Name: Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Öğrenin, embriyonik fare nöral tüplerinden sinirsel crest hücrelerini izole etme ve kültürleme yöntemini. Bu protokol, FACS veya besleyici katman gerektirmeden %96 saflıkta premigratuvar hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz video yardım için Marc Wozniak kabul etmek istiyorum. Biz de kültür sıçan NK hücreleri için orijinal protokol için UT Southwestern az Sean Morrison kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Akademik Destek Programı desteklenen ve NIH (HD36720 ve HD036720-11S109) ve PAL için AHA 11GRNT7690040, NAM için AHA (0615209B) ve NIH (NS065604) den predoctoral burslar, ve ERP gelen hibelerle oldu Bir NIH eğitim bursu T32HD007502 tarafından desteklenmektedir.

1. Hazırlanması Tabaklar <ol><li> Her zaman steril tekniği kullanın. </li><li> Dulbecco PBS (DPBS) içerisinde 3.3 mL &#39;lik bir son hacim içine insan plazmasından FN stoğu 100 uL seyreltilmesiyle fibronektin (FN) hazırlayın. Nihai konsantrasyon 30 ug / mL &#39;dir ve bu 1 hafta süreyle 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> FN çözümü ile steril doku kültürü dört sıra plakanın her alt örtün ve 15 dakika bekletin. Tüm yüzeyi kaplı olduğundan emin olun. Bu kez (2. ve 3. adımları) sırasında ortam olun. </li><li> Çözüm FN ve plakaları kurumasını bekleyin çıkarın. Yavaşça 500 uL DMEM, kaldır DMEM ile kuyu durulayın, ve Öz-Yenileme 500 uL (SR), orta (aşağıya bakınız) ekleyin. CO2 5 oranında içeren nemlendirilmiş inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Plakalar kullanımdan önce kuru olacak şekilde Diseksiyon önce yaklaşık bir saat tamamlar. </li></ol> 2. SR Orta hazırlanması <ol><li> Vagal ve gövde NC kültürü içinon embriyolar (yaklaşık bir kumu, fare hattı genetik arka plan bağlı olarak), SR orta 25 mL hazırlamak. 12,5 mL, düşük glukoz DMEM, 7.5 mL Neurobasal Orta, 25 uL retinoik asit (117 uM son konsantrasyon) ve 25 ul 2-mercaptoethanol (50 mM nihai konsantrasyon) birleştirir. İyice karıştırın. </li><li> 3.75 ml Civciv Embriyo Özü, 250 uL N 2 tuz takviyesi, 500 uL B27 takviyesi ve 250 uL penisilin streptomisin (% 1 final konsantrasyon) ekleyin. 0.22 um bir filtreden orta filtre. </li><li> 10 uL steril IGF1 (20 ug / mL son konsantrasyon) ve 20 ul steril bFGF (20 ug / mL son konsantrasyon) eklenir. Tersine çevirerek karıştırın. 4 ° C&#39;de depolamak </li></ol> 3. Yıkama Orta hazırlanması <ol><li> Için yaklaşık 10 embriyo yıkama orta 50 ml hazırlamak. 35 mL düşük glikoz DMEM, 15 mL Neurobasal Orta ve 500 uL penisilin streptomisin (% 1 final konsantrasyon) ile 50 mg BSA birleştirin. 0.22 ile Steril filtremikron filtre. </li></ol> 4. Kollajenaz / dispase hazırlanması <ol><li> 100 mg / mL kollajenaz / dispase için 5 mL DPBS 50 uL ekleyin. İyice karıştırın. </li><li> 0.2 um bir şırınga ile filtre on iki iyi plaka üç kuyu her birine 1.5 mL filtre ve ekleyin. Kalan kuyulara pipetle yaklaşık 1 ml yıkama ortamı. Disseke doku sindirmek için hazır olana kadar buz üzerinde tüm plaka saklayın. </li><li> Steril bir jilet ile P20 ve P1000 pipet filtre ucu ipuçları kesin. Sadece ucu eğimli kenar aşağıda kesin. P1000 cut off P20 izole doku parçalarını aktarmak için kullanılacak ise tüm embriyo transfer etmek için kullanılacaktır. </li></ol> 5.. 