Lezyon özgü Moleküler Beacon kullanılması Hücre lizatları ve Base Eksizyon Onarımı Faaliyet kantitatif, gerçek zamanlı Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, DNA onarım oranlarını ve hücre nükleer ekstraktlarını, tamir edildiklerinde floresan yayan moleküler işaretler kullanarak gerçek zamanlı olarak ölçmektir. Temel eksizyon onarım moleküler işaretleri, beş asal uca konjuge edilmiş altı eğri oksi floresein kısımları ve katlandığında üç asal uca konjuge dil moti ile tek bir baz lezyonu içeren bir gövde halka yapısında deoksi oligonükleotidlerden oluşur. Altı aile moty, forester rezonans enerji transferi yoluyla floresan olmayan bir şekilde dab sil ile söndürülür.

DNA onarım aktivitesini değerlendirmek için, işaretler, onarım enzimleri içeren hücre nükleer ekstraktları ile inkübe edilir. DNA Glikozilat tanınır ve işaretteki DNA lezyonunu çıkarır. Elde edilen ABA bölgeleri, AP endonükleaz bir veya maymun bir için substratlardır Tanındıktan sonra APE, ABA bölgesindeki DNA omurgasını böler ve altı aileyi içeren DNA'nın saç tokasından serbestçe ayrılmasına izin verir.

Söndürücüden ayrılma, DNA onarım seviyesiyle orantılı olan ve kantitatif bir gerçek zamanlı PCR makinesi kullanılarak gerçek zamanlı olarak değerlendirilebilen bir floresan artışına neden olur. DNA hasarını onarma kapasitesi her hücre ve her organizma için çok önemlidir. Çok sayıda hücresel DNA onarım yolağı, baz eksizyon onarım hedefleri, oksidatif veya kimyasal hakaretlerden kaynaklanabilecek hasarlı bazlar arasında, baz eksizyon onarımını etkileyebilecek bireysel hücresel elemanların rolünü aydınlatmak laboratuvar çalışmalarımızdaki ana hedeflerden biridir.

Bu nedenle, DNA onarım aktivitesini doğru ve hassas bir şekilde ölçmek, laboratuvarımızda bir ilgi alanı haline gelmiştir. Bu tahlil bu tür verileri sağlayabilir. Bu tekniğin 32 PN etiketleme ve jel elektroforezi ile analiz gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tekniğimizin radyoaktif etiketli substratlar kullanmaması, dary onarım oranlarını gerçek zamanlı olarak ölçebilmesi ve çok geniş bir dinamik aralığa sahip olmasıdır.

Ayrıca, bu yaklaşım, substrat özgüllüğünü belirlemek için birkaç farklı floro dörtlü ve/veya baz lezyonu kullanabilir. Bu testin farklı ortamlarda oldukça kantitatif ve çok hassas olduğunu gösterdik. Bu baz eksizyon onarım moleküler işaret testi kinetik analize uygundur.

Testin yüksek duyarlılığı ve özgüllüğü, doğru baz eksizyon onarım kantifikasyonuna izin verir ve bu nedenle onarım inhibitörü ekranları veya validasyonu için yararlıdır. Ek olarak, fonksiyonel biyobelirteç ölçümleri için dary onarım aktivitesi ve dokular ve tümör hücresi lizatlarını ölçmek için uyarlanabilir. Bu test için kullanılacak moleküler işaretleri tasarlarken, burada gösterildiği gibi 43 baz uzunluğunda olan aşağıdaki DNA oligonükleotidlerini göz önünde bulundurun.

İyi çalış. DNA dizisi benzersiz değildir, ancak bir saç tokası yapısının oluşumuna izin vermelidir. Burada gösterildiği gibi diz çöktüğünde, urasil veya tetra hidro furin gibi spesifik baz lezyonlarının yerleştirilmesiyle özgüllük elde edilir.

