Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, onarıldıklarında floresan yayan moleküler beacon'lar kullanarak, DNA onarım hızlarını ve hücre çekirdeği ekstraktlarını gerçek zamanlı olarak ölçmektir. Temel eksizyon onarımı moleküler beacon'ları; beş prime uçlarına altı karbon oksiflorescein grupları ve üç prime uçlarına dil moti grupları konjuge edilmiş, tek bir baz lezyonu içeren sap-döngü yapısındaki deoksi oligonükleotidlerden oluşur. Altı fam grubu, Förster rezonans enerji transferi yoluyla dab sil tarafından floresan yaymayacak şekilde söndürülür.

DNA onarım aktivitesini değerlendirmek için, beaconlar onarım enzimleri içeren hücre çekirdek ekstraktları ile inkübe edilir. DNA glikozilatı tanınır ve beacon üzerindeki DNA lezyonu kaldırılır. Ortaya çıkan ABA bölgeleri, AP endonükleaz bir veya ape bir için substratlardır. Tanıma üzerine APE bir, ABA bölgesinde DNA omurgasını keserek, altı fam içeren DNA'nın saç tokasından serbestçe ayrılmasını sağlar.

Sönümleyiciden ayrılma, DNA onarım düzeyi ile orantılı bir floresans artışıyla sonuçlanır ve bu durum kantitatif gerçek zamanlı PCR cihazı kullanılarak gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilir. DNA hasarını onarma kapasitesi, her hücre ve her organizma için kritik öneme sahiptir. Çok sayıdaki hücresel DNA onarım yolu arasında, baz eksizyon onarımı, oksidatif veya kimyasal saldırılar sonucunda oluşabilecek hasarlı bazları hedefler; baz eksizyon onarımını etkileyebilecek bireysel hücresel elementlerin rolünü aydınlatmak, laboratuvar çalışmalarımızın temel amaçlarından biridir.

Bu nedenle, DNA onarım aktivitesinin doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesi laboratuvarımızın ilgi odağı haline gelmiştir. Bu analiz yöntemi söz konusu verileri sağlayabilmektedir. Bu tekniğin, 32 PN işaretlemesi ve jel elektroforezi ile analiz gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; tekniğimizin radyoaktif işaretli substratlar kullanmaması, DNA onarım hızlarını gerçek zamanlı olarak ölçebilmesi ve çok geniş bir dinamik aralığa sahip olmasıdır.

Ayrıca, bu yaklaşım, substrat özgüllüğünü belirlemek için birkaç farklı florofor ve/veya baz lezyonu kullanabilir. Bu analizin farklı ortamlarda oldukça kantitatif ve çok hassas olduğunu göstermiş bulunmaktayız. Bu baz eksizyon onarımı moleküler işaretçi analizi, kinetik analize uygundur.

Analizin yüksek hassasiyeti ve özgüllüğü, baz eksizyon onarımının doğru şekilde nicelendirilmesine olanak tanır ve bu nedenle onarım inhibitörü taramaları veya doğrulaması için faydalıdır. Ayrıca, DNA onarım aktivitesinin ölçülmesine ve fonksiyonel biyobelirteç ölçümleri için doku ve tümör hücresi lizatlarına uyarlanabilir. Bu analizde kullanılacak moleküler işaretçileri tasarlarken, burada gösterilen 43 baz uzunluğundaki şu DNA oligonükleotidlerini dikkate alın.

İyi çalışır. DNA dizisi benzersiz değildir, ancak bir saç tokası (hairpin) yapısının oluşumuna izin vermelidir. Burada gösterildiği gibi dizildiğinde, urasil veya tetrahidrofuran gibi spesifik baz lezyonlarının eklenmesiyle özgünlük sağlanır.

5' ucundan altı baz uzaklıkta X konumundaki GC içeriği en az %32 olmalı ve 5' uca bir GB bazı yerleştirilmemelidir. 5' uca altı karboksi floresein veya altı fam konjuge edilmeli ve 3' uç dab sil ile modifiye edilmelidir. Bu, glikozil liyazların bağlanmasını ve aktivitesini sağlamak için DNA onarım proteinleri için substrat görevi görecektir.