9.5 DPC Embriyolar gelen vagal ve Trunk Nöral Tüp Ayırma <ol><li> Zamanlanmış gebelikler için, vajinal fişi ile baraj sabah fişi görülmektedir öğle saatlerinde 0.5 DPC kabul edilir. 9.5 DPC de rahim kurban ve kaldırın. </li><li> Uterustan desidua kaldırın ve yavaşça rdesidua gelen embriyo aldır. Sonra bu protokol ile deneyimli, steril DPBS bir defada 3-4 9.5 DPC embriyo izole. Steril teknik ve sterilize diseksiyon aletler kullanın. Instruments otoklav, ısı sterilizasyon veya etanol içinde inkübasyonu ile sterilize edilebilir. </li><li> Anterior vagal NC için: insülin iğneleri kullanarak, orta kulak taslakları da nöral tüp kesti. 4. hücre gruplarının arka kenarı tekrar kesin. Faringeal kemerler ve kalp kaldırmak için nöral tüp ventral doku kesin. </li><li> Gövde NC için: insülin iğneleri kullanılarak, hücre grubu 16-22 (ya da embriyo önceki 22 hücre gruplarının sahne daha gelişimsel olarak ise son hücre gruplarının) arasındaki nöral tüp kısmını kaldırın. </li><li> Yolk kesesi ve genotiplendirme için kalan embriyonik doku tutun. </li></ol> 6. Sigara nöral Ektoderm ve Mezodermin Kaldırma <ol><li> 10 dakika için oda sıcaklığında kollajenaz / dispase içine bölümleri içeren sinirsel tüp yeris. Hemen yıkama ortamda yıkayın. </li><li> Steril DPBS doku dönün. Steril insülin iğneleri kullanarak, yavaşça dokusundan olmayan nöral ektoderm kaldırmak ve uzak nöral tüp Somitlerin ayırın. Hücre gruplarının doku mezodermin son kalan parçaları bir cut-down P20 ucu ile hafifçe triturating tarafından kaldırılabilir. Nöral tüp zarar için dikkatli olun. Öğütme sırasında yakından gözlemleyin. </li><li> Yıkama orta bir ikinci ve üçüncü 30 saniye yıkama yoluyla izole sinir yerleştirilir. </li><li> SR orta bir kez yıkayın ve (Adım 1.3) daha önce hazırlanan bir FN kaplı kuyunun merkezi haline izole nöral tüp yerleştirin. Steril su bir tabak ile hipoksi odası Nemlendirme. Hipoksi odasına çanak yerleştirin ve% 3 O 2 (1% karışımı O 2,% 6 CO 2,% 93 N 2 içeren bir tank kullanmak) karışık gaz odası yıkayın. </li><li> Daima tha sağlamak için son derece dikkatli odası elet eksplantları rahatsız olan ve kuyularının merkezi kalır. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübe Adımları 5-6 Özeti Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol> 7. Nöral Tüp çıkarılması <ol><li> Inkübasyondan 24 saat sonra, nazikçe uzak steril bir insülin iğnesi kullanarak göç eden hücrelerin nöral tüpün kenarına alay tarafından nöral tüp kaldırın. Çıkarın ve adım 6.2 gibi steril bir P20 kesim kullanarak ortamdan nöral tüp atmak ve taze SR orta (Şekil 2) ile orta yerine. Bu en kolay ters bir mikroskop kullanılarak yapılır. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Hipoksik koşullarda ° C, NK hücreleri neredeyse saf nüfus (Şekil 3a) nöral tüp uzak göç etmiş 37 inkübasyondan 24 saat sonra. Bazen, ideal kültürler daha az güçlü çıkıntılar vermeyecektir. Örneğin, bu, 24 saat sonra t mümkündürdiye nöral tüp kendi üzerine kıvrılmış olacak ve NC nöral tüp (Şekil 3b) uzağa göç olmaz. Bazen nöral tüp fibronektin kaplı plakaları takmak değil. Bizim deneyimlerimize göre, sub-optimal NC göç ya da nöral tüp eki ile ilgili sorunlar olumsuz sırasıyla normoksi koşulları veya fibronektin konsantrasyonu etkilenebilir. Kollajenaz / dispase Enzimatik aktivite toplu ve sindirim zaman biraz değişir uygun şekilde ayarlanması gerekir, ancak