek kişiler Daniel Stowell ve ma Juan olacaktır; Daniel laboratuvarımda lisansüstü öğrencidir, Ma ise teknisyendir.

Chang bir doktora sonrası araştırmacıdır. Bu yöntem, belirli bir genin kanser gelişimi ve ilerlemesinde rol oynayıp oynamadığı ve bu süreçlerin hangi yönleri için önemli olabileceği gibi kanser araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Tasarıma başlamak için, hedef gendeki 20 ila 23 nükleotidlik hedef diziyi içeren iki ters tamamlayıcı oligonükleotidi tanımlanan kriterlere göre tasarlayın ve sipariş edin.

İki uçta eco R one ve Hindi three bölgeleri oluşturacaklar. Tavlanmış olduktan sonra, hedef diziye ters tamamlayıcı bir dizi içeren başka bir oligo, bir yukarı akış primerle birlikte H one veya U six promotörünün üç prime ucuna bağlanır.

Her iki ucunda BAM H one ve Hindi three bölgeleri bulunan bir fragman oluşturmak için PCR kullanın. Bu sırada lentivirüs vektörünü ve PCR fragmanını sindirin. Ardından vektör, PCR fragmanı ve Anil oligo nükleotidleri arasında üçlü fragman ligasyon reaksiyonunu gerçekleştirin.

1:10:10 molar oranında, sonuç vektörü, loop bölgesinde Hindi three dizisine sahip ilgili hRNA'yı üretecektir. Eğer indüklenebilir bir vektör kullanılırsa, hRNA üretimi Tet on sistemi için doksisiklin gibi bir indükleyici molekülün varlığına bağlı olacaktır. Şimdi, ligasyon ürünü ile yüksek verimli, kompetan E. coli DH5α hücrelerini transforme edin ve koloni bazlı PCR taraması kullanarak pozitif vektörleri belirleyin.

Vektörü ve indüklenebilir promotör ligasyon bölgesini kapsayan bir ürünü amplifiye edin. Ticari bir kit kullanarak pozitif kolonilerden plazmid DNA'sı hazırlayın. Ardından, insertin varlığını BAM H1 ve ECO R1 sindirimi ve DNA agaroz elektroforezi ile doğrulayın.

Ek olarak, promotörü ve S-H-R-N-A'yı içeren bölgeyi LIGA nükleotid P beş kullanarak dizileyin. Endotoksin içermeyen bir MIDI veya maxi prep kiti kullanarak, HRNA ekspresyon kasetini taşıyan lentivirüs DNA'sını hazırlayın. 260 nanometredeki ışık absorbsiyonunu ölçerek DNA konsantrasyonunu belirleyin ve 260'a 280 nanometre ışık absorbsiyon oranının 1,8 ile 2,0 arasında olduğunu kontrol ederek DNA'nın saflığından emin olun.

Son olarak, S şeklinde kıvrıldığından emin olmak için lentivirüs plazmidini bir aero jel üzerinde çalıştırın. Transfeksyon öncesinde, bir pipetle çözelti B'den hava kabarcıkları çıkarırken, önce 0,9 mililitre çözelti A'yı 0,9 mililitre çözelti B'nin içine yavaşça damlatarak transfeksiyon hazırlığını yapın. Ardından, karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, karışımın 0,6 mililitresini HEK 2 93 T hücreleri içeren üç farklı 10 santimetrelik plaka üzerine yavaşça damlatın.

Ardından hücreleri dört ila altı saat sonra inkübatöre geri koyun. Besiyerini yedi mililitre komple DMEM besiyeri ile değiştirin. 24 saat sonra beş mililitre daha besiyeri ekleyin ve bir 24 saat daha bekledikten sonra lentivirus içeren besiyerini toplayın.

Hasat edilen medyumu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 RPM ile santrifüj edin. Süpernatantı 0,45 mikrometrelik bir filtre kullanarak süzün. Lentivirüs içeren süzüntü medyumu ultra santrifüj ile santrifüj edin.

Süpernatantı %5'lik çamaşır suyu içeren bir atık kabına boşaltın. Lentivirüs peletini yarım ila bir mililitre soğuk 1X PBS içinde yeniden süspande edin. Ardından lentivirüs solüsyonunu, -80 °C'de saklamak üzere 50 ila 100 mikrolitrelik alikotlara bölün.

Son olarak, güvenilir bir teknik kullanarak lentivirüs titresi belirlenir. Genellikle, hücre enfeksiyonuna geçmeden önce 10 santimetrelik bir kültür kabı 50 ila 100 milyon enfeksiyöz birim üretir. Bu prosedür için bir kit veya R-T-P-C-R kullanarak lentiviral titrenin MOI değeri belirlenir.

Dört'ten düşük bir MOI önerilir. Enfekte edilecek hücreleri, altı kuyucuklu bir plakada %30 ila %40 konfluense ulaşacak şekilde ekerek başlayın ve gece boyunca kültüre edin. Ertesi gün.

Besiyerini, poly brain veya protamin içeren bir mililitre taze besiyeri ile değiştirin. Ardından, floresan veya bir antibiyotik belirteci içeren bir ila 2 milyon iu lentivirüs ekleyin.

Karıştırmak için plakayı 10 saniye boyunca yavaşça sallayın ve altı saat boyunca inkübe edin. Altı saatin sonunda, besiyerini normal, tam besiyeri ile değiştirin ve hücreleri iki gün boyunca çoğaltın. Kullanılan lentivirüse bakılmaksızın, iki gün sonraki besiyerleri antibiyotik veya indükleyici içermemelidir.