Lezyonun konumu, saç tokası yapısından ve DNA'nın sonundan yeterli boşluk sağlayacak şekilde seçilmiştir. Gövde veya saç tokası dubleksinin uzunluğu minimum 15 baz çifti olmalıdır. Önerilen loop uzunluğu 13 bazdır.

Kontrol moleküler feneri, bir DNA lezyonu içermemesi dışında deneysel moleküler fener ile aynı olmalıdır. Bu nedenle, DNA onarım enzimleri tarafından tanınmamalıdır. Moleküler fenerler elde edildikten sonra, fenerlerin ısıtılana kadar floresans yaymadığından emin olmak için kalite değerlendirmesi yapılmalıdır.

Optimal erime sıcaklığını belirlemek için, ekstraksiyon prosedürü sırasındaki tüm adımlar buz üzerinde veya dört derece Celsius'ta gerçekleştirilmelidir. Protein stabilitesini sağlamak için, ön soğutma yaparak deneye hazırlanın. Örnek başına iki adet bir litrelik beher, diyaliz tamponu, diyaliz odacıkları, mikro santrifüj tüpleri, şırıngalar ve iğneler.

15 mililitrelik konik tüpleri etiketleyin ve buz üzerine yerleştirin. Hücrelerdeki büyüme ortamını aspire edin ve ardından hücreleri iki kez 7,5 mililitre soğuk PBS ile yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, her bir kaba beş mililitre soğuk PBS ekleyin ve hücreleri plakadan sıyırmak için bir hücre sıyırıcı (cell lifter) kullanın.

Hücreleri soğutulmuş 15 mililitrelik konik tüpe aktarın, ardından 4 °C'de 500 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve benzer tüplerdeki bilinen sıvı hacimleri ile karşılaştırarak paketlenmiş hücre hacmini tahmin edin. Tüpleri bir dakika daha santrifüjleyin ve ardından kalan PBS'yi bir pipet yardımıyla uzaklaştırın.

Her 50 µL paketlenmiş hücre hacmi için 150 µL nuke buster ekstraksiyon reaktifi bir kullanarak hücre pelletini süspande edin. Ardından, resüspande edilen hücreleri önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve yüksek hızda 15 saniye boyunca vorteksleyin. Vortekslemeden sonra tüpü buz üzerinde beş dakika inkübe edin, ardından tekrar 15 saniye vorteksleyin ve 4 °C'de 13.000 ×g hızda beş dakika santrifüjleyin.

Santrifüj işleminin ardından, sitoplazmik fraksiyonu içeren süpernatanı uzaklaştırın ve atın. Paketlenmiş hücre hacminin her 50 µL'si için; 1 µL süspanse edilmiş 100 x proteaz inhibitör kokteyli, 1 µL 100 mM DTT ve 75 µL Nuke Buster ekstraksiyon reaktifi iki karışımı içerisinde peleti yeniden süspanse edin.

Hücreleri yüksek hızda 15 saniye boyunca vorteksleyin. Beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve tekrar 15 saniye yüksek hızda vorteksleyin; ardından 4 °C'de, 13.000 ×g kuvvetle beş dakika santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, nükleer proteinleri içeren süpernatanı 7.000 moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir slayt diyaliz kasetine aktarmak için şırınga kullanın.

Ardından, 500 mL önceden soğutulmuş diyaliz tamponuna 500 µL 1 M DTT ekleyin ve lizatı 4 °C'de, hafifçe karıştırarak 90 dakika boyunca diyalize edin. 90 dakika sonra, diyaliz kasetini DTT içeren 0,5 L önceden soğutulmuş diyaliz tamponu bulunan ikinci bir behere aktarın ve diyalize devam edin. Lizatı 4 °C'de, hafifçe karıştırarak 90 dakika boyunca diyalize edin; diyaliz sonrası yüksek protein konsantrasyonları nedeniyle ekstrakt kristalleşmiş olabilir.