on beş dakika daha uzun doku sindirmek değil. Kollajenaz / dispase doku içeren sinirsel tüpün Overdigestion da eksik çıkıntılar ile sonuçlanacaktır. Hücre gruplarının doku kolayca kollajenaz / dispase inkübe edildikten sonra nöral tüp kaldırılmaz ise, nöral tüp on dakika daha uzun süre inkübe edilebilir. Bazen nöral tüp substrat eklemek olmayacak. Bu durumda, fibronec çift kontrolkalay konsantrasyonu ve hipoksi koşulları. Normoksik koşullar kültürü vahşi tip NC için kullanılabilmesine rağmen, hipoksik koşulları daha yakından in vivo ortamda 29,30 in taklit edebilirler. Deneyimlerimize göre, hipoksik koşullarda zaman kültür mutant NC kritik hale geldi. Örneğin, Foxd3 mutant NC normoksik koşullar kültive edildiğinde, gövde NC kontroller ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalır hücre outgrowth sahipti. Eksplantları hipoksik koşullar (Şekil 4) kültive edildiğinde, outgrowth boyutunda bu farkı çıkarıldı. Ayrıca, yabani tip nöral tüp eksplantları normoksi kültüre edildiğinde, kaspaz-pozitif hücre sayısı (veriler gösterilmemiştir) hipoksi kültüre benzer eksplantlarının o zaman daha büyüktü. Hipoksi tüm NC kültürünü koruyarak, karşılaştırmaları daha kolay kontrol dinamikleri ve mutant kültürler arasında yapılabilir. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> <strong&gt; Şekil 1. NC izolasyon Genel şematik. A) embriyodan ilgi bölgeleri parçalara ayır. B) kollajenaz / on dakika (on beş dakikayı aşmayan) için dispase nöral tüp Digest. C) yıkama ortamda yıkayın. D) non-nöral ektoderm ve mezoderm uzak parçalara ayır. EF) yıkama ortamda iki kez yıkayın. Kendini yenileme ortamda G) Levha. % 3 O 2 hipoksik koşullarda 37 ° C&#39;de inkübe edilir. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Eksplant gelen nöral tüp adımsal kaldırılması. Nöral tüp olmayan NC hücreleri ile kirlenmesini önlemek için 24-48 saat sonra uzaklaştırılmalıdır. A) nöral tüp ve NC akıbet (düz çizgi) arasındaki sınır dikkat edin. B) bir insülin iğnesi ile nöral tüpün kenarı boyunca kesin. C) nöral tüp atın ve taze kendini yenileme orta ile orta yerine. Kesikli çizgi outgrowth kapsamını göstermektedir. Kısaltma: NT, nöral tüp. Şekil 3. Temsilcisi sonuçları örnekleri. Hipoksik koşullarda kendinden yenilenmesi ortam içinde 24 saat inkübasyondan sonra A) Tipik eksplant outgrowth (tireli çizgi) outgrowth kapsamını göstermektedir. B) kültüründe 48 saat sonra NC akıbet açısından Büyütülmüş. Düşük outgrowth verim C) Daha az ideal bir kültür. A ve C, aynı koşullar altında kültüre edildi. Görüntüler kültür sağlamlık doğal geniş olduğunu gösterir. Bu kollajenaz / dispase sindirimler nöral tüp izolasyon, FN konsantrasyonu, hipoksik koşullarda ve zaman verimliliği etkilenebilir. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Normoksi karşı hipoksi NC eksplant kültürlerinde in vitro inceleme. Normoksik kültür koşullarında 48 saat sonra nöral tüp eksplantları göç Kontrolü (yabani tip) NK hücreleri. Buna karşılık, mutant Foxd3NC büyük normoksi hücre çıkıntılar (NC çıkıntılar kırmızı hatlarını işareti kenarları) azalmıştı. Karşılaştırılabilir eksplantlarında hipoksik koşullarda yetiştirilen alındığında, Foxd3 mutant NC eksplantları sonraki analizlerde izin kontrollerine nispeten büyüdü. Not Bu davranış, in vivo Foxd3 mutant NC davranışı ile ilişkili olduğu bulunmuştur.

