Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, adherent hücre tiplerini çeşitli Combinator mikroortamlardan oluşan bir koleksiyona paralel olarak maruz bırakarak, farklı mikroortamların hücresel fonksiyonlar üzerindeki etkilerini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle mikroortam protein karışımlarının absorbsiyonunu destekleyecek baskı substratlarının üretilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, tüy veya kapiler pin mikroarray baskı robotu kullanılarak ME dizileri basmak için kullanılan mikroortam protein ana plakaları hazırlanır.

Ardından, mikroçevresel proteinlerin ana plakaları hazırlanır. Daha sonra, hücre sayısını sınırlama seçeneği ile yapışkan hücreler ME dizisi üzerinde kültüre edilir. Elde edilen sonuçlar, immunofloresan analize dayanarak, farklı mikroçevrelerin diferansiyasyon veya proliferasyon gibi hücresel fonksiyonlar üzerindeki etkisini gösterir.

Bu yöntemle ilgili fikrimiz ilk olarak, doku mikroçevrelerinin insan hafıza kök hücresi kader kararları üzerindeki etkilerini nicelleştirmek istediğimizde ortaya çıktı, ancak in vivo çalışmanın imkansız olduğunu fark ettik. Geliştirilmiş olan bu yöntemin şu an hücre biyolojisi, araştırma ve ilaç keşfi alanlarında birçok uygulaması bulunmaktadır. PDMS; ucuz, hazırlanması kolay ve basımı kolay olduğu için daha sert dokuları taklit eden bir substrat olarak kullanılır.

Bununla birlikte, PDMS hidrofobikliği, PDMS ile çalışırken bazı hücre hatlarıyla uyumsuzluk yaratabilir. Lateks, PDMS polimerizasyonunu inhibe edebileceği için lateks içermeyen eldivenler kullanılmalıdır. İşleme başlamak için, tek kullanımlık plastik bir kapta SYLGARD 184 silikon elastomer bazını kürleme ajanı ile 10:1 oranında birleştirin ve ahşap veya plastik bir dil basacağı ile kuvvetlice karıştırın.

Ardından, karışımı oda sıcaklığındaki bir vakum çanında 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Şimdi, standart bir mikroskop lamını bir spin coater'ın hareketli vakum tablasına merkezleyin, karıştırdığınız elastomer polimerden 0,5 milliliters lam yüzeyinin merkezine damlatın ve 6,000 RPM hızda 60 saniye boyunca spin coating işlemi uygulayın. PDMS kaplı lamları 70 degrees Celsius sıcaklıkta dört saatten bir geceye kadar kürleyin.

Slaytlar, oda sıcaklığında hava sızdırmaz şekilde birkaç ay boyunca saklanabilir. PA, belirli bir aralıktaki daha yumuşak dokuları taklit edebilen bir hidrojellerdir; hücreler sadece hücre adezyonunu destekleyen proteinlerin bulunduğu bölgelere tutunacaktır. Slaytların sodyum hidroksit ile aşındırılmasıyla başlayın.

Slaytları 80 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğu üzerine yerleştirin. Her slaytın üzerine bir mililitre 0,1 normal sodyum hidroksit damlatın. PA'nın başarısız olmaması için tüm slayt yüzeyinin kaplandığından emin olun.

Sodyum hidroksidin buharlaşarak beyaz bir film tabakası bırakmasını sağlayın. Yüzey tamamen kaplanmamışsa bu işlemi tekrarlayın. Gerekirse lam, oda sıcaklığında birkaç gün boyunca saklanabilir.

Ardından, lamları bir çeker ocak içerisinde PES ile kaplayın. Lamları 15 mililitrelik bir kaba yerleştirin. Sodyum hidroksit ile aşındırılmış her bir lama 300 mikrolitre PES ekleyin.

APES'in sodyum hidroksit lamlar ile tam beş dakika boyunca reaksiyona girmesini sağlayın. Daha uzun süre tutmayın. Lamların her iki tarafındaki APES'i, deiyonize su ile iki ila üç kez iyice yıkayın.