Beş asal uçtan altı taban X konumunda, GC içeriği en az %32 olmalı ve beş asal uca bir GB tabanı yerleştirilmemelidir. Altı karboksi floresein veya altı fam, beş asal uca konjuge edilmeli ve üç asal uç, dab sil ile değiştirilmelidir. Bu, glikosil salımlarının bağlanmasını ve aktivitesini sağlamak için DNA onarım proteinleri için substrat olacaktır.

Lezyonun konumu, saç tokası yapısından ve DNA'nın ucundan yeterli boşluk sağlayacak şekilde seçilmiştir. Sap veya saç tokası dubleksinin uzunluğu en az 15 baz çifti olmalıdır. Önerilen döngü uzunluğu 13 bazdır.

Kontrol moleküler işaretçisi, bir DNA lezyonu içermemesi dışında, deneysel moleküler işaret ile aynı olmalıdır. Bu nedenle DNA onarım enzimleri tarafından tanınmamalıdır. Moleküler işaretler elinize geçtikten sonra, işaretlerin ısıtılana kadar floresan vermemesini sağlamak için kalite değerlendirmesi yapılmalıdır.

Ve optimum erime sıcaklığını belirlemek için, ekstraksiyon prosedürü sırasındaki tüm adımlar buz üzerinde veya dört santigrat derecede gerçekleştirilmelidir. Protein stabilitesini sağlamak için, önceden soğutarak deneye hazırlanın. Numune diyaliz tamponu diyaliz odaları, mikro santrifüj, tüpler, şırıngalar ve iğneler başına iki adet bir litrelik beher.

15 mililitrelik konik tüpleri etiketleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Büyüme ortamını hücrelerden aspire edin ve ardından ikinci yıkamadan sonra 7.5 mililitre soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Her yemeğe beş mililitre soğuk PBS ekleyin ve hücreleri plakadan kazımak için bir hücre kaldırıcı kullanın.

Hücreleri soğutulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, ardından beş dakika boyunca dört santigrat derecede 500 kez G'de santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, süpernatanı çıkarın ve paketlenmiş hücre hacmini, benzer tüplerdeki bilinen sıvı hacimleriyle karşılaştırarak tahmin edin. Tüpleri bir dakika daha santrifüjleyin ve ardından kalan PBS'yi bir pipet resüsü ile çıkarın.

Hücre peletini, her 50 mikrolitre paketlenmiş hücre hacmi için bir tane olmak üzere 150 mikrolitre nükleer avcı ekstraksiyon reaktifi içinde askıya alın. Daha sonra yeniden askıya alınan hücreleri önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve yüksek hızda 15 saniye boyunca girdap yapın. Girdaplamadan sonra, tüpü beş dakika buz üzerinde inkübe edin, daha sonra 15 saniye daha girdap yapın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin.

Döndürmeyi takiben, sitoplazmik fraksiyonu içeren süpernatanı çıkarın ve atın. Resus, peleti bir mikrolitre resus süspansiyonlu 100 x proteaz inhibitör kokteyli, bir mikrolitre 100 milimolar DTT ve 75 mikrolitre nükleer avcı ekstraksiyonu karışımı içinde askıya alır. 50 mikrolitre paketlenmiş hücre hacmi başına iki reaktif.

Vorteks'in hücrelerini yüksek hızda 15 saniye boyunca girdap. Buz üzerinde beş dakika inkübe edin ve tekrar 15 saniye boyunca girdap, yüksek hızda santrifüjde 13.000 kez G'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Döndürmeyi takiben, nükleer proteinleri içeren süpernatanı 7.000 moleküler ağırlıklı bir kesme ile bir slayt diyaliz kasetine aktarmak için şırınga kullanılır.

