Gaz kromatografisi ile operant etanol kendi kendine uygulama ve etanol belirleme sırasında etanol mikrodivaliz

Bu prosedürün genel amacı, bir etanol kendi kendine uygulama seansı sırasında beyin diyalizatındaki etanol seviyelerini izlemektir. Bu önlemi senkron kendi kendine uygulama davranışlarıyla karşılaştırmak için, bu, önce bir mikrodiyaliz kılavuzu, kanül ve ip cıvatasının cerrahi olarak implante edilmesiyle ve daha sonra sıçanların etanolü operant olarak kendi kendine uygulamak için eğitilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, mikrodiyaliz sırasında etanolün kendi kendine uygulanmasını engellememesi için sıçanları baş aşama bağlantısına alıştırmaktır.

Daha sonra, etanol analizi için bir miktar diyalatın hazırlandığı bir etanol kendi kendine uygulama seansı sırasında mikrodiyaliz gerçekleştirilir. Daha sonra, diyalat numuneleri, alev iyonizasyon algılamalı bir gaz kromatografı kullanılarak etanol konsantrasyonu için analiz edilir. Sonuç olarak, elde edilen sonuçlar, bir etanol kendi kendine uygulama seansı sırasında etanolün ilgilenilen beyin bölgesine ulaşma süresini göstermektedir.

Bu tekniğin kuyruk veya safen ven ponksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu prosedürün numune toplama sırasında minimum düzeyde rahatsız edici olması ve hayvan davranışsal bir görevi yerine getirirken ilgilenilen beyin bölgesinde zaman içinde ilaç ölçümüne izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, birçoğu yalnızca tekrarlanan uygulama veya deneyim yoluyla edinilebilecek bir dizi özel beceri gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir. Ayrıca laboratuvarımızda lisans araştırma görevlisi olan Jeffrey Dilley de prosedürü gösterecek.

Gösterilen tüm hayvan prosedürleri, Texas Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanları düzenlemelerinin bakımı ve kullanımı ile ilgili tüm kılavuzları takip eder. Austin'deki Texas Üniversitesi, ALAC tarafından akredite edilmiş bir tesistir; ilgilenilen beyin bölgesinin üzerine 21 gauge kanül ile cerrahi olarak implante edilmiş iyi idare edilen uzun Evans sıçanları, bu davranışsal mikrodiyaliz deneyleri için kullanılır. Tüm hayvanlar en az bir hafta ameliyat sonrası bakım ve iyileşme görmeli ve aşağıdaki prosedürlere başlamadan önce sağlıklı olmalıdır.

Sıçatanı, bir lichter geri çekilebilir kol ve damper borusu ile donatılmış bir med associates çalışma odasına yerleştirin ve %10'luk bir sükroz çözeltisine erişim için kola basması için eğitin. Sıçan sükroz çözeltisine yanıt vermek üzere eğitildikten sonra, ikinci ila son işlem seansından önceki gece birden fazla içme seansı boyunca etanolün çözeltiye kademeli olarak eklendiği uygun bir eğitim programına başlayın. Hayvanı uyuşturduktan ve sedasyon seviyesini kontrol ettikten sonra, bir denge kolu, kol, döner ip, yay ve halka standından oluşan aparata alıştırmak için ip yayını farenin kafa aşamasındaki ip cıvatasına takın.

Sıçanın geceyi ameliyathane odasında ev kafesinde ad lido, yiyecek ve su ile geçirmesine izin verin ve ardından mikrodiyaliz deneyinden bir gün önce ip ve beraberindeki ekipmanla ertesi günün eğitim seansını tamamlayın. Sıçanı isof flor ile uyuşturduktan sonra, bir ayak parmağı çimdikleme yaparak sedasyonu kontrol edin ve yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüze edilmiş bir mikrodiyaliz probu yerleştirin. Probu uygun şekilde sabitleyin ve ardından prob akış hızını dakikada 0,2 mikrolitreye ayarlayın.

Geceyi tüm diyaliz ekipmanı yerinde geçirmek için fareyi ameliyathanedeki ev kafesine yerleştirin ve lib, yiyecek ve su ekleyin. Probu yerleştirdikten sonraki gün, deney başlamadan en az iki saat önce, probu çalışma akış hızına getirin. Bir Hamilton şırınga kullanarak, prob akış hızının tutarlı olduğunu ve ayarlanan akış hızının en az %90'ı olduğunu kontrol edin.

Diyaliz örneklerinde nörotransmiterleri değerlendiriyorsanız, deneyin tüm aşamalarında örnekler alın. Hayvan ev kafesindeyken diyaliz örnekleri toplayarak başlayın. Numuneleri daha sonraki analizler için uygun bir şekilde saklayın.

Fareyi dikkatlice işlem odasına aktarın ve odayı kontrol eden işlem programını başlatın. Sıçan, kolun hazneye uzamasını beklerken numune almaya devam edin, kol uzamadan önce iki numune. İki mililitrelik bir cam şişeye uygun bir diyalizat alikotu pipetleyerek ve şişeyi hava geçirmez bir septum ile kapatarak etanol analizi için her diyalizat örneğinin bir kısmını toplamaya başlayın, pipetleyin ve etanol örneklerini hızlı bir şekilde kapatın.

