Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Bu prosedürün amacı, sterilize edilebilen, yeterli kalınlığa sahip ve klinik doku mühendisliği için uygun mekanik dayanıklılıkta olan elektro eğirme yöntemiyle üretilmiş biyobozunur iskeleler üretmektir. Bu işlem, öncelikle biyobozunur polimerlerin rastgele, hizalanmış ve yönlendirilmiş veya ardışık katmanlı birincil mimariler halinde elektro eğirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, birkaç katmanın bir araya getirilmesi ve sterilizasyonu yoluyla iskelelere eğirme sonrası modifikasyonların uygulanmasıdır.

Ardından hücreler iskelelere yerleştirilir ve kültürleme sırasındaki ve sonrasındaki performansları değerlendirilir. Son adım, hücreleri transplantasyona hazırlamak amacıyla, vücutta karşılaşacakları fizyolojik stresi taklit eden bir egzersiz rejimine tabi tutmaktır. Nihayetinde, hücrelerin dinamik gerilime yanıt olarak ürettikleri hücre dışı matrisi ölçerek, hücrelerin egzersize verdiği yanıtı değerlendirebiliriz.

Bu teknik, gerekli uygulamaya göre özellikleri özel olarak modifiye edilmiş çok çeşitli iskelelerin üretilmesine olanak tanıyan, çok yönlü ve esnek bir yöntemdir. Örneğin iskeleler; ağır yanık vakalarındaki geniş cilt kayıplarının giderilmesi veya kanser ya da travma sonrası hasar görmüş oral mukoza onarımı gibi, doku onarımının gerekli olduğu zorlu durumları tedavi etmek üzere tasarlanabilir. Bu video, dinamik stresin bir belirteci olarak hücrelerin sürekli üretimini gösterse de, egzersiz yapmış veya yapmamış hücreleri kullanarak bir dizi hücre dışı matris proteinini değerlendirebilir ve hücre biyolojisinin diğer birçok yönünü inceleyebilirsiniz.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, elektro eğirme işlemi birçok değişkenden etkilendiği için tekrarlanabilir iskeletler elde etmekte zorlanırlar. Elektro eğirme sonrası iskeletlerin işlenme sürecinin görsel olarak gösterilmesi önemlidir; ancak bu konu nadiren tartışılmaktadır.

Tekniğin klinikte başarıyla uygulanabilmesi için sürecin bilinmesi gereklidir. İlk olarak, döner bir mandrel kolektörünü, parlak yüzeyi dışa bakacak şekilde alüminyum folyo ile kaplayarak başlayın. Ardından, her biri beş mililitre ilgili polimerle doldurulmuş dört adet beş mililitrelik şırınga yerleştirin.

Burada polilaktik asit bir şırınga pompası içine yerleştirilir. Akış hızını şırınga başına 40 µL/dk ve çalışma mesafesini iğne ucundan mandrele kadar 17 cm olarak ayarlayın. Ardından, hizalanmış lifler elde etmek için şırınga iğnelerine +17.000 V yükleme yapın ve uygun mesafeden alüminyum folyo kaplı mandrel üzerine elektro eğirme işlemi gerçekleştirin.

Rastgele lifler elde etmek için manl'yi 1000 RPM hızında döndürün. Manl'yi 200 RPM hızında döndürün. Elektro eğirme ile PHBV Lotus ikinci polimer elde edildikten sonra, elektro bun iskeleleri, nem alıcı bulunan sızdırmaz bir kap içerisinde, alüminyum folyo üzerinde dört °C'de en az dört ay boyunca saklanabilir.

Tekrar burada. PLA, PHBV'nin üzerine katmanlaşmayı göstermiş olup ardından o polimer eğirimi için parametreler ve normal koşullar kullanılmıştır. Yine, bu eklemeli işlem, ısıtıcı yardımıyla çok katmanlı bir iskelesi oluşturmak için çift katmanlı bir iskele inşa ederek bir çift katman üretmektedir.

