Name: Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Öğrenin, moleküler beacon kullanarak hücre çekirdek lizatlarında DNA glikozilaz ve AP endonükleaz aktivitelerini gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu hassas analiz, baz eksizyon onarım kinetiğini kanser biyolojisi araştırmaları için nicel olarak değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RWS Bu çalışma Pittsburgh Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] hibe ile desteklenmiştir. UPCI lentiviral Tesis desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri Kanser Merkezi Destek Hibe tarafından RWS sağlanmıştır [P30 CA047904]. Destek aynı zamanda Pittsburgh Üniversitesi Farmakoloji Anabilim Dalı &amp; DS Kimya Biyoloji tarafından sağlandı. Destek de CV Estro tarafından sağlandı.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS Trevigen, Inc yazarların kalanı Çıkar çatışması olduğunu açıklamak üzere bir Bilimsel danışmanıdır.

Birçok molekül ve helikaz etkinliği 6, DNA polimeraz aktivitesi 7,8, DNA ligaz aktivitesi 9, telomeraz aktivitesi 10, DNA fotolizaz aktivitesi 11 ve DNA / dahil enzimatik faaliyetleri, tespit ve ölçülmesi için dönem &#39;moleküler feneri&#39; kullanarak 600 alıntılar üzerinde bulunmaktadır diğerleri arasında melez 12, RNA. Yukarıda listelenen DNA onarım faaliyetlerinin ölçümü için moleküler işaretçileri kullanımı yanı sıra, bu ve diğer BER aktivitesi <sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Potasyum Klorür </td><td> Balıkçı </td><td> P217-500 </td><td> Moleküler notu </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Balıkçı </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Balıkçı </td><td> BP229-1 </td><td> Moleküler notu </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Balıkçı </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Çözüm </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Tuz </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Potasyum hidroksit </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filtresi </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Diyaliz Ürünler </td><td> Delmek </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> Balıkçı </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Iğne </td><td> Balıkçı </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 05-408-129 </td><td> Siyah </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon Tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Ekstraksiyonu Kiti </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Moleküler İşaretleri </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad Protein boya deneyi yenidenajan konsantresi </td><td> BioRad </td><td> Katalog # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

lezyon özgü moleküler beacon kullanılması hücre lizatları ve base eksizyon onarımı faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı analizi

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Biz baz eksizyon tamiri (BER) moleküler işaretleri kullanarak DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Substrat (işaret) bir 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) 5&#39;end ve oligonükleotic&#39;ten 3 &#39;ucuna bir konjuge Dabcyl yarımına konjuge yarımı ile birlikte, tek bir baz ihtiva eden bir lezyonun deoxyoligonucleotide oluşur. BER moleküler işaret uzunluğu 43 bazlar ve sekansı kök 1,2 in halkası ve 15 baz çifti olarak 13 nükleotid ile birlikte bir kök döngülü yapısının oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır. Bu yapılandırmada, katlandığında 6-FAM yarımına Förster Rezonans enerji transferi (FRET) 3,4 yoluyla bir floresan olmayan bir şekilde Dabcyl ile söndürülmüştür. Lezyon 6-FAM parçası içeren kalan 5 baz oligonükleotid kök salınan şekilde aşağıdaki temel lezyon kaldırma ve iplik kesme konumlandırılmış. Bir serbest bırakınDNA onarım seviyesine orantılı floresans bir artış quencher (Dabcyl) sonuçları nd dekolmanı. Birden fazla toplayarak floresans değerlerinin okur, BER aktivitesinin gerçek zamanlı değerlendirmesi mümkündür. Standart kantitatif gerçek zamanlı PCR araçların kullanılması çok sayıda örnekleri arasında eşzamanlı analiz sağlar. Bu BER moleküler işaretlerinin tasarım, tek bir baz lezyonu olan, kinetik analizleri, BER ölçümü ve inhibitörü doğrulama mükellef ve doku ve tümör hücre lizatları DNA tamir aktivitesinin ölçümü için veya protein saflaştırılmış ile uyumludur. Bu moleküler işaretleri kullanarak tümör lizatları veya doku aspiratlarında BER faaliyet analizi fonksiyonel biyomarker ölçümü için geçerli olabilir. Dahası, bu niceliksel deneyi kullanılarak proteinleri ile saflaştırılmış BER aktivitesinin analizi BER inhibitörlerinin keşfi ve doğrulama için hızlı, yüksek verim bir yöntem sağlar.

