Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu protokolü yürütmek için üç saat ayırın. Deneyimli olduğunuzda, bu protokolün tamamlanması diseke edilen embriyo sayısına bağlı olarak bir buçuk ila iki saat arasında sürmelidir. Bu protokol, orta otik plak kodunda kesilen cort embriyosundan 9.5 gün sonra nasıl alınacağını ve vagal nöral tüpü içeren dokuyu izole etmek için dört olabileceğini açıklar. Kesim.

Bu nedenle, akar 16 ve 22, gövde nöral tüpünü içeren dokuyu izole edecektir. Vagal nöral krest, vagal nöral tüpten göç eder. Gövde nöral krest, gövde nöral tüpünden göç ederken, diseke edilen doku bir kollajenaz dis çözeltisinde enzimatik olarak sindirilecek, boşluk yıkanacak ve nöral olmayan epiderm ve mezoderm diseke edilecektir.

İzole edilen nöral tüp iki kez daha yıkanacak ve daha sonra kendini yenileyen ortamda kaplanacaktır. Ben Vanderbilt Üniversitesi'ndeki Bosky Laboratuvarı'ndan Elise Graph. Bugün explan kültüründe nöral krestin nöral tüpten nasıl izole edileceğini göstereceğim.

Bu teknik, nöral krestin özelliklerini in vitro olarak incelemenize izin verecektir. Başlayalım. Mil fibronektin başına 100 mikrolitre bir mg'ı 3.2 mililitre steril DPBS'ye seyrelterek başlayın.

Dört oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun dibini kaplayacak şekilde mililitre fibronektin çözeltisi başına 30 mikrogramdan yeterli miktarda yerleştirin. Her kuyunun eşit şekilde kaplandığından emin olmak için dört kuyulu plakanın köşelerine hafifçe vurun. Medyanızı hazırlarken ve filtrelerken plakayı bir kenara bırakın.

Plaka en az 15 dakika bekletilmelidir. Medyanızı hazırlamak için aşağıdaki reaktifleri toplayın. Medya, kullanılmadan önce taze bir biyogüvenlik kabininde hazırlanır.

Her zaman steril teknik kullandığınızdan emin olun. Elyaf nin'i dört kuyulu tabaktan çıkarın ve davlumbazın arkasındaki kapak kapalı olarak kurumasını bekleyin. Elyafın kuruması yaklaşık 15 dakika sürer.

Plaka kuruduktan sonra, her birine 500 mikrolitre kendi kendini yenileyen ortam ekleyin. Diseksiyona başlamadan hemen önce 37 derecelik plakayı nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin, 50 mikrolitre kollajenaz disk alanını beş mililitre DPBS'ye karıştırın. Etkili bir sindirim sağlamak için tüm kollajenaz dispasını eklediğinizden emin olun.

Kollajenaz dispa solüsyonunu 12 oyuklu bir plakanın üç kuyusuna filtrelemek için 0.2 mikronluk bir şırınga filtresi kullanın. Her kuyucuk beş mililitrelik çözeltinin üçte birini almalıdır: Kalan oyukların her birine yaklaşık bir mililitre yıkama ortamı pipetleyin. İzole edilmiş dokunuzu sindirmeye hazır olana kadar plakayı buzun üzerine yerleştirin.

Ardından, steril bir tıraş bıçağıyla eğimli kenarın hemen altındaki P 20 pipet ucunun ucunu kesin. Ucu yıkama ortamına batırın, böylece embriyolar ve izole edilmiş doku parçaları. Solüsyonlar arasında aktarılırken uçlara yapışmayın.

Zamanlanmış bir çiftleşmeden bir P 1000'in ucuna da aynısını yapın. Rahmi barajdan çıkarın. Diseksiyonu steril DPBS'de tamamlayın.

Diseksiyon aletlerinizi ısı sterilizasyonu gibi herhangi bir yöntemle sterilize edin. DPBS bulanıklaşırsa, P 1000 kesimi ile embriyoyu kesilen dokudan başlayarak taze bir steril DPBS kabına taşıyın. Rahim dokusunu desiduadan nazikçe uzaklaştırın.

Ardından, embriyoyu desidua içinden yavaşça çıkarın. Embriyonun yeri burada bir çizgi film ile belirtilmiştir. Doğum sonrası embriyodan 9.5 gün sonra izole ettikten sonra, yumurta sarısı torbasını insülin iğneleri ile nazikçe çıkarın.

Genotipleme protokolünüzün gerekli bir parçasıysa, yumurta sarısı torbasını ve kalan embriyonik dokuyu temiz, steril DPBS'de yıkayın. Dokuyu 1.5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve DNA'yı izole etmeye hazır olana kadar tüpü eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kendinizi embriyonun anatomisine yönlendirin.