Lentivirüs bir antibiyotik markörü içeriyorsa uygun antibiyotiği ekleyin. Benzer şekilde, lentivirüs indüklenebilir ise kültürlerin yarısına indükleyici ekleyin. Hücreleri antibiyotikler ve indükleyicilerle iki veya üç gün daha kültüre aldıktan sonra, ksenogreft tripsinleme öncesinde hedef genin knockdown durumunu test etmek için western blot analizi gerçekleştirin.

Hücreleri büyük hücre kültürü kaplarından alın ve %50 matrigel içeren orijinal besiyerinde yeniden süspanse edin. Kanser hücresi süspansiyonunun, %50 matrigelin ve şırınganın buz üzerinde tutulması esastır. Aksi takdirde, matrigelin katılaşma riski vardır ve enfeksiyon buna göre düzenlenmelidir.

Cerrahi bölgeyi %70 ethanol ile iyice temizleyerek hazırlayın ve anesteziyi, mükemmel havalandırma ile indüksiyon haznesine bağlı bir izofluran tutucu filtre eşliğinde gerçekleştirin. Hücre inokülasyonundan üç ila beş dakika önce, timik nude fareyi %1,5 oksijen ile karıştırılmış %2 izofluran kullanarak anestezi altına alın. Ardından, bir burun konisi aracılığıyla oksijen ile karıştırılmış %2 izofluran kullanarak anesteziyi sürdürün.

Fareyi 30 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma pedinin üzerine yerleştirin. Hücreleri, deri altı enjeksiyonlar için 25,5 gauge veya ortotopik enjeksiyonlar için 28 ila 30 gauge iğneli şırıngalara doldurun. Anestezinin indüksiyonundan beş dakika sonra, bir veya iki bölgeye 200 µL'lik boluslar halinde 1 ila 10 milyon hücre enjekte edin.

Hücre sayısı, kanser hücrelerinin malignitesine veya agresifliğine bağlıdır. Konstitütif olarak aktif vektörler için, hedef gen S-H-R-N-A veya vektörler üzerinde scrambled S-H-R-N-A eksprese eden hücrelerin enjekte edildiği iki grup fare kullanın. Aynı iki grubu kullanın ve her birini, sularına indükleyici eklenen veya eklenmeyen alt gruplara ayırın.

Suları içeren kapları haftada iki kez değiştirin. Tümör hacmini haftalık veya iki haftada bir kumpas ile izleyin. Tümör hacminin kurumsal veya ACUC limitini aşmadığından emin olun; yaygın ülserasyon, nekroz, belirgin enfeksiyon, kontrol edilemeyen kanama veya son evre hastalık gösteren hayvanları ötanazi ile uyutun. Biyolüminesans bir marker aracılığıyla tümör büyümesini ve metastazı izlemek için çalışma alanını dezenfekte edin ve fareleri gazlı anestezi ile bir görüntüleme odasında anesteziye alın.

Öncelikle, iki ila beş dakikalık bir pozlama yapın, sinyal yoğunluğunu kontrol edin ve ardından uygun şekilde ayarlayın. Tümör boyutu 1000 kübik milimetreyi veya kurumun belirlediği boyut sınırını aşarsa, sakrifikasyon sırasında hayvanı ötanize edin, tümör boyutunu belgeleyin ve ileri analizler için tümörleri saklayın. Bu protokol, atimik nude farelere implante edilen lusiferaz ekspres eden insan meme adenokarsinoma hücrelerinin ksenogreft tümör oluşumu üzerinde why Y one nakavtının etkilerini incelemek için kullanılmıştır.

İnsan YY1'in S-H-R-N-A hedef dizisi ve bilinen herhangi bir insan transkripti ile önemli bir benzerliği olmayan randomize bir kontrol S-H-R-N-A test edildi. Sonuç olarak, iki lentiviral vektörle oluşturuldu ve iki lentivirüs üretmek için kullanıldı. Her ikisi de iki farklı hücre popülasyonunu enfekte etmek için kullanıldı ve poliklonal hücre popülasyonları elde edildi.

Mycin seçimi sonrası yapılan Western blot analizi, enfekte edilmiş bu hücre hatlarında DS ile indüklenen YY one nakavt işlemini doğrulamıştır. Ardından, indüklenebilir YY one S-H-R-N-A ve kontrol S-H-R-N-A ile enfekte edilmiş klon üçün poliklonal hücre popülasyonu kullanılmıştır.

YY one eksikliğinin invazyon üzerindeki etkilerini test etmek için LENTIVİRÜSLER kullanılmıştır. YY one eksikliğinin hücrelerin invaziv yeteneğini azalttığını gözlemledik. Western blot analizi, indu YY one S-H-R-N-A ile hücrelerde YY one susturulmasının tetiklendiğini, kontrol içeren hücrelerde ise durumun farklı olduğunu doğrulamıştır.

S-H-R-N-A bu etkiyi göstermemiştir. Bu hücreler daha sonra, kontrol gruplarıyla karşılaştırmalı bir zenograft fare modeli çalışmasında kullanılmıştır; dos içeren su ile beslenen S-H-R-N-A implante edilmiş farelerde, biyolüminesans ile görüntüleme yapıldığında ve beklenildiği üzere tümör ağırlıkları ölçüldüğünde, tümör oluşumunun önemli ölçüde azaldığı görülmüştür. Bu zenograft tümörlerde YY bir susturulması, western blot ile kolayca doğrulanmıştır.

Çalışmalar: Lentivirüsle çalışmanın, lentiviral vektörlerle yapılan araştırmalar için NIHB güvenlik değerlendirmelerine göre son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; tüm laboratuvar ortamları için geliştirilmiş B güvenlik seviyesi iki muhafaza prosedürleri gereklidir.