Ardından, kaseti enjekte etmek için kullanılandan farklı bir porta yeni bir şırınga yerleştirin ve diyaliz kasetinden diyalize edilmiş nükleer protein solüsyonunu toplayın. Diyalize edilmiş nükleer protein solüsyonunu çekerken bulanık görünümlü kristalleri de dahil etmeye çalışın. Numuneyi her biri 20 µL olacak şekilde mikro santrifüj tüplerine paylaştırın, kuru buz üzerinde hızlıca dondurun ve ardından ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.

Eşlik eden belgede açıklandığı şekilde protein konsantrasyonunu belirleyin ve kalite kontrolünü gerçekleştirin. Moleküler beacon analizini yapmak için, hücre lizatlarını 1 mM DTT içeren temel eksize onarım reaksiyon tamponu ile protein başına mikrolitre başına iki mikrogram olacak şekilde çözdürün ve seyreltin; moleküler beaconları temel eksize onarım reaksiyon tamponu ile 200 µM seviyesine seyreltin. Kantitatif gerçek zamanlı PCR cihazı genellikle bir florimetre olarak kullanılmadığından, cihazdaki çalışma yöntemini 37 °C'de en az 180 döngü boyunca her 20 saniyede bir veri toplayacak şekilde değiştirin.

Ardından, normalizasyon için veri elde etmek amacıyla, moleküler beacon'ın maksimum floresan değerinde 15 döngü boyunca her 20 saniyede bir ölçüm yapın. Reaksiyon hacmini 25 µL olarak ayarlayın. Daha sonra, cihaz üzerindeki plaka tasarımını, deney tipi olarak standart eğri seçilmiş şekilde Applied Biosystems yazılımını kullanarak oluşturun ve plaka yerleşimini tamamlayın.

Bir örneğe, beraberindeki belgede de bulunabilen bu tabloda yer verilmiştir. Standart eğri olarak seçilen kuyucuğa hiçbir şey eklemeyin. Baz eksizyon onarım reaksiyon tamponu, DTT, mikrolitre başına iki mikrogram konsantrasyondaki hücre lizatı ve deneyde kullanılan tüm moleküler beaconları buz üzerine yerleştirin.

Ardından, DTT'yi temel eksizyon onarım reaksiyon tamponuna 1 mM final konsantrasyonuna ulaşacak şekilde ekleyin. Buz üzerinde, uyumlu bir optik qRT-PCR plağının her bir kuyucuğuna DTT içeren 15 µL temel eksizyon onarım reaksiyon tamponu pipetleyin. Sonrasında, plak düzenini takip ederek beaconları uygun kuyucuklara pipetleyin.

Lizat ve moleküler beacon veya kontrolün her kombinasyonu üç paralel örnek şeklinde analiz edilmelidir. Son olarak, seyreltilmiş nükleer lizattan her bir kuyucuğa beş mikrolitre pipetleyin. Tüm moleküler beacon reaktiflerini soğuk tutmanın ve lizatları plakaya eklemeyi son adım olarak gerçekleştirmenin önemli olduğunu unutmayın.

Unutmayın, lizatlar aktif proteinler içerir ve reaksiyon karışımına pipetlendikleri anda moleküler beacon'ları onarmaya başlayacaklardır. Bu nedenle, ölçümlere başlamadan önce meydana gelen beacon onarım miktarını minimize etmek için tüm reaktifleri soğuk tutmak çok önemlidir. Her şey eklendikten sonra, plakayı optik yapışkan filmle mühürleyin ve plakaya nazikçe vurarak karıştırın.