<ol><li>Le Douarin, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLe+Douarin%2C+N+%22The+neural+crest%22">The neural crest</a>. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).</li>
<li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration%3A+patterns%2C+phases+and+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Developmental biology. 344, 566-568 (2010).</li>
<li>Saint-Jeannet, J. -P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaint-Jeannet%2C+J-P+%22Neural+crest+induction+and+differentiation%22">Neural crest induction and differentiation</a>. , Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).</li>
<li>Plank, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+and+timing+of+arrival+of+murine+neural+crest+on+pancreatic+beta+cell+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation.</a> Developmental biology. 349, 321-330 (2011).</li>
<li>Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+neural+crest+regulate+beta-cell+mass+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas.</a> Development. 135, 2151-2160 (2008).</li>
<li>Freem, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre%3BYFP+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> J. Anat. 217, 651-664 (2010).</li>
<li>Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+approach+to+the+problem+of+neural+crest+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A clonal approach to the problem of neural crest determination.</a> Developmental biology. 46, 262-280 (1975).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+quail+neural+crest+cells%3A+they+are+pluripotent+and+differentiate+in+vitro+in+the+absence+of+noncrest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells.</a> Developmental biology. 80, 96-106 (1980).</li>
<li>Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+precursors+for+neural+and+mesectodermal+derivatives+in+the+cephalic+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest.</a> Development. 112, 301-305 (1991).</li>
<li>White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cells+undergo+cell-intrinsic+developmental+changes+in+sensitivity+to+instructive+differentiation+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals.</a> Neuron. 29, 57-71 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification%2C+isolation+by+flow+cytometry%2C+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+avian+neural+crest%3A+migration+and+maturation+of+mixed+neural+crest+clones+injected+into+host+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos.</a> J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).</li>
<li>Chung, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+property+of+postmigratory+cranial+neural+crest+cells+and+their+utility+in+alveolar+bone+regeneration+and+tooth+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development.</a> Stem Cells. 27, 866-877 (2009).</li>
<li>Biernaskie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKPs+derive+from+hair+follicle+precursors+and+exhibit+properties+of+adult+dermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).</li>
<li>Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0+and+PMP22+mark+a+multipotent+neural+crest-derived+cell+type+that+displays+community+effects+in+response+to+TGF-beta+family+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors.</a> Development. , 126-3781 (1999).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+isolation+of+enteric+nervous+system+progenitors+using+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2.</a> Stem Cells. 29, 128-140 (2011).</li>
<li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+in+reduced+levels+of+oxygen+promotes+clonogenic+sympathoadrenal+differentiation+by+isolated+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.</a> J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).</li>
<li>Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+clonal+analysis+of+mouse+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">In vitro clonal analysis of mouse neural crest development.</a> Developmental biology. 157, 517-525 (1993).</li>
<li>Etchevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+chick%2C+mouse+or+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells.</a> Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).</li>
<li>Mundell, N. A., Labosky, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cell+multipotency+requires+Foxd3+to+maintain+neural+potential+and+repress+mesenchymal+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates.</a> Development. 138, 641-652 (2011).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development. 133, 99-106 (2006).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling+is+essential+for+cranial+neural+crest+migration+and+trigeminal+ganglion+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation.</a> Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).</li>
<li>Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrins+and+N-cadherin+coordinate+to+control+the+pattern+of+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia.</a> Development. 133, 4839-4847 (2006).</li>
<li>Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin%2Fneuropilin+signaling+influences+the+positioning+of+migratory+neural+crest+cells+within+the+hindbrain+region+of+the+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick.</a> Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).</li>
<li>Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+signaling+guides+neural+crest+cells+to+coordinate+pathway+choice+with+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).</li>
<li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).</li>
<li>Ivanovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+or+in+situ+normoxia%3A+The+stem+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm.</a> J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Dikkat dikkat bu yaklaşımın başarısı için embriyonun gelişim aşamasında dikkat edilmelidir. Erken fare embriyo Somitlerin sayan bir çöp içinde embriyo eşleme ve izolasyon için nöral tüpün doğru bölgelerin belirlenmesinde aşaması için hem kritik önem taşımaktadır. Embriyo arasındaki bir ya da iki Somitlerin bir varyasyonu yapılan deney çözünürlüğü bağlı olarak, gelişim zamanlama makul bir aralığı içindedir. 9 ve 9.5 DPC arasında bir embriyo 17 ve 25 Somitlerin arasında olacaktır. Embriyo fazla 25 Somitlerin varsa, NC dah...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM (düşük glukoz) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal Orta </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354037 </td><td> -20 ° C&#39;de 50 mcg / ml hacimde Mağaza </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> BD Biosciences </td><td> 354060 </td><td> -20 ° C&#39;de 25 mcg / ml hacimde Mağaza </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Gibco </td><td> 33016-015 </td><td> 1mg/ml al Saklanan-20 ° C&#39;de iquots </td></tr><tr><td> Retinoik asit </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td> -20 ° C&#39;de etanol içerisinde yeniden yapılandırılması sonra, 35 ug / ml alikots içinde deposunda </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma </td><td> D-5637 </td><td></td></tr><tr><td> N 2 takviyesi </td><td> Gibco </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B27 takviyesi </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Steriflip 0,22 um filtreler </td><td> Millipore </td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> 0.20 mikron filtreleri </td><td> Corning </td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga (filtrasyon için) </td><td> BD Biosciences </td><td> 301604 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Dört kuyucuğu </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz / Dispase </td><td> Roche </td><td> 269 ​​638 </td><td> Etkinlik toplu göre değişir. -20 ° C&#39;de 100 mg / mL alikots içinde deposunda </td></tr><tr><td> İnsülin iğneleri (29 ½ ölçer) </td><td> Becton Dickson </td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td> Hipoksi Odası </td><td> Billups-Rothenberg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oksijen Analiz Cihazı </td><td> Billups-Rothenberg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Forseps # 5 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td></td><td> Rahim ve desidua kaldırmak için. </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA (% 0.25) </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik mürin nöral tüp çıkan sinirsel crest hücre İzolasyonu ve kültür

