On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Bu videonun amacı, endotel hücrelerinin enflamatuar durumunu karakterize etmek için bir çip tekniği üzerinde bir laboratuvarı göstermektir. Başlamak için, insan aort endotel hücreleri bir doku kültürü substratı üzerinde birleşecek şekilde büyütülür ve daha sonra bir Conan plaka kesme cihazına yerleştirilir. Hücreler, pro-inflamatuar sitokin, TNF alfa ile muamele edilir ve aynı anda dört saat boyunca diferansiyel kesme gerilimi koşullarına maruz bırakılır, koninin substrat üzerindeki dönüşünü hassas bir şekilde kontrol ederek kesme gerilimi, sitokine karşı iyi karakterize edilmiş bir inflamatuar yanıtı modüle eder.

Bu, VCA bir ve ICAM bir gibi yapışma moleküllerinin yukarı regülasyonunu içerir. Substrat, A-P-D-M-S mikroakışkan cihazının doğrudan tek tabakaya vakumla kapatıldığı ve akış kanalları oluşturduğu bir mikroskop aşamasına aktarılır. Aktive edilmiş monositik, THP bir hücre, hücre yapışma seviyesi Molekül ekspresyonu ile orantılı olarak bağlandıkları önceden koşullandırılmış hs üzerinden uçurulur.

Endotelin enflamatuar durumu, sıkıca tutuklanan THP bir hücrenin toplam sayısının ölçülmesiyle belirlenir. Merhaba, benim adım D Diverse ve ben Greg Foster. Ve ben Keith Bailey.

Davis'teki California Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde profesör, papaz ve Simon'ın laboratuvarlarındayız. Bugün, endotel disfonksiyonunu ve iltihabı kantitatif olarak incelemek için çip tabanlı bir yaklaşımda bir laboratuvarın kullanımını açıklayacağız. Bu araçlar, metabolik stresin hidrodinamik faktörlerle süperpozisyonu ve endotelyal inflamatuar fenotipin düzenlenmesi ve ateroskleroza yatkınlık ile ilgili çalışmalar yapmamız için bir platform sağlar.

Bu nedenle cihazlarımızı vasküler mimetik, mikroakışkan odalar veya vmmc olarak adlandırıyoruz. Bu cihazlar, aterojenik damarlardaki enflamatuar sonuçları taklit eden koşullar altında endotel hücrelerinde ve monositlerde enflamatuar sonuçları ölçmemize izin verir. VMMC, sınırlı miktarda bulunabilecek küçük miktarlarda reaktiflerin veya malzemelerin kullanımını kolaylaştırır.

Ayrıca bir dizi özelleştirilebilir düzen ve geometride inşa edilebilirler, bu da onları çok çeşitli uygulamalar için çok uygun hale getirir. Bugün, laboratuvarımızı çip yaklaşımı üzerinde kullanarak temsili bir deney göstereceğiz. İnsan endotelyal tek tabakaları, iyi tanımlanmış kesme gerilmeleri altında sitokin aktivasyonuna maruz kalacaktır.

Bir torna tezgahı kullanılarak endotel aktivasyonunun işlevsel bir okuması olarak insan monositik hücre alımını gerçek zamanlı olarak tek tabakaya ölçmek için VMC'nin kullanımını, 100 milimetrelik doku kültürü kaplarından üç inçlik dairesel substratların öğütüldüğünü göstereceğiz. Üç inçlik substratlar damıtılmış su ile yıkanır, daha sonra% 70 etanole batırılarak sterilize edilir. Steril substratlar 100 milimetrelik Petri kaplarına yerleştirilir ve kurumaya bırakılır.

Daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda tip bir kollajen ile inkübe edilir ve PBS ile yıkanır. İnsan aort endotel hücreleri veya HA, mililitre başına 650.000 hücre konsantrasyonunda süspanse edilir. Bir mililitre hücre süspansiyonu, kurutulmuş kollajen kaplı bir substrat üzerindeki damlacıklar halinde yerleştirilir ve eşit bir süspansiyona yayılır.

Oturmuş substratlar daha sonra 37 derece% 5 CO2 inkübatöre yerleştirilir ve substrat yüzeyine yapışmasına izin verilir. Bir saat dokuz mililitre E GM iki büyümeden sonra, ortam eklenir ve hücrelerin yaklaşık% 90 oranında Tek Katmanlara dönüşmesine izin verilir. Vasküler mimetik mikroakışkan odacıklar, A-P-D-M-S kalıbının istenilen kanalı içeren bir ana form üzerine dökülmesi ile yapılır. Geometri.

Silikon taban plastik bir tekneye dökülür, ardından ağırlıkça 10'a bir oranında silikon kürleme maddesi uygulanır. PDMS jeli daha sonra iyice karıştırılır, Yol teknesinin kenarlarını kazımamaya dikkat edin, ve böylece karışıma plastik talaşlar ekleyin. Fotorezist ustalar hekzan ile temizlenir ve VMMC'yi kalıplamak için hazırlanır.

PDMS Karışımı daha sonra ana formun üzerine dökülür, daha sonra bir vakum odasına yerleştirilir. Odada. Hava, PDMS karışımından çıkarılır ve 15 dakika sonra yüzeye çıkar.

Kalıp hazneden çıkarılır ve kalıptan kalan hava kabarcıklarını temizlemek için PDMS yüzeyine nazikçe hava üflenir. Kalıp daha sonra örtülür ve PMS'nin kürlenmesine izin verilen bir saat boyunca 37 derecelik bir fırına yerleştirilir. Katılaşmış PDMS jelini fırından çıkarın ve küçük bir neşter kullanarak haznenin etrafında dairesel kesiler yapın.