Aksi takdirde, bir sonraki adımda lamlar üzerinde kahverengi bir çökelek oluşturacak şekilde oksitlenecektir. Şimdi, lam yüzeylerindeki tüm solüsyonları aspirasyonla her bir kaba çekin. 25 mililitre PBS içinde %0,5 glutaraldehit ekleyin.

Slaytları karanlıkta bekletin ve 30 dakika bekleyin. 30 dakika sonra, slayt yüzeyindeki tüm glutaraldehit çözeltisini aspire edin. Ardından, emici ve tüy bırakmayan kağıt kullanarak slaytları dikkatlice kurulayın.

Slaytlar, gerekirse oda sıcaklığında gece boyunca saklanabilir. PA karışımları hazırlandıktan ve gazı alındıktan sonra, polimerizasyonlarını yavaşlatmak için buz üzerine yerleştirin. Slaytları her bir buz üzerindeki karışıma hazırlamadan hemen önce, amonyum persülfat ve temid ekleyin ve bir pipet kullanarak beş ila 10 saniye boyunca titre edin.

Şimdi PA karışımını lam yüzeylerine pipetleyin. PA miktarı, gereken jel sertliğine göre değişiklik gösterir. Ardından, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için herhangi bir baskı uygulamadan, PA'nın üzerine cam lamel yerleştirin.

PA jelin iki saat boyunca polimerize olmasını bekleyin ve ardından lamelleri deiyonize su altında çıkarın. PA jel lamellerini geniş coplan kavanozlarda gece boyunca suyla yıkayın. Ertesi gün, reaktif olmayan akrilamidleri uzaklaştırmak için lamelleri PA jel tamamen sertleşene kadar kurutun.

Slaytlar daha sonra sızdırmaz bir slayt kutusunda bir ay boyunca dört °C'de saklanabilir. Başlamak için, iki odacıklı bir slayttaki basılı diziyi çevreleyecek şekilde plastik bir odacık yerleştirilir. Odacıkları çıkarın ve bir jilet yardımıyla ortadan ikiye kesin.

Bir haznenin kenarına ince bir şerit şeklinde akvaryum silikonu uygulamak için bir mililitrelik pipet ucu kullanın ve bunu bir Emmy dizisi yüzeyine bastırın. Silikonun dizinin herhangi bir özelliğine temas etmesinden kaçının. Kültür kuyucuklarının Emmy dizisine iyi tutunmasını sağlamak kritik öneme sahiptir; çünkü tam olarak tutunmamış kuyucuklar, hücrelerin yaygın ölümüne yol açabilen medya sızıntılarına neden olur.

PDMS kaplı lamlar için, her iki jel tipi için de lamları vakum altında %1'lik sulu Pluronic F 108 içinde 15 dakika inkübe ederek bloke edin; ardından dizileri, yıkama başına beş dakika olacak şekilde antibiyotikli hücre kültürü ortamı ile üç kez durulayın. Bu işlem, PA jelleri durumunda hücreler için toksik olabilen reaktif olmayan monomerleri uzaklaştırır. Üçüncü yıkamadan sonra, jelin yeniden hidrate olması için ortamda 30 dakika daha inkübe edilmesine izin verin.

Şimdi dört ila beş diziyi 15 santimetrelik steril bir Petri kabına yerleştirin. Kaba, ilgili hücrelerin uygulamaları için gerekli konsantrasyonda bulunduğu nihai ortam hacminin yarısını ekleyin. ME dizileri, kullanılan hücre tipinin korunması için uygun bir inkübatöre yerleştirilmelidir.

Gözlem yaparken, hücrelerin basılı yapılara üniform şekilde tutunup tutunmadığını her 15 ila 20 dakikada bir mikroskop altında kontrol edin. Tutunan ve yüzen hücreleri ayırt etmek için ME dizilerini nazikçe sallayın. Tutunma süresi değişkenlik gösterecektir ancak PA kodlu bir ME dizisinde genellikle iki saat içinde tamamlanır.