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Embriyonik nöral krest (NC), nöral tüpün dorsalinde kaynaklanan multipotent progenitör nüfusu mezenkimal geçiş (EMT) bir epitel uğrar ve farklı hücre tipleri 1-3 sebebiyet veren, embriyo boyunca göç eder. NC de hedef organlar 4-6 farklılaşması ve olgunlaşması etkilemek için eşsiz bir yeteneği vardır. In vitro eksplante zaman, NC ataları kendini yenileme geçmesi, göç ve nöronlar, glia, düz kas hücreleri, kıkırdak ve kemik dokusu da dahil olmak üzere değişik türde farklılaşırlar. NC multipotency ilk. Kuş nöral tüp 7-9 eksplant tanımlanmıştır NK hücrelerinin in vitro izolasyonunda proliferasyon, göç ve multipotency dahil NC dinamikleri çalışmaya kolaylaştırır edildi. Kuş ve sıçan sistemlerinde daha fazla çalışmalar embriyo 10 geri nakledilen zaman eksplante NK hücreleri, NK potansiyelini korumak olduğunu göstermiştir-13. Bu doğal hücresel özellikleri eksplante NC ataları korunur Çünkü nöral tüp eksplant testi in vitro NC eğitim için cazip bir seçenek sunar. Memeli NC daha iyi anlaşılmasını sağlamak amacıyla, birçok yöntem NC nüfus yalıtmak için istihdam edilmiştir. NC kökenli ataları sonrası göçmen NC progenitörlerin 11,14-20 dinamiklerini incelemek için embriyo ve yetişkin hem de post-göçmen konumları kültüre edilebilir, ancak bunlar nöral tüp göç gibi NC progenitörlerin izolasyon optimum muhafaza sağlar NC potansiyeli hücre ve göçmen özellikleri 13,21,22. Bazı protokoller, özellikle ataları 11,13,14,17 için zenginleştirilmiş bir NC nüfusu izole etmeye fluorescence activated cell sorting (FACS) kullanır. Ancak, erken evre embriyo ile başlatırken, analizler için yeterli hücre sayıları erken NC alan nüfus izolasyonu karmaşıklaştıran, FACS ile elde etmek zorbireysel embriyolardan ns. Burada, bir Wnt1-Cre aktive soy muhabiri 23 dayanan yaklaşık% 96 oranında saf NC nüfus FACS ve sonuçları dayanmayan bir yaklaşım açıklanmaktadır. Burada sunulan yöntemi sıçan NC 11,13 kültürü için optimize protokolleri uyarlanmıştır. Bu protokol daha önceki yöntemlere göre avantajları 1) hücre FACS)) göreceli olarak saf NC nüfusu, 3 elde etmek için gerekli değildir premigratory NC hücreleri izole edilir ve 4), bir besleyici tabakası, 2 yetiştirilen değildir sonuçlar kolayca olmalarıdır sayılabilir. Bundan başka, bu protokolü farklı genetik manipülasyon ile NC özelliklerinin çalışma kolaylaştırıcı, herhangi bir mutant fare modelinde gelen NC izole edilmesi için kullanılabilir. Bu yaklaşımın sınırlaması NC NC 2,24-28 hayatta kalması, göç ve farklılaşmayı etkileyen bilinmektedir embriyo bağlamında kaldırılır olmasıdır.