Ana kalıba zarar vereceğinden, foto direnç malzemesiyle temastan kaçınmak için bunu kademeli olarak yapmak çok önemlidir. 19 gauge yem kilitleme iğnesi kullanarak her kanal için mikroakışkan odasını kalıp zımba giriş ve çıkış portlarından çıkarın. Ek olarak, vakum tüpleri için kanallardan uzağa delikler açın.

VMMC Hazırlığı şimdi tamamlanmıştır. Pro-inflamatuar Sitokin TNF alfa'yı mililitre başına 0.5 nanogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için altı mililitre L 15 ortamına pipetleyin. L 15 ortamı, %5 CO2 yokluğunda pH tamponlama kapasitesi nedeniyle burada kesme sıvısı olarak kullanılır.

Ortam daha sonra kesme cihazını yüklemek için kullanılan steril 10 mililitrelik bir şırıngaya çekilir. Confluent tek tabakası daha sonra etanol ile sterilize edilmiş ve koni boşluğu yüksekliği ayarlanmış hücre kesme cihazına aktarılır. Alt tabaka, Petri kabından çıkarılır ve ortalanmış cam gösterge bloğuna yerleştirilir ve koni doğrudan hücrelerin üzerinde olacak şekilde muhafaza odasının tabanına dikkatlice yerleştirilir.

Alt tabaka, gösterge bloğunun etrafındaki paslanmaz çelik vidalar eşit şekilde sıkılarak sabitlenir. Kesme ortamı daha sonra hazneye yüklenir ve herhangi bir hava kabarcığı girmemesine dikkat edilir. Daha sonra, istenen kesme gerilimi programını girmek için bir bilgisayar kullanılır ve mikro ayrı motor açılır.

Burada, santimetre kare başına sıfır artı veya eksi beş dinlik salınımlı bir kesme kullanıyoruz. Dört saat sonra kesme programı durdurulur. Gösterge bloğu çıkarılır ve alt tabaka dikkatlice Petri kabına geri yerleştirilir.

Hücreler artık monosit adezyon testi için hazırdır. Kesme işleminden hemen sonra, HA tek tabakaları VMMC'nin montajı için mikroskop istasyonuna taşınır. VMMC, vakum hortumuna takılır ve kanallarda sıkışan hava kabarcıklarını gidermek için DI suyuna daldırılır.

Vakum valfi başlangıçta kapalıyken, hazne tek katmanın üzerine dikkatlice bastırılır ve vakum valfi açılır. Burada, odanın kanalları içinde hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmak çok önemlidir. Şimdi, kalsiyum ve magnezyum içeren 80 mikrolitre HBSS, 19 Gauge yemin ucunun kesilmesinden yapılan bir rezervuara pipetlenir Kilit iğnesi sıvısı, rezervuarın üst kısmına sıkıca bastırılarak uçtan dışarı itilir ve daha sonra VMMC'nin giriş portuna yerleştirilir.

Tüm düzenek mikroskop tablasına yerleştirilir ve mikroskop kamerası ve video monitörü açılır. Şırınga pompasına 10 mililitrelik bir cam şırınga yüklenir. Daha sonra, şırınga borusu VMMC'nin çıkış portuna bağlanır.

Akış hızı, kanal içinde santimetre kare başına bir dine kadar büyük bir stresi indükleyecek şekilde ayarlanır ve daha sonra şırınganın sıvıyı rezervuardan kanal boyunca çekeceği şekilde yeniden doldurma modunda çalıştırılır. SDF ile uyarılan P bir hücre, mililitre başına 2 milyon hücre konsantrasyonunda süspanse edilir. Akış aktivasyonundan iki dakika sonra, rezervuara 50 mikrolitre hücre süspansiyonu eklenir.

Yine, akış tamamen geliştikten sonra hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Video, saniyede üç kare hızında yakalanır ve veriler Image J yazılımı kullanılarak numaralandırılır. Yapışık. THP bir hücre, 10 saniyede bir yarım hücre çapından daha fazla hareket etmeyen olarak tanımlanır.

Burada, TNF alfa ile uyarılan ve santimetre kare başına 15 din'lik sabit bir yüksek duvar kesme gerilimi altında koşullandırılan ha tek tabakalarına THP bir yapışmayı veya sıfır artı veya eksi santimetre kare başına beş din'lik bir salınımlı kesme gerilimi altında koşullandırılan ha'yı gösteren verileri gösteriyoruz. Bugün, aterosklerozun altında yatan erken inflamatuar olaylara önemli bilgiler sağlamak için birleştirilebilen özelleştirilebilir in vitro tekniklerin kullanımını gösteriyoruz. Spesifik olarak, endotel disfonksiyonu ve iyi tanımlanmış hidrodinamik koşullar altında enflamatuar uyaranlara maruz kalan hücrelerle ilişkili sonuçları ölçüyoruz.

VMM CS kullanımı, endotel ve lökosit adezyon etkileşimlerinin altında yatan spesifik mekanizmaları incelememizi sağlar. Bu cihazlar aynı zamanda esnek ve ucuz olma avantajına sahiptir ve insan deneklerden elde edilen serum türevi bileşenler gibi tedarikte sınırlı olabilecek malzemelerin kullanımını kolaylaştırır. Bu cihazları uygulayan çalışmalarımız, endotel hücrelerinde sitokin, lipid ve öfke kaynaklı inflamasyonun araştırılmasını içermektedir.

Ayrıca, çoklu lökosit tiplerinde ve tam kanda yapışma mekanizmalarını inceleyen çip üzerinde testler geliştirdik. Sonuç olarak, bu teknolojinin, bir bireyin inflamasyon aracılı kardiyovasküler hastalık riskini değerlendirmek için ex vivo yaklaşımlara yol açacağını öngörüyoruz.