Yapışma doygunluğuna ulaşıldığında veya süre sınırı dolduğunda, bağlanmamış hücreleri aspire edin ve PDMS kaplı ME dizilerindeki kabı nihai hacme kadar doldurun. Besiyerinin tamamının uzaklaştırılması hücreleri öldürecektir. Bu nedenle, bu lamlar üzerindeki tüm besiyeri değişimleri için sırasıyla besiyeri hacminin yarısını değiştirin ve ardından kabı nihai hacme kadar doldurun.

Kültürleme, normal medya değişimleri ile birçok gün boyunca devam edebilir. Paraform, aldehit ve metanol aseton gibi yaygın fiksatifler Emmy dizi sistemleri ile uyumludur. PDMS kaplı ME dizileri boyanırken bile ıslak kalması gerektiğini unutmayın.

Boyanmış ME dizilerinin lamlarını hazırlamak için yarı hacim değiştirme tekniğine devam edin. Odacıkları çıkarmak için bir jilet kullanın ve flora kullanarak lamelleri yerleştirin. G proteini, bir tüy iğne üzerindeki kare uçlu silikon pinler kullanılarak basılı bir PDMS kodlu ME dizisine yerleştirilmiştir.

Mikrodiziler baskı robotunun çeşitli proteinleri depozisyonu, antikorlar kullanılarak immünofloresan ile doğrulanmıştır. Ana plaktaki protein solüsyonlarının dilüsyonları, baskı alt tabaka yüzeyine depozite edilen miktarı yansıtmaktaydı; hücreler, basılı özelliklere belirgin bir desenli biçimde tutunmuştur. Benzer şekilde, bir Emmy dizisi 40.000 geçiş ölçeğinde basıldığında da aynı belirgin hücre tutunma deseni ortaya çıkmaktadır.

PA jel iki mikroçevre proteini, insan multipotent meme epitelyal progenitör hücre hattında konsantrasyona bağlı keratin ekspresyon profilleri oluşturmuştur. Keratin 8 sinyallerinin keratin 14 sinyallerine olan log oranı, sinyalin varyasyonunu ve tekrarlanabilirliğini göstermektedir. 24 saatlik kültürün ardından, bağlanmamış hücreler yıkanarak uzaklaştırılır. 12 me dizisinin analizinde.

Tip 1 kolajenin farklı dilüsyonlarının ve rekombinant insan p-kaderinin keratin ekspresyonunda değişikliklere yol açıp açmadığını belirlemek için standart istatistiksel analizler kullanılmıştır. Başlangıçta, yapışmadan hemen sonra yüzeylerdeki hücreler arasında ortalamadan herhangi bir sapma görülmemiştir. Ancak, 24 saat sonra yüksek tip 1 kolajen konsantrasyonları, anlamlı derecede daha yüksek keratin 8 ekspresyonuna neden olmuştur.

Buna karşın, buradaki yüksek PCA konsantrasyonları güçlü bir keratin 14 sinyali oluşturmuştur. Bu bulgu, bipoten hafıza progenitor hücreleri hakkındaki önceki raporlarla tutarlıdır. Bu hücre mikroçevre etkileşimlerinin dinamik ve karşılıklı doğası nedeniyle, bu hücrelerin kendileri basılmış mikroçevrelerin bileşimini değiştirebilir.

Bu nedenle, bastığınız mikroortamların akut etkilerini anlamak için, bu prosedürün ardından maruz kalma süresi 48 saati geçmemelidir. Farklı mikroortamların kanser hatlarında ilaç yanıtlarını nasıl değiştirdiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla; floresan veya kolorimetrik olarak ölçülebilen her türlü teorik süreç, mikroortamın bir fonksiyonu olarak değerlendirilebilir. Bu durum, apoptoz ve proliferasyondaki değişiklikler üzerinden ölçülebilir.

Veya mikroçevrelerin progenitör farklılaşmasını nasıl değiştirdiği.