Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyolojik olarak ilgili lipid vezikülleri için sağlam bir hazırlama yöntemi sunmaktır. Bu, fosfolipidlerin cam şişelere karıştırılması ve aktarılması ve bir çoklu lamelli SLE süspansiyonu oluşturmak için sulu tampon ile nemlendirilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, bir dondurma ve çözme yöntemi gerçekleştirilir, bu da daha sonra çoklu lamelli veziküllerden Ella Veziküllerinin üretilmesiyle sonuçlanır.

Daha sonra, lipozom süspansiyonu, istenen boyutta homojen lipid vezikülleri üretmek için belirlenen optimal basınç kullanılarak bir ekstrüderden geçirilir. Dinamik ışık saçılımı ve nanopartikül izleme analizine dayalı olarak tutarlı mikron altı vezikül boyutları gösteren sonuçlar elde edildi. Bu tekniğin sonikasyon ve sedimantasyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin verimli lipid vezikül boyutu hazırlığı için en uygun belirlenmiş nitrojen akış hızlarına sahip bir basınç kontrol sistemi kullanmasıdır.

Bu işleme başlamak için, Teflon kaplı kapaklı 20 mililitrelik bir cam şişe alın, kontaminasyonu önlemek için kullanmadan önce tüm cam eşyaları ve şırıngaları kloroform ile temizleyin. 250 mikrolitrelik hava geçirmez bir cam şırınga kullanarak 100 mikrolitre reaktif dereceli kloroformu cam şişeye aktarın. 100 mikrolitrelik hava geçirmez bir cam şırınga kullanarak aynı cam şişeye 30 mikrolitre reaktif sınıfı metanol ekleyin.

Mililitre başına 216 mikrolitre 10 miligram pop C 42 mikrolitre mililitre 10 miligram aktararak iki milimolar pop C haşhaş kolesterol lipid çözeltisi hazırlayın. Pop e ve mililitre başına 20 mikrolitre 11 miligram. 20 mililitrelik cam şişeye yapılan kolesterol çözeltileri, şişenin dibinde ince bir lipit filmi görülene kadar yavaş akışlı argon veya nitrojen gazı kullanarak organik çözücüleri buharlaştırır, kapaksız cam şişeyi en az 30 dakika boyunca vakumlu bir kurutma içine yerleştirin.

Artık çözücüyü çıkarmak için, daha önce 0.2 mikronluk bir filtreden geçirilen iki mililitre tamponu, lipitleri hidratlamak için cam şişeye aktarın. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve 30 ila 100 nanometre lipozom boyutları için 48 saat içinde kullanın. Lipozom süspansiyonunu 15 saniye boyunca sıvı nitrojen içinde serbest bırakın.

Daha sonra lipozom süspansiyonunu yaklaşık üç dakika boyunca 42 derece SIU'da bir ısıtma bloğu kullanarak çözün. Dondurarak çözme işlemini toplam beş döngü boyunca tekrarlayın. Dondurma ve ardından çözdürme, çoklu lamelli veziküllerden Ella Les üretir ve ekstrüzyon sırasında lipit yakalama verimliliğini artırır.

Ardından, lipoyu bu kadar hızlı bir şekilde dikkatlice monte etmek için Avastin talimatlarını izleyerek ekstrüzyona hazırlanın. LF 50 ekstrüderin doğru montajı, istenen akış hızlarını etkileyen nitrojen sızıntısını önlemek için kritik öneme sahiptir. Başarıyı sağlamak için aşağıdaki adımları dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.

Hava geçirmez bir conta oluşturmak için. Büyük delikli destek süzgecini destek filtresi tabanına, ardından dairesel orta çanağı, bir tahliye diskini ve bir polikarbonat membranı yerleştirin. Küçük siyah O-ringi membranın üzerine yerleştirin ve destek filtresi tabanına sabitleyin.

Karşılık gelen dört deliğe dört vidayı sıkarak üst filtre ekstrüderini takın. Filtre ekstrüder ünitesini büyük ekstrüder namlusunun altına monte edin. Lipozom solüsyonunu ekstrüzyon namlusunun üstündeki silindir namlusuna ekleyin.

Büyük dairesel bir O-ring, dar kapak, büyük dairesel O-ring ve dairesel kapak yerleştirin. Gaz regülatörünü ekstrüder namlu üstüne takın ve basınç tahliye vanası da dahil olmak üzere hava sızıntısını önlemek için tüm vanaları kapatın. Ekstrüder filtre ünitesinin altına 20 mililitrelik bir cam şişe veya 50 mililitrelik bir erlenmeyer şişesi yerleştirin.

Regülatöre bir emniyet valfi bağlanmıştır ve basınç 600 PS'yi aşarsa serbest kalır. Azot gazını açıyorum ve ekstrüdere bağlı gaz vanasını açıyorum. Azot basıncını 400 nanometre lipozomlar için 25 PSI'ye, 100 nanometre lipozomlar için 125 PSI'ye ve 30 nanometre lipozomlar için 400 ila 500 PSI'ye yükseltin. Nitrojen tarafından itilirken kabın içine çıkana kadar lipozom süspansiyonunu izleyin.

Hiçbir sıvı görülmeyene kadar nitrojenin akmasını sağlayın. DLS analizini gerçekleştirmek için ekstrüder filtresinden cam eğeye geçerek. İlk olarak, fosfat tamponlu salin veya PBS içinde seyreltilmiş 20 mikromolar lipozom çözeltisinden 50 mikrolitre hazırlayın.

