Name: Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Öğrenin, sabit basınç kontrollü ekstrüzyon yöntemiyle nano ölçekli lipid veziküller hazırlamayı. Bu teknik, homojen boyut dağılımı sağlayarak lipozom üretiminde sonikasyon ve sedimentasyona üstün bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Ortak İnovasyon Ödülü ile desteklenmiştir. LAM Sinyali ve Sağlık eğitim bursu Hücresel Yönetmeliği Ulusal Enstitüsü (T32 GM008759) ve NIH Ruth L. Kirschstein Ön Doktora Sonrası (CA165349-01) tarafından desteklenmiştir. Biz onların değerli yorumları için Prof Michael Stowell (CU Boulder), Prof Douglas Rees ve Prof Rob Phillips (Caltech) teşekkür etmek istiyorum.

1. Lipozom preparatı <ol><li> Bir Teflon astarlı kapakla bir 20 ml bir cam şişe al. </li><li> Bulaşmasını önlemek için kullanmadan önce kloroform ile tüm cam ve şırıngalar temizleyin. </li><li> Bir 250 uL hava geçirmez bir cam şırınga kullanılarak bir cam şişeye saflıkta kloroform 100 uL transfer edin. </li><li> Bir 100 uL hava geçirmez bir cam şırınga kullanılarak aynı cam şişeye tepkin madde gradlı metanol 30 uL ekleyin. </li><li> Fosfatidiletanolamin (POPE): a 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatidilkolin (POPC) hazırlamak için kolesterol lipid çözeltisi, 11 mg / mL &#39;lik 10 mg / mL Pope ve 20 ul uL 10 mg / mL POPC, 42 ve 216 uL transferi 20 ml bir cam şişeye CHCl3 kolesterol çözümler. </li><li> Lipit ince bir film şişeye altındaki gözlenene kadar yavaş akış argon veya nitrojen gazı ile organik çözücüler buharlaşır. </li><li> Artık çözücü kaldırmak için, en azından 30 dakika boyunca bir vakumlu kurutucuda kapağını açıp cam şişeye yerleştirin. </li><li> Trtamponu ansfer 2 mL, daha önce hidrat lipidler için bir cam şişeye, bir 0.2 mikron filtreden geçirilir. </li><li> 4 ° C de bir gece azından karışımı inkübe ve 48 saat içinde kullanımı. </li></ol> 2. Freeze-ve-çözülme: 30 Lipozom Ölçüler de - 100 nm Sadece <ol><li> 15 saniye boyunca sıvı nitrojen içinde lipozom süspansiyon dondurun. </li><li> 42 bir ısıtma bloğu kullanarak lipozom süspansiyon çözülme ° ~ 3 dakika C sıcaklık. </li><li> 5 döngü toplam adımları 2.1 ve 2.2 tekrarlayın. </li></ol> 3. Ekstrüzyon Doğru kendilerine rehber kitapta enstrüman anahat kullanarak, Liposofast LF-50 ekstruder monte Avestin yönergeleri izleyin. <ol><li> Destek filtre tabanında büyük bir delik destek ekranı (dairesel delik ile) yerleştirin, dairesel sinterlenmiş çanağı (deliksiz), bir dren disk (çapı 25 mm), bir polikarbonat membran (çapı 25 mm) izledi. </li><li> Küçük, siyah koyunDestek filtre tabanına sabitlemek için membran üstündeki O-ring. </li><li> 4 deliklere 4 vidayı sıkarak üst filtre ekstruder takın. </li><li> Büyük ekstruder varil altındaki üzere filtre ekstruder birimi birleştirin. Silindir namluya lipozom çözüm ekleyin. Için ekstrüzyon varil üzerinde aşağıdaki yerleştirin: büyük dairesel O-ring, dar kap, büyük dairesel O-ring, dairesel kap. </li><li> Ekstruder varil başına gaz regülatörü takın ve basınç tahliye vanası dahil olmak üzere hava kaçağı önlemek için tüm vanaları kapatın. Bir 20 ml bir cam şişe ya ekstruder filtre ünitesi altında 50 ml Erlenmeyer şişesinde yerleştirin. Bir emniyet valfi regülatör bağlı ve 600 psi basınç aşarsa yayınlayacak. Azot gazı açın ve ekstruder bağlı gaz vanasını açın. </li><li> Azot basıncı 400 nm lipozomlar, 100 nm lipozomlar için 125 psi ve 30 nm lipozomlar için 400-500 psi 25 psi artırın. </li><li> Lipozom