Ardından, çözeltileri tüplerin veya plakanın tabanında toplamak için santrifüj ile on saniyelik hızlı bir çevirme işlemi gerçekleştirin; çevirme işlemi bittikten sonra plakayı kantitatif gerçek zamanlı PCR cihazına yerleştirin ve analizi başlatın. İşlem tamamlandığında ham verileri tercihen Excel formatında dışa aktarın ve gerekli hesaplamalar yapıldıktan sonra verileri analiz etmek için beraberindeki belgede yer alan talimatları izleyin. LN 4 28 hücrelerinden ve LN 4 28 MPG olarak adlandırılan bir MPG aşırı ekspresyon hücre hattından elde edilen nükleer ekstraktların kalitesini ve DNA onarım aktivitesini değerlendirmek için, normalize edilmiş floresan verilerini, saniye cinsinden zamana karşı yüzde serbest fam şeklinde, ilgili hata paylarıyla birlikte bir saçılım grafiği olarak çizin. Bu videoda açıklanan analiz, pozitif kontrol olarak APE one substratı tetra furin içeren bir moleküler beacon kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Bu şekilde gösterildiği üzere, her iki hücre hattı da dik eğimle belirtilen güçlü APE1 aktivitesine ve MPG substratının uzaklaştırılmasına özgü DNA glikozilaz aktivitesine sahiptir. HX olarak belirtilen hipoksantin, her iki hücre hattının nükleer lizatlarında ölçülmüştür. Her bir lizat, ya temel bir baz eksizyon onarımı kontrol moleküler işaretçisi (molecular beacon) ya da bir baz eksizyon onarımı HX moleküler işaretçisi kullanılarak analiz edilmiştir; kontrol işaretçisi LN 4 28 yeşil renkte, hipo işaretçisi için ise LN 4 28 MPG mor renkte gösterilmiştir.

LN 4 28 mavi renkle ve LN 4 28 MPG turuncu renkle gösterilmiştir. Sonuçlar A ortalama floresans birimleri ve B normalize edilmiş floresans olarak rapor edilmiştir. Her bir hücrede, HX onarımının göstergesi olan zamana bağlı bir floresans artışı meydana gelmiştir.

Lizat, beklendiği üzere HX moleküler işaretçisi (molecular beacon) ile inkübe edildi. Turuncu iz ile belirtilen LN 4 28 MPG hücre hattı, minimal MPG proteinine sahip olan parental LN 4 28 hücre hattına kıyasla, floresansın daha hızlı birikmesiyle gösterildiği üzere çok daha yüksek bir onarım hızına sahipti. Böylece, spesifik onarım proteinleri tarafından gerçekleştirilen spesifik DNA lezyonlarının onarım hızı, hücre ekstraktlarından, spesifik olmayan DNA kesiminin minimal arka plan seviyelerinde olduğu gerçek zamanlı ölçümlerle belirlenebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, moleküler beacon'larınızı nasıl tasarlayacağınız ve saflaştırılmış proteinler veya hücre lizatlarını kullanarak gerçek zamanlı DNA onarım hızlarını nasıl ölçeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Analizle ilgili olarak, dinamik aralığı ve arka plan değerlerini değerlendirmek esastır; bunu pozitif ve negatif kontrol beacon'larının olduğu veya olmadığı kontrol reaksiyonlarını dahil ederek yapın. Kuyucuklar arası değişkenlik göz önüne alındığında, münferit kuyucuklardaki verileri giriş değerlerine göre normalize etmek faydalıdır.

Bunlar, erime sıcaklığındaki daha hassas adım tarafından belirlenir. Bu durum ve referans boya gibi diğer boyaların eklenmesi, pipetleme hatalarından veya dedektörlerdeki farklılıklardan kaynaklanan doğal değişkenliği karşılayacaktır. Bu teknik, tekil baz eksizyon onarım bileşenlerinin genel onarım aktivitesi ve kapasitesi üzerindeki etkisini açıklamamıza olanak sağlamıştır.

Geleneksel yöntemlerle tespit edilemeyecek kadar küçük değişiklikleri ortaya çıkarmak için yeterince hassastır.