Buhar ile tavlama yöntemiyle çok katmanlı bir iskale üretmek için dört adet PLGA tabakasını üst üste dizin ve ardından bu tabakaları 60 °C'de üç saat boyunca ısıtarak tavlayın. Uygun boyutlu bir kaba 10 mL diklormetan veya DCM dökün. Ardından, dört PLGA tabakasını üst üste yerleştirerek DCM'nin 2 cm üzerinde asılı tutun.

Son olarak, elektro eğirme ile aseptik iskele üretimi gerçekleştirmek için kabı oda sıcaklığında bir saat boyunca mühürleyin; inkübasyonla sterilize edilmiş tıbbi sınıf polimerleri DCM içinde çözün ve ardından elektro eğirme işlemini uygulayın. Polimer çözeltisini, sterilize edilmiş bir mandrel etrafına sarılmış steril folyo üzerine elektro eğirme ile aktarın. Daha sonra, deneysel etanol dezenfeksiyonuna göre örneklerin sterilitesini doğrulamak için, steril bir laminar akışlı kabinde iskeleyi uygun süre boyunca antibiyotiksiz büyüme ortamında inkübe edin.

İskeleleri 15 dakika boyunca etanol ve distile su çözeltisine yerleştirin. Perasetik asit sterilizasyonu için iskeleleri üç saat boyunca perasetik asit ve PBS çözeltisine daldırın.

Gama sterilizasyonu için oda sıcaklığında, iskeleleri önce sezyum kaynağı kullanarak 3 kGy dozunda ışınlayın, ardından iskeleleri 5 mm x 20 mm boyutlarında dikdörtgenler şeklinde kesin. Daha sonra iskele kalınlığını ölçmek için bir mikrometre kullanın. Ardından dikdörtgenleri bir Bose electro force 3, 100 cihazına yerleştirin.

Cihaz tarafından çizilen gerilme-birim şekil değiştirme eğrisi şeklindeki yük-yer değiştirme verilerinden Young modülünü ve elastikiyeti hesaplayın. Hücreleri ekmeden önce floresan bir boya ile işaretleyerek başlayın. Ardından, konfluens halindeki insan dermal fibroblastlarını tripsin ve EDTA içerisinde 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, ayrılan hücreleri oda sıcaklığında 150 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve pelletini beş mililitre DMEM içinde yeniden süspande edin. Sayım yaptıktan sonra, ekim için hücre konsantrasyonunu ayarlayın ve hücreleri iskelelere ekin. Şimdi, hücrelerin iskelelerin derinliklerine nüfuz etmesini incelemek için işaretlenmiş iskelelerin yüzeyini floresan mikroskopla görüntüleyin; iskelelerin daha derinlerine inmek için çok fotonlu konfokal mikroskop kullanılabilir.

Bu yöntemle, hücreli veya hücresiz çoğu iskelede yaklaşık 200 mikron penetrasyon sağlanabilir. Ardından, ekim yapılmış iskeleler kültüre edildikten sonra, örnekleri PBS içindeki bir mililitre formaldehitte 37 °C'de 20 minutes boyunca fikse edin. Fiksasyonun ardından örnekleri bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın ve ardından her bir örneği 200 µL elastin primer antikorları ile 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Numuneleri bir mililitre PBS ile üç kez daha yıkayın ve ardından numuneleri, DPI içeren PBS içindeki sekonder antikor çözeltisinde 30 dakika inkübe edin. Son olarak, numuneleri PBS ile son bir kez yıkadıktan sonra, DPI için 365 nanometre eksitasyon ve 460 nanometre emisyon; sekonder antikor için ise 480 nanometre eksitasyon ve 533 nanometre emisyon kullanarak floresan mikroskobunda görüntüleyin. Önce akış düzenleme aparatını ve balonu otoklavlayın, ardından temiz oda içerisinde, aparatı elektro eğirme konumunda bir laminer akış kabininde paketinden çıkarın.

Ardından, PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir şırıngayı üç yollu bir musluğun yan borusuna bağlayın ve balonu gergin hale gelene kadar PBS ile şişirin. Şimdi istenen polimeri balonun üzerine elektro eğirme yöntemiyle uygulayın. Standart eğirme koşulları ve 10 santimetrelik bir çalışma mesafesi kullanıldığında, ıslak lifler balonun yüzeyine daha sonra ayrılmadan yapışacak kadar yapışkandır.