süspansiyon izlemeknitrojen ile itilerek edilirken ension bu kap içine çıkarır gibi. Artık cam şişe içinde ekstruder filtresi aracılığıyla herhangi bir sıvı geçen gözlemlemek kadar azot akan tutun. </li></ol> 4. Dinamik ışık saçılımı (DLS) Analizi <ol><li> Bir 20 uM lipozom solüsyonu 50 uL hazırlayın. </li><li> Güç kaynağı ve lamba kaynağı açın. </li><li> DynaPro yazılımını açın. </li><li> 30 nm ve 100 nm ve&gt; 100 nm lipozomlar tespit MS800 algoritma modeli lipozomlar algılamak için MS / X algoritma modeli için yazılım ayarlayın. </li><li> Donanım bağlanın. </li><li> Hücre tutucusu içine kuvars küvet ve yerleştirmeye lipozom numunesi pipetleyin 14 uL. </li><li> Başlatmak basın. </li><li> 30 satın alma - ~ 20 sonra durması basın. </li><li> Histogram kaydedilen ortalama lipozom çapı zirveleri analiz edin. </li></ol> 5.. Takip nanoparçacık Analizi (NTA) <ol><li> Bir 500 uL, 0.1 uM lipozom hazırlamakçözüm. </li><li> Su ve etanol ile örnek bölmesi çalkalayın. </li><li> Bir tüy bırakmayan kağıt havlu ile örnek bölmesi kurulayın. </li><li> Lazer güç kaynağı ve bilgisayarı açın. </li><li> Örnek bölmesine 0.1 uM lipozom çözüm 300 uL sunun. </li><li> Sıcaklık kontrolü ve Nanopartikül Takip Analiz yazılımı açın. </li><li> Lazer açmak için düğmeye Yakalama basın. </li><li> Sahne taşımak ve mikroskop odağı ayarlamak için yatay ve dikey ayarlamaları kullanın. </li><li> Istenilen sıcaklığa (20 ° C) ve kayıt süresi (en az 30 saniye) ayarlayın. </li><li> Zaman belirli bir miktar için lipozom parçacıkların birden fazla resim çerçeveleri çekmek için Kaydet düğmesine basın. Her parçacığın hareket izler olarak histogram üzerine çapı lipozom boyutları karşılık gelen tepe analiz. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Ekstrüzyon yöntemi özetleyen bir şema, pŞekil 1 &#39;de temsil edilir. , En iyi sonuçlar elde 30 nm çaplı lipozomlar hazırlanması ~ 500 psi ve 100 nm çaplı bir yüksek basınç gerektirir hızlı bir filtre hızı elde etmek için 125 psi&#39;lik bir basınçta gerektirir. 400 nm çaplar için, ~ 25 psi arasında bir alçak basınç kesecikler daha büyük, daha homojen bir lipozom uzamasına ve oluşturmasına izin veren yavaş filtre oranının elde edilmesi tavsiye edilir. Biz tutarlı mikronaltı vezikül boyutları üretmek için optimal basınç belirlemek için bir dizi deney gerçekleştirdi. Biz basıncı gibi ekstrüzyon gözenek 30 ebatlarında, 100 ve 400 nm ile polikarbonat filtrelerden geçer sayısı çeşitlidir ve her istenilen boyutu için uygun basınç keşfetti. 30 nm gözenekler için 500 psi basınç altında uzama ve böylece daha büyük vezikül boyutları neden akış hızı azaltacaktır. 100 nm gözenekler için, sürekli bir akış 125 psi sağlandı. 400 nm gözenekler için, düşük basınçlı (25 psi) veziküller daha büyük vezikül s içine uzamasına izin verirsimgelediği kabul edilir. Yavaş açılan bilge filtrasyon akışı büyük mikronaltı veziküller 13 oluşturmak için en uygunudur. Biz üç farklı çapta, yani 30, 100 ve 400 nm ile ekstrüde lipozom boyutlarını belirlemek için DLS yapıldı. DLS partikül çapı belirlemek için saçılan ışık toplayan oluşturulmuş bir yöntemdir. Filtre gözenek ile 5 pas ve 2 ile 25 psi az 400 nm polikarbonat membran ile 125 psi 100 nm polikarbonat membran, filtre gözenek 5 ile geçer ile 500 psi bir polikarbonat 30 nm zarından 2 mM Biz ekstrüde hidrate lipozomlar Filtre gözenek geçer. 