SOMITES dört, 16 ve 22'de orta OTIC PLA kodunu keseceksiniz. Somitleri saymak için mikroskobunuzun odağını ayarlamanız gerekecektir. Orta Otic PLA kodunda ilk kesimi yapın.

Nöral tüpün geri kalanına zarar vermeden iğneleri makas bıçakları gibi kullanın. Dört akar yaptıktan sonra ikinci kesimi yapın. Daha sonra 15 akarı kesin ve hemen ardından kesin.

Son kesimi yapın Sonra akar 22 veya sonuncusu, bu yüzden akar. Embriyo gelişimsel olarak daha erken ise. Bu doku, vagal nöral tüpü içeren dokuyu izole etmek için gövde nöral tüpünü içerir.

Kalbi, orta otik plato ile dördüncü akar arasındaki dokudan kesin. İzole edilmiş doku parçaları arasındaki boyut farkına dikkat edin. Vagal nöral tüpü içeren parça diğerine göre daha geniştir.

Bu fiziksel ayrım, iki parçayı birlikte işlemenizi sağlar. Nöral tüpü kollajenaz dis boşluğuna aktarmak için P 20 kesmeyi kullanın. Kalan doku genotipleme için saklanabilir.

Daha önce belirtildiği gibi, izole edilmiş doku parçalarını kollajenaz dis boşluğu olan oyuklardan birine yerleştirin. Şimdi oda sıcaklığında. 10 dakika bekletin.

10 dakikalık inkübasyon sırasında, bir sonraki embriyoyu incelemeye başlayabilirsiniz. 10 dakika sonra, izole edilen dokuyu kollajenaz boşluğundan çıkarın ve yıkama ortamında yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın, sindirilmiş dokuyu DPBS'ye yerleştirin. Sindirimden sonra dokunun nasıl görünmesi gerektiği budur.

Bir sonraki adım, nöral olmayan derm ve mezodermin çıkarılmasını içerir. İlk olarak, nöral olmayan derm nöral tüpten kaldırılır. Daha sonra, mezoderm nöral tüpten çıkarılabilir.

Nöral olmayan derm ve mezodermin çıkarılmasını göstermek için vagal nöral tüpe odaklanacağız. Aynı işlem gövde nöral tüpü ile de yapılabilir. Nöral olmayan dokuyu bir iğne ile tutarak başlayın.

Nöral olmayan dermi nazikçe çıkarmak için diğerini kullanın. Daha sonra, herhangi bir nöral olmayan dokunun kalıntılarını çıkarmak için nöral tüpe bitişik somitleri nazikçe çıkarın. Kesme P 20 pipet ucuyla hafifçe yineleyin.

Nöral tüpü Yıkama ortamı ile iki kez yıkayın. Nöral tüpü kendini yenileme ortamına yerleştirin ve ardından hazırlanmış bir dörde yerleştirin. İyi yemek.

Dört kuyucuklu plakayı bir hipoksi odasına koyun. Haznenin sızdırmaz olduğundan emin olun. Bir oksijen analizörü takın Ve karışık gaz kaynağını açın.

%1 oksijen, %6 karbondioksit ve %93 nitrojen karışımı kullanın. Hipoksi odasını %3 oksijene ulaşana kadar şarj edin. Karışık gazı kapatın ve hipoksi odasını 37 santigrat dereceye yerleştirin.

24 saat sonra. Nöral tüp açıklamasına bakın. Nöral krest hücreleri, bir insülin iğnesi ile nöral tüpün dışından kesilen nöral krest olmayan doku ile kontaminasyonu önlemek için düz çizgi ile özetlenen nöral tüpten göç etmiş olmalıdır.

Ardından, nöral tüpü explan'dan ve kalan nöral olmayan krest hücrelerinden çıkarın. Ortamı yeni kendini yenileme ortamıyla değiştirin ve plakaları hipoksi odasına geri koyun. Şarj edin ve 37 Santigrat Dereceye yerleştirin.

Kültürde 24 saat sonra, nöral krest nöral tüpten uzaklaşacaktır. Büyümenin kapsamı kesikli bir çizgi ile gösterilir. Oklarla vurgulanan bu nöral krest büyümesi yaklaşık% 96 saftır ve hücreler P 75, SOX 10 ve Fox D üçünü eksprese eder.

Bu kültürlenmiş kret hücreleri ile yapılabilecek deneyler aşağıdakileri içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Bazen daha az ideal kültürler, bu meydana gelirse verimli büyümeler sağlamayacaktır. Hipoksik koşulları, fibronektin konsantrasyonlarını ve dokunun kollajenaz DYS Space'te sindirildiği süreyi iki kez kontrol edin Bugün nöral krestin nöral tüpten kültürlenmesinin arkasındaki temelleri gösterdim.

Deneylerinizde iyi şanslar.