İskele kuruduktan sonra balonu steril bir kaba yerleştirin ve ardından kabı hücre kültürü için uygun bir laminer akışlı kabine taşıyın. Hücreleri biyomekanik koşullandırmaya tabi tutmak amacıyla, genişletilmiş bir balon üzerindeki iskelede kültüre etmek, bu prosedürün en zor kısmıdır. Mümkün olduğunca çok hücrenin iskeleye tutunmasını sağlamak için balonun hücre solüsyonu ile tekrar tekrar yıkanması esastır.

Bu işlemin yaklaşık 20 dakika sürdüğünü gözlemledik. Çeker ocak içerisinde, balonu kaptan çıkarın ve burada kullanıldığı gibi bir Petri kabı gibi steril bir yüzeye yerleştirin; hücrelerin balon yüzeyine eşit şekilde dağılmasını sağlamak için 20 dakika boyunca her 20 saniyede bir kaplamalı balonun üzerine hücre süspansiyonu pipetleyin. Ardından balonu tekrar kültür kabına yerleştirin ve hücre tipine uygun ön ısıtılmış besiyeri ekleyin.

Son olarak, şişirme düzeneğini bir şırınga pompasına bağlayın ve biaxial gerilme sağlamak için balonu gerektiği gibi şişirip söndürün. Daha karmaşık bir gerilme rejimi elde etmek için bilgisayar kontrollü bir şırınga pompası kullanılabilir. Rastgele ve düzenli mimarilere sahip iskeleler oluşturmak için elektro eğirme yöntemi kullanılabilir.

Bu işlem tekrarlanabilirdir ve lifler tekdüzedir. Örneğin, alüminyum folyoyu 90 derece döndürerek folyo üzerine hizalanmış bir dizi lifin elektro eğirme yöntemiyle oluşturulması ve ardından hemen üzerlerine ikinci bir hizalanmış lif dizisinin elektro eğirme ile eklenmesiyle dik lifler oluşturulabilir. Burada P-L-A-P-H-B-V-P-C-L ve PLGA için gösterildiği gibi, özellikleri önemli ölçüde değişebilen birçok polimer türü elektro eğirme ile üretilebilir; P-L-A-P-C-L ve PLGA'nın tamamının mikrolifli tekdüze iskeletler olduğuna dikkat ediniz.

PHBV, beş ila 20 mikron boyutundaki boncukları birbirine bağlayan nanoliflerle, bir inci kolye şeklinde eğrilir. Burada iskeleler başlangıçta PHBV kullanılarak eğrilmiş, ardından şırıngalar PLA ile doldurulmuş ve PHBV iskelelerin üzerine eğrilmiştir. Bu görüntüler, temsili tekil PHBV ve PLA katmanlarını göstermektedir.

Bu görüntü, yoğun nano lifli bir kolye yapısına sahip A-P-H-B-V-P-L-A çift katmanının, PHBV katmanının ve daha açık mikro lifli bir PLA katmanının enine kesitinin nasıl görünebileceğini göstermektedir; her üç iskale türü de hücre yapışmasını ve proliferasyonunu kolaylaştırır. Daha kalın iskalelere ihtiyaç duyulursa, sonraki birkaç görüntüde gösterildiği gibi, iskale katmanlarını birbirine kaynatmak için buhar ve ısıtıcı ile presleme uygulanabilir. Preslenmiş iskale katmanları ayrılmaz ve katmanlar arasındaki bağlantı noktasını bulmak oldukça zor olabilir.

Bu görüntü, yaklaşık 150 mikronluk başlangıç lifli iskelelerin bir araya getirildiği, buharla işlem görmüş ve tavlanmış bir PLA iskelesinin kesitini göstermektedir. Ardından, 500 mikrona kadar çok daha kalın iskeleler oluşturmak için DCM buharı kullanılmıştır. Bu görüntü, buharla işlem görmüş çift katmanın aynı kesitini yaklaşık iki kat daha fazla büyütme ile göstermektedir; bu görüntüde iskelenin, ısıtma ile oluşturulan daha ince lif katmanları ile aralara dağılmış çok daha kalın lif katmanlarından oluştuğu gözlemlenmektedir; ince ve kalın lif katmanlarının birlikte tavlanması, karmaşık mekanik özelliklere sahip iskelelerin üretilmesini sağlar.