30, 100 ve 400 nm gözenek boyutları için lipozomlar ve DLS ile ölçülen çapları 66 ± 28, 138 ± 18 ve 360 ± 25 nm (Şekil 2). Bu 47 çapı 16 nm ± kaydedildi Şekil 2, gösterildiği gibi, 50 nm polistiren boncuklar bir süspansiyon, bir kalibrasyon, standart olarak kullanıldı. Yüzde polydispersity lipozom boyutları içinde herhangi bir örtüşme olmadığını göstermektedir. Bu cihaz daha büyük parçacıklar 12 doğru var bilinen önyargı nedeniyle DLS analizi kullanırken 30 nm daha yüksek çapları gözlemlemek için tipiktir. Büyük ve küçük parçacıklar ışık saçılımı şiddetlerde süspansiyon 12 lipozomlar çözmek için bir algılama yöntemi aynı anda toplanan ve böylece daha sert edilir. Bu enstrümantal sınırlamaya rağmen, kalibrasyon eğrisi yakın bir doğrusal ilişki açıklanır. NTA parçacık kırılma indisi veya yoğunluk bağımsız bir sıvı ortam, difüzyon doğrudan gözlemler her parçacığın boyutu ölçen yeni bir teknolojidir. Bu, yüksek çözünürlükte tekniği ile DLS lipozomlar ölçümü takviye etmek için kullanılabilir. NTA kalibrasyon için kullanılan 95 çapları ± 48 ve 356 ± 51 nm, iki adet 100 nm ve 400 nm polistiren çözümler kaydetti. 30 nm ve 100 nm Lipid çözümleri daha comp kaldığı görüldü<html> olarak ortalama 29 boyutları ± 14, 95 ± 17 ve 359 ± 73 nm üreten, Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi DLS göre işlenebilir çapı. 1000 nm - NTA duyarlılığını o 50 parçacıkları ölçmek için sağlar yana mikroskobik partikülleri ölçmek için daha genel bir karakterizasyon tekniği olabilir. Kalibrasyon eğrisi kaydedilen NTA çapı karşı polikarbonat membran gözenekleri arasında doğrusal bir ilişki gösterir. <table border="1"><tbody><tr><td> Lipozom Boyutları </td><td> Algılama Eşiği </td><td> Beklenen Minimum Partikül Boyutu (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Nanosight Parametreler. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Açıklayan ekstrüzyon yöntemi akış şeması, baskının nasıl ve azot akış farklı lipozom çaplarda homojenliği kontrol eder. Lipozom hidrasyonu takiben, farklı boyutlarda tek lamelli kesecikler farklı basınçlarda farklı polikarbonat membran filtreden gözenekler aracılığıyla uzatılır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Şekil 2. Ekstrüzyon sonrası kantitatif lipozom boyutlarını açıklayan Dinamik ışık saçılımı (DLS) verileri. (A) Bar grafikler üç lipozom örnekleri arasında çapı tarif etmek için gösterilmiştir. 50 nm polistiren (PS) boncuk bir kalibrasyon standart bir referans olarak kullanılmıştır. Ortalama çapı lipozom her bir örnek için çubuğu yukarıda belirtilmiştir. X-ekseni çözümlerle haddelenmiş olduğu üzere gözenek boyutları açıklanmaktadır. Y-ekseni DLS tarafından kaydedilen çapı açıklanmaktadır. Rağmen 30 nm ve 100 nm boyutları rekorbüyük 400 nm boyutu biraz daha düşük bir boyutu kaydedildi ederken ed kendi gözenek boyutları daha yüksek değerleri, kalibrasyon eğrisi (b) x-ekseni polikarbonat membran gözenek boyutları ifade yakın bir lineer korelasyon gösterir ve y-ekseni tarif DLS tarafından lipozom çapı kaydedildi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Ekstrüzyon takiben lipozom boyutları tarif Şekil 3. Nanopartikül Takip Analizi (NTA) veri. (A), her çubuk grafik lipozom örneğin çapı temsil eder. X-ekseni çözümlerle haddelenmiş olduğu üzere gözenek boyutları açıklanmaktadır. Y-ekseni NTA tarafından kaydedilen çapı açıklanmaktadır. Ortalama çapı lipozom her numune yukarıda etiketlenmiştir. (B) NTA kalibrasyon eğrisi kaydedildi çapına karşılık filtre zarı gözenek boyutları arasındaki DLS kalibrasyon eğrisi