Daha sonra, 500 mililitre önceden soğutulmuş diyaliz tamponuna 500 mikrolitre bir molar DTT ekleyin ve lizatı hafifçe karıştırarak dört santigrat derecede 90 dakika diyalize edin. 90 dakika sonra, diyaliz kasetini DTT ile 0,5 litre önceden soğutulmuş diyaliz tamponu içeren ikinci bir behere aktarın ve diyaliz yapın. Diyalizi takiben hafifçe karıştırılarak dört santigrat derecede 90 dakika boyunca lizat, yüksek protein konsantrasyonları nedeniyle kristalleşmiş olabilir.

Daha sonra, kaseti enjekte etmek için kullanılandan farklı bir porta yeni bir şırınga yerleştirin ve diyaliz nükleer protein solüsyonunu diyaliz kasetinden toplayın. Diyalize edilmiş nükleer protein çözeltisini çıkarırken bulanık görünümlü kristalleri dahil etmeye çalışın. Numuneyi 20 mikrolitrelik mikro santrifüj tüplerine alın, her biri kuru buz üzerinde hızlı dondurun ve ardından ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derece saklayın.

Protein konsantrasyonunu belirleyin ve ekteki belgede açıklandığı gibi kalite kontrolünü gerçekleştirin. Moleküler işaret tahlilini gerçekleştirmek için, hücre lizatlarını bir milimolar DTT içeren bazik insizyon onarım reaksiyonu tamponu ile mikrolitre protein başına iki mikrograma kadar çözün ve seyreltin, moleküler işaretleri bazik eksizyon onarım reaksiyonu tamponu ile 200 mikromolar seviyeye seyreltin. Kantitatif gerçek zamanlı PCR makinesi tipik olarak bir florimetre olarak kullanılmadığından, en az 20 döngü boyunca 37 santigrat derecede her 180 saniyede bir veri toplamak için kantitatif gerçek zamanlı PCR makinesinde çalıştırma yöntemini değiştirin.

Daha sonra normalizasyon için veri elde etmek için moleküler işaretin maksimum floresansında 15 döngü boyunca her 20 saniyede bir. Reaksiyon hacmini 25 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, deney tipi olarak seçilen standart eğri ile uygulanan biyosistem yazılımını kullanarak cihaz üzerinde plaka tasarımını kurun, plaka düzenini tamamlayın.

Bu tabloda, ekteki belgede de bulunabilecek bir örnek gösterilmektedir. Standart eğri olarak seçilen kuyuya hiçbir şey eklemeyin. Temel eksizyon onarım reaksiyonu tamponu DTT hücre lizatını mikrolitre başına iki mikrogram konsantrasyona ve deneyde kullanılan tüm moleküler işaretleri buz üzerine yerleştirin.

Daha sonra DTT'yi temel eksizyon onarım reaksiyonu tamponuna, bir milimolar pipetin son konsantrasyonuna ekleyin. Buz üzerinde uyumlu bir optik Q-R-T-P-C-R plakasının her bir oyuğuna DTT ile 15 mikrolitre temel eksizyon onarım reaksiyonu tamponu. Sonraki, plaka düzenini takip ederek, işaretleri uygun kuyucuklara pipetleyin.

Her bir lizat ve moleküler işaret veya kontrol kombinasyonu üç nüsha halinde test edilmelidir. Son olarak, seyreltilmiş nükleer lizatın kuyu başına beş mikrolitresini uygun kuyucuklara pipetleyin. Tüm moleküler işaret reaktiflerini soğuk tutmayı ve son adım olarak lizatları plakaya pipetlemeyi unutmamak önemlidir.

Unutmayın, lizatlar aktif proteinler içerir ve reaksiyon karışımına pipetlenir takılmaz moleküler işaretleri onarmaya başlarlar. Bu nedenle, ölçüm yapmaya başlamadan önce meydana gelen işaret onarımı miktarını en aza indirmek için tüm reaktifleri soğuk tutmak çok önemlidir. Her şey eklendikten sonra, plakayı optik yapışkan filmle kapatın ve plakaya hafifçe vurarak karıştırın.