Ardından güç kaynağını ve lamba kaynağını açın. dynapro yazılımını açmaya devam edin. İstenilen boyuttaki lipozomları tespit etmek için yazılımı algoritma modeline ayarlayın.

Donanım pipetine 14 mikrolitre lipozom örneğini kuvars vete bağladıktan ve hücre tutucuya yerleştirdikten sonra, yaklaşık 20 ila 30 alımın ardından başlat'a basın, durdur'a basın. Histogramda kaydedilen ortalama lipozom çapı tepe noktalarını analiz edin. Nanopartikül izleme analizi, PBS'de çözündürülmüş 500 mikrolitrelik 0.1 mikromolar lipozom çözeltisinin hazırlanmasıyla başlar, numune bölmesini su ve etanol ile durulayın.

Ardından numune bölmesini tüy bırakmayan bir kağıt havluyla kurulayın. Lazer güç kaynağını açın ve bilgisayar, numune bölmesine 300 mikrolitre 0.1 molar lipozom solüsyonu verin. Sıcaklık kontrolünü ve nanopartikül izleme analiz yazılımını açın.

Lazeri açmak için yakalama düğmesine basın. Sahneyi hareket ettirmek ve mikroskop odağını ayarlamak için yatay ve dikey ayarları kullanın. İstenilen sıcaklığı ve kayıt süresini ayarlayın.

Belirli bir süre boyunca lipozom parçacıklarının birden fazla resim karesini çekmek için kayıt düğmesine basın. Her bir parçacığın hareketini izlerken histogramdaki çap lipozom boyutlarına karşılık gelen tepe noktalarını analiz edin. DLS, partikül çapını belirlemek için saçılan ışığı toplayan ve lipozom boyutlarını belirlemek için gerçekleştirilen yerleşik bir yöntemdir.

Hidratlı lipozomlar, yazılı protokolde tarif edildiği gibi çeşitli boyutlarda ve basınçlarda polikarbonat membranlardan ekstrüde edildi. 30 nanometre gözenek boyutu için DLS ile ölçülen lipozomların çapları 66 artı veya eksi 28 nanometre idi. 100 nanometre için gözenek boyutu 138 artı veya eksi 80 nanometre ve 400 nanometre için gözenek boyutu 360 artı veya eksi 25 nanometre idi.

50 nanometre cilalı Irene boncuklarından oluşan bir süspansiyon, 47 artı veya eksi 16 nanometrelik bir çap kaydettiği bir kalibrasyon standardı olarak kullanıldı. Yüzde poli dağılımı, lipozom boyutları arasında örtüşme olmadığını gösterir. Bu cihazın daha büyük parçacıklara karşı bilinen önyargısı nedeniyle DLS analizini kullanırken 30 nanometreden daha yüksek çapları gözlemlemek tipiktir.

Bu araçsal sınırlamaya rağmen, kalibrasyon eğrisi doğrusal olmayan korelasyonu tanımlar. Nanopartikül izleme analizi, partikül kırılma indisi veya yoğunluğundan bağımsız olarak sıvı bir ortamdaki difüzyonun doğrudan gözlemlerinden her bir partikülün boyutunu ölçen yeni bir teknolojidir. Bu yüksek çözünürlüklü teknik, DLS ile lipozomların ölçümünü desteklemek için kullanılabilir, NTA tarafından kaydedilen çaplar 95 artı veya eksi 48 nanometre ve kalibrasyon için iki 100 nanometre ve 400 nanometre polistiren çözeltisi için 356 artı veya eksi 51 nanometre kullanılmıştır.

Lipid çözeltileri, 30 nanometre gözenek boyutu için ortalama 29 artı veya eksi 14 nanometre, 100 nanometre gözenek boyutu için 95 artı veya eksi 17 nanometre ve 400 nanometre gözenek boyutu için 359 artı veya eksi 73 nanometre ortalama boyutlar üreten DLS'ye göre daha karşılaştırılabilir bir çapa sahiptir. NTA, mikroskobik parçacıkları ölçmek için daha genel bir karakterizasyon tekniği olabilir, çünkü duyarlılığı 50 ila 1000 nanometre parçacıkların ölçümlerine izin verir. Kalibrasyon eğrisi, polikarbonat membran duraklaması ile kaydedilen NTA çapı negatif leke iletimi arasında doğrusal bir korelasyon gösterir Elektron mikroskobu görüntüleri, 3, 100 ve 400 nanometre ekstrüzyon boyutlarını takip eden her bir lipozom boyutunu birbirinden açıkça farklı olarak gösterir.

Büyütme, 0,5 mikronu temsil eden ölçek çubuğu ile 25.000 kez ayarlandı. Üç lipozom boyutu ile bir zaman rotası deneyi yapıldı. DLS, ekstrüzyondan hemen sonra her lipozom çözeltisi için ölçüldü.

Tüm lipozom çözeltileri gece boyunca dört santigrat derecede saklandı. Çapları, bir gece inkübasyondan sonra DLS ile tekrar kaydedildi. 60 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra çok az değişiklik gözlendi veya hiç değişiklik gözlenmedi Bu prosedürü denerken, ekstrüzyon filtresinden birden fazla geçişin Vesco çözelti homojenliğini artıracağını unutmamak önemlidir.

Ayrıca, kloroformdan polipropilen tüpler tarafından sızma yoluyla kontaminasyonu önlemek için numune hazırlama için cam şişeler ve şırıngalar kullanmayı unutmayın.