daha doğrusal bir ilişki gösterir. X-ekseni polikarbonat membran gözenek boyutları açıklar. Y-ekseni NTA tarafından kaydedilen lipozom çapı açıklanmaktadır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Şekil 4. Ekstrüzyon ardından her lipozom boyutu (500 uM) gösteren Negatif leke transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüler. Su içinde% 1 uranil asetat öncesinde 34.000 × büyütmede kurutma ve görüntüleme için örnekler leke kullanılan nerede Karbon Formvar örgü ızgaralar olumsuz örnek boyamadan önce taburcu edildi. Boyutları 30, 100 ve 400 nm açık bir şekilde birbirinden farklıdır. Büyütme 25.000 × ayarlandı. Ölçek çubuğu 0,5 mikron temsil eder. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Şekil 5. Bir zaman elbette deneyi üç lipozom boyutları ile yapılmıştır. Dinamik ışık saçılımı (DLS) her lipozom çözelti hemen aşağıdaki ekstrüzyon için ölçüldü. Bütün lipozom çözümler 4 bekletildi °C de bir gece. Bunların çapları bir gece inkübasyondan sonra DLS tarafından kaydedildi. Hiç değişiklik 16 saat inkübasyon döneminden sonra gözlenmiştir.

<ol><li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes%3A+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li>
<li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li>
<li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca%282%2B%29-regulated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li>
<li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li>
<li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li>
<li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+polymorphism%3A+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li>
<li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li>
<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li>
<li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li>
<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li>
<li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li>
<li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li>
<li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Avestin Liposofast LF-50 Extruder kullanarak, ne kadar küçük ölçekli, sentetik lipozomlar bir basınç kontrol sistemi ile hazırlanmıştır gösterdi. Bu multilamellar veziküller küçük nanopartiküllerin üretimine yol açabilir lipozom hidrasyon, sonrasında kendiliğinden oluşması dikkat etmek önemlidir. Bu küçük multilamellar veziküller kaçınılmaz olarak büyük bir filtre gözenek tarafından üretilen ünilamellar veziküllerin çözümleri heterojenite neden büyük polikarbonat membran gözenek boyutu akacaktır. Bu nedenle, homojen art...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02.432-25ml </td><td> % 95 stabilizatörler </td></tr><tr><td> Yüksek Dereceli Metanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179.337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 Extruder </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipidler </td><td> Avanti Polar Lipidler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polikarbonat Gözenekler </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td> 25 mm çapında </td></tr><tr><td> Diskler PE boşaltın </td><td> Avestin, Inc </td><td> 230600 </td><td> 25 mm çapında </td></tr></tbody></table>

nano ölçekli lipid vesiküller hazırlanması için sabit basınç kontrollü ekstrüzyon yöntemi