Ardından, döndürme işleminden sonra tüplerin veya plakanın dibindeki çözeltileri toplamak için bir santrifüj ile on saniyelik hızlı bir döndürme gerçekleştirin, plakayı kantitatif gerçek zamanlı PCR makinesine yerleştirin ve tamamlandıktan sonra teste başlayın, ham verileri tercihen Excel formatında dışa aktarın ve gerekli hesaplamalar yapıldıktan sonra verileri analiz etmek için ekteki belgedeki talimatları izleyin. LN 4 28 hücrelerinden ve LN 4 28 MPG olarak adlandırılan bir MPG aşırı ekspresyon hücre hattından DNA onarım aktivitesini ve kalitesini değerlendirmek için karşılık gelen hatalarla bir dağılım grafiğinde normalleştirilmiş floresan verilerini saniye cinsinden zamana karşı yüzde serbest fam olarak çizin. Bu videoda açıklanan tahlil, pozitif bir kontrol olarak APE bir substrat tetra furin içeren moleküler bir işaret kullanılarak gerçekleştirildi.

Bu şekilde gösterildiği gibi, her iki hücre hattı da dik eğim, MPG substratının uzaklaştırılması için spesifik DNA glikozat aktivitesi ile gösterildiği gibi sağlam APE bir aktiviteye sahiptir. HX olarak gösterilen hipo hipoksantin, her iki hücre hattından nükleer lizatlarda ölçüldü. Her lizat, ya bir temel eksizyon onarım kontrol moleküler işareti ya da kontrol işareti için bir baz eksizyon onarımı HX moleküler işareti kullanılarak analiz edildi; LN 4 28, hipo işareti için yeşil renkte gösterilir ve LN 4 28 MPG, mor renkte gösterilir.

LN 4 28 mavi renkle gösterilir ve LN 4 28 MPG turuncu renkle gösterilir. Sonuçlar, ortalama floresan birimleri olan A ve normalleştirilmiş floresan olan B olarak rapor edilir. Her hücrede HX onarımını gösteren floresanda zamana bağlı bir artış meydana geldi.

Lysate, beklendiği gibi HX moleküler işaretçi ile inkübe edildi. Turuncu iz ile gösterilen LN 4 28 MPG hücre hattı, minimum MPG proteinine sahip olan ebeveyn LN 4 28 hücre hattından daha hızlı floresan birikimi ile gösterildiği gibi çok daha yüksek bir onarım oranına sahipti. Bu nedenle, spesifik onarım proteinleri tarafından spesifik DNA lezyonlarının onarım hızı, spesifik olmayan DNA bölünmesinin minimum arka plan seviyeleri ile hücre ekstraktlarından gerçek zamanlı olarak ölçülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, moleküler işaretlerinizi nasıl tasarlayacağınızı ve saflaştırılmış proteinleri veya hücre lizatlarını kullanarak gerçek zamanlı DNA onarım oranlarını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Analizle ilgili olarak, dinamik aralığı ve arka plan değerlerini, pozitif ve negatif kontrol işaretleri olsun veya olmasın gibi kontrol reaksiyonlarının dahil edilmesiyle değerlendirmek esastır. Kuyudan kuyuya değişkenlik göz önüne alındığında, tek tek kuyulardaki verileri giriş değerlerine normalleştirmek faydalıdır.

Bunlar, erime sıcaklığındaki daha ince adımla belirlenir. Bu ve kaya kalıbı gibi diğer boyaların dahil edilmesi, pipetleme hatalarından veya dedektörlerdeki farklılıklardan kaynaklanan değişkenliği açıklayacaktır. Bu teknik, bireysel bazlı eksizyon onarım bileşenlerinin genel onarım aktivitesi ve kapasitesi üzerindeki etkisini aydınlatmamıza izin verdi.

Geleneksel yöntemlerle tespit edilemeyecek küçük değişikliklerin maskesini kaldıracak kadar hassastır.