Etanol uçucu olduğundan ve numune hacmi küçük olduğundan, tutarsız veya yavaş numune hazırlama yanlış sonuçlara yol açacaktır. Kalanını nörotransmitter analizi için saklayın. 20 dakikalık içme periyodu, Med Associates bilgisayar programı kolu hazneye uzattıktan ve sıçan bir şişe içme solüsyonuna erişmek için ona bastıktan sonra başlar.

İçecek periyodundan sonra tüm içecek periyodu boyunca numune almaya devam edin, bilgisayar programı şişeyi hazneden geri çeker. Mikrodiyaliz deneyinin sonunda hayvanı içme sonrası 20 dakika daha odada tutun. Fareyi uyuşturduktan sonra probu çıkarın.

Hayvan hemen insancıl bir şekilde ötenazi yapılmazsa, prob yolunun görselleştirilmesini sağlamak için obteratörü değiştirin. Deneyden sonraki üç gün içinde beyni toplayın. Alev iyonizasyon dedektörlü bir gaz kromatografı, 50 santigrat dereceye kadar ısıtılmış bir üst boşluklu otomatik örnekleyici ve mobil faz olarak helyumlu bir kılcal kolon kullanarak numuneleri harici etanol standartlarıyla birlikte analiz edin.

Kromatogramları kaydetmek ve analiz etmek için, sistemi etanol analizine hazırlamak için kromatografi iş istasyonu yazılımını kullanın. Otomatik numune alma plakasını ısıtmak ve hava ve hidrojen tanklarını açmak için devridaim yapan bir su banyosu kullanın. Ardından, başlangıç programını başlatın.

Hazır olduğunda, lifi dekontamine eden 20 dakikalık bir yanma başlatın. 238 mikrolitre% 95 etanolü suyla 100 mililitrelik nihai hacme seyreltmek için 100 mililitrelik hacimsel bir şişe kullanarak standartlar oluşturun. Standartlar oluşturmak için bire bir seri seyreltme kullanın.

Standartları cam şişelere pipetleyin ve tam olarak numunelerin hazırlandığı gibi kapatın. Standartlarınızla birlikte bir su boşluğu çalıştırdığınızdan emin olun. Standartları ve numuneleri otomatik numune alma tepsisine yerleştirin ve tüm sıvı alikot buharlaşana kadar ısıtın.

Standartları ve numuneleri çalıştırmak için, hangi numunenin hangi otomatik numune alma yuvasında olduğunu ve her numunenin delinmesi gerektiğini belirten bir numune listesi oluşturun. Veri dosyalarını seçili bir klasöre yönlendirdikten sonra, örnekler için tercih edilen bir yöntem seçin ve çalıştırmaya başlayın. Sistem numuneleri inceledikten sonra, programın her bir tepe noktasını doğru şekilde entegre edip etmediğini kontrol edin.

Grafik, bilinen her bir dış standardın bir fonksiyonu olarak tepe yüksekliği. Etanol konsantrasyonu. Her bir diyalizat numunesinin etanol konsantrasyonunu enterpolasyon yapmak için noktalar tarafından verilen doğrusal işlevi kullanın.

Bu şekil, etanol kendi kendine uygulama oturumunun sonunda toplanan üç konsantrasyon etanol standardı ve bir sıçan diyalizat numunesi için bir tane için örnek kromatogramları göstermektedir. Etanol tepe noktaları nispeten simetrik olmalı, tutarlı tutma sürelerine ve 10'dan büyük bir sinyal-gürültü oranına sahip olmalıdır. Bu kriterlerin karşılanmaması, sistemin bakım, kalite kromatografisi gerektirdiği ve doğru standartların, kendi kendine uygulama süreleri boyunca etanol kendi kendine uygulanan hayvanlardan toplanan diyalizat örneklerinin etanol konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılan doğrusal bir standart eğri ürettiği anlamına gelir.

Türetilmiş diyalizat etanol konsantrasyonları, in vivo prob geri kazanımı için düzeltilmez ve beyin etanol doku konsantrasyonunun sadece bir kısmıdır. Etanolün kantitatif mikrodiyalizi gerekiyorsa, hücre dışı boşluktan proba yayılan etanolün ekstraksiyon fraksiyonu deneysel olarak belirlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık dört ila beş saat içinde yapılabilir.

Bu, davranışsal oturumun uzunluğuna bağlı olarak değişecektir. Deneyin mikrodiyaliz aşamasının başarılı bir şekilde tamamlanması, büyük ölçüde hazırlık aşamalarının kalitesine bağlıdır. Bu prosedürü denerken, farelerinizin iyi idare edildiğinden ve onları diyaliz deneyi sırasında ortaya çıkabilecek olası dikkat dağıtıcı uyaranlara alıştırdığınızdan emin olmak önemlidir, böylece hayvanın kendi kendine uygulama davranışı etkilenmez.