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Lipozomlar, yaygın olarak protein-protein, protein-lipid etkileşimler 3, monitör ilaç teslim 4,5, ve kapsülleme 4 platformun çalışmak için taklit eden bir hücre membranı olarak kullanılan doğal ve sentetik fosfolipidler oluşan yapay olarak hazırlanmış kesecikler vardır. Fosfolipidler doğal bir misel kendisini ayıran, kavisli lipid bilayers oluşturun. 6 Lipozomlar geleneksel bilayers, yani büyük tek lamelli kesecikler (luvs), küçük tek lamelli kesecikler (SUV) ve multilamellar veziküller (MLVs) 7 büyüklüğü ve sayısına göre sınıflandırılır. Özellikle, çeşitli boyutlarda homojen lipozomlar hazırlanması endo-ve ekzositoz olayları, membran füzyon ve protein trafiğini 8, hücre sinyal hayati bir rol oynar membran eğrilik eğitim için önemlidir. 400 - Birçok grup proteinleri membran eğrilik içerir ve bu nedenle çapları lipozomlar hazırlamak süreçleri &lt;100 modüle kullanılır nasıl analizhücre fonksiyonlarını 3 davranışlarını incelemek için Nm. Diğer araçların ilgi 9 uyuşturucu taşımak ve teslim gibi lipozomlar okuyan, lipozom-ilaç kapsülleme odaklanın. Lipozom oluşumu sırasında 9 bildirildiği gibi, Drug kapsülleme elde edilebilir. Bizim ekstrüzyon adım iki nedenden dolayı kapsüllü ilaç etkilememesi gerektiğini, yani (1) ilaç kapsülleme bu adımı önce elde edilmelidir ve (2) lipozomlar güvenli sulu çekirdek ilaç taşıyan, doğal biyofiziksel istikrarı muhafaza etmelidir. Bu araştırma hedeflerini daha istikrarlı mikronaltı lipid veziküller tasarlamak için optimize edilmiş bir yöntem olan ihtiyacı göstermektedir. Bununla birlikte, mevcut lipozom hazırlama teknolojileri (sonication 10, donma ve çözülme-10, sedimantasyon) biyofiziksel sınırlar yüksek tutarlılık ve verimlilik 10,5 ile oldukça eğimli (yani çapı &lt;100 nm) lipozomlar hazırlanmasına izin vermez Bir emergi çalışmalarımembran eğrilik algılama ng alanı. Bu yazıda, biyolojik ilgili lipozomlar çeşitli için sağlam bir hazırlama yöntemi sunuyoruz. Gaz sızdırmaz şırıngalar ve polikarbonat membran 10,5 kullanarak Manuel ekstrüzyon yaygın bir uygulamadır ama gözenek boyutları uygulanan manuel basınç değişkenliği nedeniyle nedeniyle &lt;100 nm kullanırken heterojenite sık görülmektedir. Biz, çapları 30 ile 400 nm arasında değişmektedir sentetik lipozomlar hazırlamak için sabit bir basınç kontrollü ekstrüzyon cihazları istihdam. Dinamik ışık saçılması (DLS) 10, 11 ve elektron mikroskopi nanoparçacık izleme analizi (NTA) 12 bizim protokolde tarif edildiği gibi, ticari polistiren (PS), bir kalibrasyon, standart olarak kullanıldı boncuklar ile, lipozom boyutları ölçmek için kullanılmıştır. Bir yakın doğrusal korelasyon bizim basınç kontrollü lipozom hazırlık yüksek sadakat gösteren, meslek gözenek boyutları ve deneysel olarak belirlenmiştir lipozomlar arasında anlamlı karşılandıdeme usulü. Ayrıca, bu yağ vesikül hazırlama yöntemi, çeşitli boyutlarda lipozom bağımsız olarak, genel olarak uygulanabilir olduğunu göstermiştir. Son olarak, biz de en fazla 16 saate kadar Hazırlanan bu lipozomlar stabil olduğu bir zaman ders çalışmada gösterilmiştir. A temsilcisi nano boyutlu lipozom hazırlık protokolü aşağıda gösterilmiştir.

Bu protokol, homojen bir yüksek derecede mikronaltı boyutlarda lipid kesecikler hazırlanması için bir çekme yöntemi açıklar. Bu yöntem, lipozom preparatı için kontrollü bir nitrojen akışı hızları ile bir basınç kontrol sistemi kullanır. Lipid hazırlanışını<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Lipozom ekstrüzyon ve boyutu karakterizasyonu burada sunulacaktır.

