Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin dorsal kök ganglion nöronları veya DRG nöronları kullanılarak memeli akson rejenerasyonunu incelemek için bir in vitro model oluşturmaktır. Bu, önce yetişkin farelerden DRG'lerin kesilmesiyle gerçekleştirilir ve bunlar daha sonra tek hücrelere ayrılır. Daha sonra ayrışmış nöronlar elektroporasyon ile transfekte edilir ve gen ekspresyonlarını genetik olarak manipüle etmek için birkaç gün kültürlenir.

Son adım, ek gece kültürü için nöronları yeniden askıya almak ve yeniden stabilize etmektir. Sonuç olarak, genetik olarak manipüle edilmiş nöronlardan akson büyümesinin yeniden büyümesini incelemek için mikroskopi tabanlı akson uzunluğu analizi kullanılır. Bu teknikte kullanılan hücre resus süspansiyonu ve tekrarlayan adımın ana avantajı, zaten genetik olarak manipüle edilmiş nöronlardan akson büyümesinin analizine izin vermesidir.

Bu teknik, özellikle fonksiyon kaybı için yararlıdır: RNI yaklaşımının, ilgilenilen geni aşağı regüle etmek için kullanıldığı çalışmalar, prosedürü gösteren ve laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Sfu'nun olacaktır. Nöronal kültür örtü fişlerini hazırlamak için önce gece boyunca %10 hidroklorik asitle yıkayın. Ertesi gün sonik onları bir saat boyunca damıtılmış suda ısıtın.

20 dakikalık üç bölüm halinde, temizlenmiş lamele fişlerini %70 etanolde saklayın ve kullanmadan önce kurumaya bırakın. Kurumuş kapak fişlerini kaplamak için yanında. Kuyucuk başına bir kayma ve 100 mikrolitre kaplama çözeltisi ile çok kuyulu bir plaka oluşturun.

Plakaları 37 santigrat derecede bir ila iki saat boyunca herhangi bir çalkalama olmadan inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kaplama solüsyonunu çıkarın ve kapak kaymalarını steril bir XPBS ile üç kez yıkayın. Tamamen anestezi uygulanmış altı ila 10 haftalık yetişkin bir fareyi feda ettikten sonra, ağrılı hislere yanıt vermeyen.

İlk olarak, sırt derisini çıkarın. İkinci olarak, bağlı dokular da dahil olmak üzere boyundan kuyruğa kadar tüm omurları kesin. Son olarak, dokunun içine bağlı tüm iç organları çıkarın.

Çıkarılan omurgayı bir XPBS ile iki ila üç kez durulayın, ardından ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon plakasına sabitleyin. Duyusal sinirleri açığa çıkarmak için kasları dikkatlice çıkarın. Bel seviyesindeki DRG'lere bağlı sinirler en kalın olanlardır ve kolayca bulunurlar.

Bu nedenle, çoğu deney için sadece lomber DRG'ler hasat edilir. Her bir omuru merkez çizgisi boyunca küçük bir makasla kesin ve omurları izole etmek için intervertebral diskleri dikkatlice çıkarın. L bir'den başlayarak, her bir omuru ayırmak ve lomber DRG'leri incelemek için forseps kullanın.

Her bir lomber siniri omuriliğe doğru izleyerek DRG'leri forseps ile bulun. Bu işlemi L iki ila L altı için tekrarlayın. Ardından, izole edilmiş DRG'lerden periferik sinir dorsal ve ventral köklerini kesmek için yaylı makas kullanın.

DRG'leri, gerekirse em EM ortamı ile doldurulmuş soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir füge tüpünde saklayın. Aynı prosedür, DRG'leri diğer omurga seviyelerinden toplamak için de kullanılabilir. Tüm DRG'leri topladıktan sonra, MEM ortamını bir mililitre ile değiştirin, bir çözelti kollajenaz yapın ve DRG'leri 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin.

Daha sonra, kollajenaz bir çözeltiyi 500 mikrolitre bir x üçlü E ekspres sindirim solüsyonu ile değiştirin ve tüpleri ikinci sindirimden sonra 15 ila 20 dakika daha inkübatöre geri koyun. Çözeltiyi %5 FBS içeren bir mililitre hazırlanmış ortamla değiştirerek DRG'leri yıkayın, DRG'leri döndürün ve çökelmelerine izin verin. Bu yıkamayı tekrarlayın.

Devam etmeden önce iki kez adım atın. Son yıkamayı çıkardıktan sonra, 600 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve dokuları üçlemek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Tri, ayrışmamış dokuların mikro füj tüpünün dibine çökmesine izin verdikten sonra 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak bunu 20 ila 30 kez yapın.