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını kolaylaştırır<em&gt; In vitro</em&gt; Göç, kendini yenileme ve nöral krest multipotency çalışmak için yöntemler.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Embriyonik nöral krest (NC), nöral tüpün dorsal kısmından köken alan, epitelden... geçiren multipotent bir progenitör popülasyondur.

Bu protokolü yürütmek için üç saat ayırın. Deneyim kazandıktan sonra, diseke edilen embriyo sayısına bağlı olarak bu protokolün tamamlanması bir buçuk ile iki saat arasında sürecektir. Bu protokol, vagal nöral tüp içeren dokuyu izole etmek için 9.5 günlük bir embriyodan orta otik plak ve somite dört seviyesinden nasıl kesi yapılacağını açıklamaktadır. Kesme.Somit 16 ve 22'de, gövde nöral tüpünü içeren doku izole edilecektir. Vagal nöral krest, vagal nöral tüpten göç eder. Gövde nöral krest gövde nöral tüpünden göç ederken, diseke edilen doku kollajenaz içeren bir solüsyonda enzimatik olarak sindirilecek, yıkanacak ve nöral olmayan epidermis ile mezoderm diseksiyonla uzaklaştırılacaktır.İzole edilen nöral tüp iki kez daha yıkanacak ve ardından kendi kendini yenileme ortamına ekilecektir. Ben Vanderbilt Üniversitesi'ndeki Bosky Laboratuvarı'ndan Elise Graph. Bugün, explan kültüründeki nöral tüpten nöral kristanın nasıl izole edileceğini göstereceğim.Bu teknik, nöral kristanın özelliklerini in vitro olarak incelemenize olanak sağlayacaktır. Hadi başlayalım. 1 mg/mL fibronectinin 100 µL'sini 3,2 mL steril DPBS içinde seyrelterek başlayın.Dört kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğunun taba

isolation-culture-neural-crest-cells-from-embryonic-murine-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video embriyonik farelerin gelişmekte olan korteks neuroprecursors izolasyonu için kullanılan yöntem açıklanır. , Embriyoların rahim kaldırarak, kortikal doku diseksiyon, ve sindirerek izole serebral korteks prosedür gösterilmiştir.

Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür

Burada fare epidermal nöral krest kök hücreleri (EPI-NCSC) izole etmek için yöntem gösteriyor. Tekniği içerir mikro diseksiyon, bıyık kıl follikülleri, şişlik izole ve doku kültürü içine placeing. 4 gün - 3 gün içinde EPI-NCSC alt tabaka üzerine çıkıntı eksplantlar göç etmeye başlar.

Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

In vitro nöral krest kök hücreler (NCSC) yetiştirmek için özel bir orta (NCSCM) gereklidir. NCSCM önemli bir parçası civciv embriyo ekstraktı (CEE). Biz burada, izolasyon, maserasyon, santrifüj ve filtrasyon işlemleri gibi ayrıntıları da dahil olmak üzere saf ve kaliteli CEE maksimize miktarda üretmek için doğru teknikleri anlatıyoruz.

Civciv Embriyo Özü murin Sinir Crest Kök Hücre Yetiştiriciliği Üretimi

Bu makale, insan saç köklerinin gelen nöral krest kök hücrelerin izolasyonu ve kültür için sağlam bir protokol sunar.

İnsan Saç köklerinin arasından Sinir Crest Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu video, civciv embriyolarının orta beyin bölgesinden kraniyal nöral kıvrımları izole etmek için bir tekniği göstermektedir. Nöral kıvrımların ayrıntılı bir diseksiyon sürecini, bunların yerleştirilmesini ve fibronektin kaplı lameller üzerine bağlanmasını ve ardından nöral kıvrımlardan nöral krest hücre göçünün gözlemlenmesini sunar.

Nöral krest hücre kültürü için bir civciv embriyosundan kraniyal nöral kıvrımların izole edilmesi

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Bu protokol, öncelikle hücre göçü çalışmaları için fare modellerinden kranial nöral krest hücrelerinin diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kullanılan canlı görüntüleme tekniklerini ve hız ve hücre şekli değişikliklerinin analizini anlatıyoruz.

Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi

Bu çok yönlü protokol, civciv embriyolarından kraniyal nöral kıvrımların eksizyonu yoluyla göç öncesi nöral krest hücrelerinin (NCC'ler) izolasyonunu tanımlar. Kaplama ve inkübasyon üzerine, göçmen NCC'ler nöral kıvrım eksplantlarından ortaya çıkar ve basitleştirilmiş bir 2D ortamda hücre morfolojisinin ve göçünün değerlendirilmesine izin verir.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Bu protokol, nöral krest hücrelerinin hyaluronan bakımından zengin hücre dışı matrise in vivo göçünde rol oynayan moleküllerin fonksiyonel analizi için uygun bir in vitro migrasyon deneyini özetlemektedir.

In Vitro Hyaluronan Bakımından Zengin Hücre Dışı Matriksin Nöral Kret Hücre Migrasyonu Üzerine Etkilerinin İncelenmesi

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Fare embriyonik kök hücrelerinden kraniyal nöral krest hücreleri üretmek için tekrarlanabilir boyutta nöroküreler üreten üç boyutlu (3D) bir in vitro farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu metodolojinin önceki protokollere kıyasla değişkenliği azalttığını ve kraniyal nöral krest hücre gelişimini incelemek için çoğullanmış test için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kraniyal Nöral Krest Hücreleri Çoğullanmış Test için Üç Boyutlu İn Vitro Farklılaşma Protokolü

Öğrenin, embriyonik fare nöral tüplerinden sinirsel crest hücrelerini izole etme ve kültürleme yöntemini. Bu protokol, FACS veya besleyici katman gerektirmeden %96 saflıkta premigratuvar hücre sağlar.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Daha fazla video keşfet