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Lipozomlar, hücre membranını taklit eden bir platform olarak yaygın şekilde kullanılan, doğal ve sentetik fosfolipidlerden oluşan yapay olarak hazırlanmış veziküllerdir...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyolojik olarak ilgili lipid veziküller için sağlam bir hazırlama yöntemi sunmaktır. Bu işlem, fosfolipidlerin cam şişelerde karıştırılıp aktarılması ve çok lamelli bir SLE süspansiyonu oluşturmak için sulu tamponla hidrate edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, çok lamelli veziküllerden tek lamelli veziküllerin üretilmesiyle sonuçlanan bir dondurma ve çözdürme yöntemi uygulanır.Ardından, istenen boyutta homojen lipid veziküller üretmek için lipozom süspansiyonu, belirlenen optimal basınç kullanılarak bir ekstrüderden geçirilir. Dinamik ışık saçılması ve nanoparçacık izleme analizine dayalı olarak, tutarlı alt mikron vezikül boyutları elde edilmiştir. Bu tekniğin sonikasyon ve sedimentasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, verimli lipid vezikül boyutu hazırlama işlemi için optimal olarak belirlenmiş azot akış hızlerine sahip bir basınç kontrol sistemi kullanmasıdır.Bu prosedüre başlamak için, Teflon kapaklı 20 mililitrelik bir cam şişe temin edin; kontaminasyonu önlemek için kullanmadan önce tüm cam malzemeleri ve şırıngaları kloroform ile temizleyin. 250 mikrolitrelik hava sızdırmaz bir cam şırınga kullanarak cam şişeye 100 mikrolitre ayırıcı kalitede kloroform aktarın. 100 mikrolitrelik hava sızdırmaz bir cam şırınga kullanarak aynı cam şişeye 30 mikrolitre ayırıcı kalitede metanol ekleyin.216 µL 10 mg/mL Pop C, 42 µL 10 mg/mL Pop E ve 20 µL 11 mg/mL kolesterol solüsyonlarını 20 mL'lik cam şişeye aktararak iki milimolar Pop C-Pop E-kolesterol lipid solüsyonu hazırlayın. Şişenin dibinde ince bir lipid tabakası gözlemlenene kadar organik çözücüleri yavaş akışlı argon veya azot gazı kullanarak uçurun; kapağı açık cam şişeyi en az 30 dakika boyunca vakumlu desikatöre yerleştirin.Kalıntı çözücüyü uzaklaştırmak için, daha önce 0,2 mikronluk filtreden geçirilmiş iki mililitre tamponu lipidleri hidrat etmek üzere cam şişeye aktarın. Karışımı dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin ve 30 ila 100 nanometre lipozom boyutları için 48 saat içinde kullanın. Lipozom süspansiyonunu sıvı nitrojen içerisinde 15 saniye boyunca dondurun.Ardından, lipozom süspansiyonunu bir ısıtma bloğu kullanarak 42 °C'de yaklaşık üç dakika boyunca çözdürün. Dondurma-çözdürme işlemini toplam beş döngü olacak şekilde tekrarlayın. Dondurma ve ardından çözdürme işlemi, çok katmanlı veziküllerden tek katmanlı veziküller oluşturur ve ekstrüzyon sırasında lipid hapsetme verimliliğini artırır.Ardından, Lipo-so-fast LF 50 ekstrüderi dikkatlice monte etmek için Avastin talimatlarını izleyerek ekstrüzyon hazırlıklarını yapın. Azot sızıntısını önlemek için doğru montaj kritik önem taşır; çünkü sızıntı, istenen akış hızlarını etkiler. Başarıyı sağlamak için aşağıdaki adımları dikkatle uygulayın.Hava sızdırmaz bir conta oluşturmak için; önce geniş delikli destek süzgecini destek filtre tabanına yerleştirin, ardından dairesel merkez tepsisini, bir adet drenaj diskini ve bir adet polikarbonat membranı ekleyin. Küçük siyah O-ringi membranın üzerine yerleştirin ve destek filtre tabanına sabitleyin.Dört karşılık gelen deliğe dört vidayı sıkarak üst filtre ekstrüderini takın. Filtre ekstrüder ünitesini büyük ekstrüder namlusunun altına monte edin. Ekstrüzyon namlusunun üzerindeki silindir namluya lipozom çözeltisini ekleyin.Büyük dairesel bir O-ring, dar kapak, büyük dairesel O-ring ve dairesel kapak yerleştirin. Gaz regülatörünü ekstrüder namlusunun üst kısmına takın ve basınç tahliye valvi dahil tüm valfleri hava sızıntısını önlemek için kapatın. Ekstrüder filtre ünitesinin altına 20 