Biz DNA glikozilaz ve hücre nükleer lizatları AP endonükleaz faaliyetlerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir metodu tanımlar. Tahlil kinetik analiz mükellef DNA Onarım faaliyet oranları verir ve doku ve tümör lizatları veya saflaştırılmış proteinler ile DNA tamir aktivitesinin ölçümü için uyarlanabilir.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

Baz ... kullanarak hücre çekirdek lizatlarında DNA glikozilaz ve AP endonükleaz aktivitelerinin kantitatif, gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem tanımlıyoruz.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, onarıldıklarında floresan yayan moleküler beacon'lar kullanarak, DNA onarım hızlarını ve hücre çekirdeği ekstraktlarını gerçek zamanlı olarak ölçmektir. Temel eksizyon onarımı moleküler beacon'ları; beş prime uçlarına altı karbon oksiflorescein grupları ve üç prime uçlarına dil moti grupları konjuge edilmiş, tek bir baz lezyonu içeren sap-döngü yapısındaki deoksi oligonükleotidlerden oluşur. Altı fam grubu, Förster rezonans enerji transferi yoluyla dab sil tarafından floresan yaymayacak şekilde söndürülür.DNA onarım aktivitesini değerlendirmek için, beaconlar onarım enzimleri içeren hücre çekirdek ekstraktları ile inkübe edilir. DNA glikozilatı tanınır ve beacon üzerindeki DNA lezyonu kaldırılır. Ortaya çıkan ABA bölgeleri, AP endonükleaz bir veya ape bir için substratlardır. Tanıma üzerine APE bir, ABA bölgesinde DNA omurgasını keserek, altı fam içeren DNA'nın saç tokasından serbestçe ayrılmasını sağlar.Sönümleyiciden ayrılma, DNA onarım düzeyi ile orantılı bir floresans artışıyla sonuçlanır ve bu durum kantitatif gerçek zamanlı PCR cihazı kullanılarak gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilir. DNA hasarını onarma kapasitesi, her hücre ve her organiz

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, tek moleküllü AFM görüntüleme yoluyla farklı DNA lezyon tanıma yaklaşımlarının incelenmesi, örnek olarak nükleotid eksizyon onarım sistemi ile gösterilmiştir. DNA ve protein numunesi hazırlama prosedürleri ve AFM deneyleri için deneysel ve analitik detaylar açıklanmaktadır.

Nükleotid Eksizyon Onarımında DNA Lezyon Tanınması için Atomik Kuvvet Mikroskopi Araştırmaları

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

Bu iletişim kuralı plazmid DNA üzerinde tanımlanmış DNA-protein Glossar tamiri ölçmek için hedeftir. Lesioned plazmid alıcı memeli hücre satırları ve düşük molekül ağırlığı birden çok kez puan sonrası transfection hasat içine transfected. DNA onarım Kinetik sayısal qPCR tarafından takip strand özgü astar uzantısı kullanma.

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Burada sunulan sgRNA / CAS9 endonükleaz ve CD4 promotörünün yakınındaki çift iplikçik kopması onarımı ile ilişkili mutasyonları tanımlamak için kullanılabilecek yeni nesil dizileme protokolüdür.

CD4 promotörünün yakınında CAS9 kaynaklı çift iplikçik kopmasının onarımıyla ilişkili mutasyonları tanımlamak için yeni nesil dizilemenin kullanılması

D-döngü yakalama (DLC) ve D-döngü uzatma (DLE) testleri, Saccharomyces cerevisiae'de indüklenebilir çift sarmallı bir kırılma yerinde D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve ürün oluşumunu ölçmek için kantitatif PCR ile birlikte yakınlık ligasyonu prensibini kullanır.

Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Bir dizi lüminesans tabanlı ekstrakromozomal raportör substrat kullanarak hücrelerde çift iplikli kopma onarım yolu yeterliliğinin değerlendirilmesi için protokoller sunuyoruz.

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Öğrenin, moleküler beacon kullanarak hücre çekirdek lizatlarında DNA glikozilaz ve AP endonükleaz aktivitelerini gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu hassas analiz, baz eksizyon onarım kinetiğini kanser biyolojisi araştırmaları için nicel olarak değerlendirir.

Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

Daha fazla video keşfet