Bu görüntü, aynı ısıtıcı dizilmiş iskelesini dört kez göstermektedir. Katmanlı membranlar aracılığıyla yapılan önceki büyütme, bu iki farklı floresan hücre takip boyası ile renklendirilmiş insan dermal fibroblast görüntülerinde gösterildiği gibi, her biri ayrı bir membran üzerinde birbirine karışmadan kültüre edilen farklı hücre tipleriyle gerçekleştirilebilir. İlk görüntü, elektrobun PLA üzerindeki fibroblastlarıdır.

Hücreler fikse edildi ve boyandı; burada, boyanmış fibroblastlar elektrobükümlü PHBV üzerine ekildi. Bu deneyde, fibroblastlar canlı boya olan cell tracker green ile önceden boyandı. Hücrelerin çift katmanlı yapının PLA tarafında bulunduğuna dikkat ediniz.

Bu görüntü, alt PHBV yüzeyinde kırmızı boyanmış fibroblastların ve üst PLA yüzeyinde yeşil boyanmış fibroblastların bulunduğu bir çift katmanın temsilci bir kesitidir. Bu görüntüde, A-P-H-B-V yüzeyinde büyürken cell tracker red ile önceden boyanmış fibroblastlar görülmektedir. Bu nedenle, canlı floresan boyaların kullanımı, hücreler henüz büyümeye devam ederken bir iskele üzerindeki hücre dağılımını incelemek için uygun bir metodoloji sağlar.

Sterilizasyon yöntemi, iskeleyi ve ardından gelen hücre kültürünü etkiler. Bu çizgi grafiği; perasetik asidin, gama ışınlamasının ve etanolün bir PLG iskelenin nihai çekme dayanımı ve Young modülü üzerindeki etkilerini göstermektedir.

Sterilizasyon yöntemlerinin her biri, iskaleletlerin nihai çekme dayanımını ve elastikiyetini değiştirmektedir. Hücrelerin bu iskeletler üzerinde kültüre edilmesi, nihai çekme stresini daha da azaltırken elastikiyeti artırmaktadır. Bu sütun grafiği, sterilizasyon yönteminin tek bir iskeletin fiber çapı üzerindeki etkisini göstermektedir.

Gama ışınlamasının fiber çapı üzerinde anlamlı bir etkisi yoktur, buna karşın perasetik asit ve etanol fiber çapını yaklaşık %50 oranında azaltır. Bu nedenle, steril iskeleler elde etmenin en iyi yolu, bunları aseptik koşullar altında üretmektir. Bu son görüntü serisi, hücrelerin dinamik distansiyon sırasında canlı kaldığını ve ayrıca artmış miktarlarda elastin ürettiğini göstermektedir. Metabolik bir gösterge olan MTT ile tespit edilen, büyüyen hücrelerin oluşturduğu koyu mavi rengin gelişimine dikkat edin.

Burada, bir balon üzerinde kültüre edilen ve biyaksiyel genişletmeye tabi tutulan mavi renkli hücrelerin, yeşil boyamanın gösterdiği üzere elastin lifleri geliştirdiği görülmektedir. Bu durum, aynı hücreler özdeş bir balon iskele üzerinde statik koşullarda tutulduğunda elastin eksikliği olmasıyla belirgin bir tezat oluşturmaktadır. Bu prosedürün ardından, hücrelerin farklı kültür koşullarına nasıl tepki verdiğini incelemek için iskelelerdeki hücrelerle statik kültür ve sıvı akışı gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Genişletilebilen bir balon üzerindeki bir iskelede hücre kültürü geliştirilmesi, doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların doku mühendisliği konstrüktlerindeki hücrelerin dinamik koşullanma etkisini keşfetmelerinin yolunu açtığı için oldukça yararlı olmuştur. Yüksek voltajlı güç kaynakları, solventler, lazerler ve insan hücreleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini; bu prosedür uygulanırken her zaman uygun eğitimin alınması ve gerekli önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.