mililitrelik bir cam şişe veya 50 mililitrelik bir erlenmeyer flask yerleştirin.Regülatöre bir emniyet valfi bağlıdır ve basınç 600 PSI değerini aşarsa tahliye sağlayacaktır. Azot gazını açarım ve ekstrüdere bağlı gaz valfini açarım. Azot basıncını, 400 nanometre lipozomlar için 25 PSI'ye, 100 nanometre lipozomlar için 125 PSI'ye ve 30 nanometre lipozomlar için 400 ila 500 PSI'ye yükseltirim. Lipozom süspansiyonu, azot tarafından itilerek kaba boşalana kadar izlenir.Sıvı gözlemlenmeyene kadar azot akışını sürdürün. DLS analizi yapmak için ekstrüder filtresinden cam tüpe geçirin. İlk olarak, fosfat tamponlu salin veya PBS içinde seyreltilmiş 20 micromolar'lık lipozom çözeltisinden 50 microliter hazırlayın.Ardından güç kaynağını ve lamba kaynağını açın. Dynapro yazılımını açma işlemine geçin. Yazılımı, istenen boyuttaki lipozomları tespit etmek için uygun algoritma modeline ayarlayın.Donanıma bağlandıktan sonra, kuartz küvete 14 µL lipozom örneği pipetleyin ve hücre tutucuya yerleştirin; başlat düğmesine basın, yaklaşık 20 ila 30 veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra durdur düğmesine basın. Histogramda kaydedilen ortalama lipozom çapı piklerini analiz edin. Nanopartikül izleme analizi, PBS içerisinde çözünmüş 500 µL 0.1 µM lipozom çözeltisinin hazırlanmasıyla başlar; örnek bölmesini su ve etanol ile durulayın.Ardından örnek bölmesini tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile kurulayın. Lazer güç kaynağını ve bilgisayarı açarak örnek bölmesine 300 µL 0.1 M lipozom çözeltisi aktarın. Sıcaklık kontrolünü ve nanoparçacık izleme analizi yazılımını açın.Lazeri açmak için yakalama düğmesine basın. Sahneyi hareket ettirmek ve mikroskop odağını ayarlamak için yatay ve dikey ayarları kullanın. İstenen sıcaklığı ve kayıt süresini ayarlayın.Belirlenen bir süre boyunca lipozom partiküllerinin birden fazla görüntü karesini yakalamak için kayıt düğmesine basın. Her bir partikülün hareketini takip eden histogram üzerindeki lipozom çap boyutlarına karşılık gelen pikleri analiz edin. DLS, partikül çapını belirlemek için saçılan ışığı toplayan yerleşik bir yöntemdir ve lipozom boyutlarını belirlemek için uygulanmıştır.Hidrate lipozomlar, yazılı protokolde açıklandığı üzere çeşitli boyutlarda ve basınçlarda polikarbonat membranlardan ekstrüde edildi. DLS ile ölçülen lipozom çapları, 30 nanometre gözenek boyutu için 66 ± 28 nanometre idi. 100 nanometre gözenek boyutu için 138 ± 80 nanometre ve 400 nanometre gözenek boyutu için 360 ± 25 nanometre idi.Kalibrasyon standardı olarak 50 nanometrelik cilalanmış Irene boncuklarının bir süspansiyonu kullanılmış ve 47 ± 16 nanometre çap kaydedilmiştir. Polidispersite yüzdesi, lipozom boyutları arasında bir örtüşme olmadığını göstermektedir. DLS analizinde, bu cihazın büyük parçacıklara karşı sahip olduğu bilinen eğilim nedeniyle 30 nanometreden daha büyük çapların gözlemlenmesi tipiktir.Bu enstrümantal kısıtlamaya rağmen, kalibrasyon eğrisi doğrusal bir korelasyon tanımlamaktadır. Nanopartikül takip analizi, parçacık kırılma indisi veya yoğunluğundan bağımsız olarak, sıvı bir ortamdaki difüzyonun doğrudan gözlemlerinden yola çıkarak her bir parçacığın boyutunu ölçen yeni bir teknolojidir. Bu yüksek çözünürlüklü teknik, lipozomların DLS ile yapılan ölçümlerini tamamlamak için kullanılabilir; kalibrasyon için kullanılan iki adet 100 nanometre ve 400 nanometre polistiren çözeltisi için NTA tarafından kaydedilen çaplar sırasıyla 95 ± 48 nanometre ve 356 ± 51 nanometredir.Lipid çözeltileri, DLS ile karşılaştırılabilir çaplara sahiptir ve 30 nanometre gözenek boyutu için 29 ± 14 nanometre, 100 nanometre gözenek boyutu için 95 ± 17 nanometre ve 400 nanometre gözenek boyutu için 359 ± 73 nanometre ortalama boyutlar üretmektedir. NTA, duyarlılığı 50 ila 1000 nanometre arasındaki partiküllerin ölçülmesine olanak tanıdığı