Sadece hücre süspansiyonunu 10 mililitrelik steril bir tüpe aktarın ve 600 mikrolitre daha kültür ortamı ekleyin. Dokuların çoğu ayrışana kadar üç adımı tekrarlayın. Süspansiyon hem nöronları hem de nöronal olmayan hücreleri içerir.

Tipik olarak, bir elektroporasyon reaksiyonu için yeterli olan altı dg'den yaklaşık 50.000 hücre toplanır, altı dg'nin ayrışmış hücrelerini santrifüjleyin ve mümkün olduğunca fazla süpernatan atın. Daha sonra hücreleri, 200 mikrolitrelik bir pipet ucundan üç ila dört hafif vuruşla DNA plazmidi veya SI RNA içeren 100 mikrolitre transfeksiyon solüsyonunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu bir elektroporasyona aktarın, vete ve elektroporasyondan sonra hücreleri elektroporasyona tabi tutun.

Hemen vete'ye FBS içeren 500 mikrolitre ılık kültür ortamı ekleyin. Resus süspansiyonu ve yeniden kaplama kültürü gerektiren çoğu deney için, plastik bir kültür kabı üzerindeki nöronlar kuyu başına 10 ila 20.000 hücredir. Bununla birlikte, elektroporasyondan hemen sonra akson büyümesini incelemek için, nöronlar doğrudan kaplanmış cam üzerine kaplanabilir Kapak kaymaları, oyuk başına üç ila 5.000 hücre.

Dört saatlik hücre kültüründen sonra, nöronlar substrata bağlanmış olacaktır. Transfeksiyon çözeltisi ile kirlenmiş ortamı 500 mikrolitre taze ısıtılmış ortamla nazikçe değiştirin ve plakaları inkübatöre geri koyun. DNA plazmitlerinden gen ekspresyonunun analizi, elektroporasyondan sadece birkaç saat sonra mümkündür.

Bununla birlikte, yeni aksonal büyümede gen ekspresyonunun aşağı regülasyonunu analiz etmek için daha uzun kültürleme süresi gereklidir. Yüksek yoğunluklu plakalar üzerinde üç günlük kültürden sonra, ortamı bir mililitre önceden ısıtılmış taze ortamla değiştirin ve nöronları pipetin altı ila 10 hafif darbesiyle çözelti haline getirin. Daha sonra nöronal olmayan hücreler plakaya bağlı kalacak, yeniden askıya alınan nöronları bir mikro fuge tüpüne aktaracak ve hücre kümelerini ayırmak için 10 ila 15 kez nazikçe T'ye binecektir.

Kültürde üç gün sonra bağlı nöronun süspansiyonunun daha kolay kullanılmasını sağlamak için, ilk kültürden önce kültür kabının kaplanması sadece 1, 2, 3 saat ile sınırlıdır. S süspansiyon adımları sırasında, hücrelerin kültürel çanak Plakasından ayrılıp ayrılmadığını gözlemlemek için genellikle hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında sürekli olarak kontrol ederiz. Ertesi gün düşük yoğunlukta yeni hazırlanan örtü fişleri üzerindeki nöronlar, yeni aksonal büyümeleri analiz eder.

Herhangi bir hücre dışı büyüme faktörünün yokluğunda, yetişkin DRG nöronları genellikle aksonları büyütmeye başlar. İlk kaplamadan 48 saat sonra aksonlar genellikle dallı morfolojiler gösterir. Buna karşılık, yeniden kaplanan nöronlar, kaplamadan sadece birkaç saat sonra aksonları uzatmaya başlar ve aksonlar azalmış dallanma ile uzar.

Bu sonuçlar, yeniden kaplanan nöronların, in vivo olarak yenilenen nöronlarınkine benzer özellikleri paylaştığını göstermektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, yetişkin DRG nöronlarından akson büyümesinde akson rejenerasyonu ile ilişkili transkripsiyon faktörlerinin rolünü incelemek için bir fonksiyon kaybı çalışması kullanıldı. Laboratuvar ortamında.

Sonuçlar, cgen'in farklı bölgelerini hedef alan dört farklı irnadan oluşan bir grubun elektroporasyonunun, yetişkin DRG nöronlarındaki cgen protein seviyelerini önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Transfeksiyondan üç gün sonra, nöronlar gece boyunca yeniden kaplandığında ve kültürlendiğinde, cgen yıkım nöronlarından akson büyümesi önemli ölçüde azaldı. Bu sonuçlar, kültürlenmiş yetişkin DRG nöronlarının, yetişkin nöronlardan akson büyümesini incelemek için yararlı bir model sistem sağladığını göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, transfect ve kültürün nasıl inceleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Yetişkin ayrıca in vitro membran kazası rejenerasyonunu incelemek için ganglion nöronlarını köklendirmelidir.