için mikroskobik partikülleri nicelendirmek adına daha genel bir karakterizasyon tekniği olabilir. Kalibrasyon eğrisi, polikarbonat membran gözenekleri ile kaydedilen NTA çapı arasında doğrusal bir korelasyon göstermektedir. Negatif boyama iletim elektron mikroskobu görüntüleri, ekstrüzyon sonrası 3, 100 ve 400 nanometre olan her bir lipozom boyutunun birbirinden açıkça farklı olduğunu göstermektedir.Büyütme 25.000 kat olarak ayarlanmış olup ölçek çubuğu 0,5 mikronu temsil etmektedir. Üç farklı lipozom boyutu ile bir zaman seyri deneyi yürütülmüştür. Ekstrüzyonun hemen ardından her bir lipozom çözeltisi için DLS ölçümü yapılmıştır.Tüm lipozom çözeltileri dört derece Celsius'ta gece boyunca saklanmıştır. Gece boyu süren inkübasyonun ardından çapları DLS ile tekrar kaydedilmiştir. 60 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra çok az değişim gözlemlenmiş veya hiç değişim gözlemlenmemiştir. Bu prosedür uygulanırken, ekstrüzyon filtresinden birden fazla kez geçirilmenin vezikül çözeltisi homojenliğini artıracağını unutmamak önemlidir.Ayrıca, kloroformun polipropilen tüplerden sızıntı yapması sonucu oluşabilecek kontaminasyonu önlemek için numune hazırlama aşamasında cam vialler ve şırıngalar kullandığınızdan emin olun.

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biyokimyasal olarak tanımlanmış büyük tek tabakalı veziküller (LUV'ler), BCL-2 ailesi etkileşimlerini analiz etmek için uygun bir model sistemdir ve apoptozun mitokondriyal yolunun daha iyi anlaşılmasında doğrudan etkileri vardır. LUV üretme yöntemiyle birlikte, LUV permeabilizasyonunu incelemek için standart BCL-2 ailesi protein kombinasyonları ve kontroller sunulmaktadır.

Büyük ünilamellar Veziküller ile incelenmesi BCL-2 Aile Fonksiyonu

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Lipozomlar tek Zincirli amphiphiles içeren, özellikle yağ asitleri, sergi farklı özellikleri nedeniyle tek zincir amphiphiles benzersiz kimyasal özelliklerini içeren bu diacylphospholipids göre. Burada hazırlık, arıtma ve kısmen oluşan lipozomlar kullanımı ya da bu amphiphiles bütün teknikleri açıklar.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Katı destekli, protein içermeyen, Çift fosfolipid bilayer membranlar (DLBM) karmaşık ve dinamik lipid nanotüp ağlara dönüştürülebilir ve endoplazmik retikulum 2D aşağıdan yukarıya modelleri olarak hizmet verebilir.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

Bu çalışmada nanopartikül karakterizasyonu takip nanoliposome hazırlık için ince lipid film yöntemi kullanılarak klasik hidrasyon açıklanır. A 47 kDa-hidrofilik ve küresel protein, tarin, başarıyla istikrarı artırmak için bir strateji olarak kapsüllenir, hızlı açıklık önlemek, ve kontrollü salınımı teşvik. Bu yöntem hidrofobik moleküllerkapsülasyonuna adapte edilebilir.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Protokolün amacı, dev veziküllerin membran mekanik özelliklerini mikropipet aspirasyonu ile güvenilir bir şekilde ölçmektir.

Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Bu makalede lipid membranlarının nötron spin eko (NSE) çalışmalarında örnek hazırlama, veri azaltma ve veri analizi protokolleri açıklanmaktadır. Lipitlerin judicious döteryum etiketlemesi, üzerinde hayati biyolojik süreçlerin meydana geldiği mezoskopik uzunluk ve zaman ölçeklerinde farklı membran dinamiklerine erişim sağlar.

Lipid Membran Dinamiği ve Membran-Protein Etkileşimleri için Benzersiz Bir Prob Olarak Nötron Spin Eko Spektroskopisi

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Öğrenin, sabit basınç kontrollü ekstrüzyon yöntemiyle nano ölçekli lipid veziküller hazırlamayı. Bu teknik, homojen boyut dağılımı sağlayarak lipozom üretiminde sonikasyon ve sedimentasyona üstün bir alternatif sunar.

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Daha fazla video keşfet