Name: Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Keşfedin sentetik curli operonu tasarımını ve E. coli'de bakteri yapışkanlığını artırma yöntemini. Konfokal mikroskopi ile biyofilm oluşumunu görselleştirin ve kantitatif analiz yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Lyon INSA-ENS iGEM ekibi (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy&#39;nın, Clemence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy diğer üyeleri teşekkür , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon ve Valérie Desjardin), mali destek için sponsorlar (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon ve Biosciences INSA-Lyon Bölümü), kritik bu yazının okuma ve zorlanma hediye Dr CC Sze F. Wisniewski-dye. Drogue B. Doktora alır Région Rhône-Alpes bursu.

1. Curli Operon arasında BioBrick Tasarımı ve Sentezi <ol><li> Genetik organizasyon belirleyin ve curli genlerin endojen transkripsiyonel ve translasyonel sinyalleri yerelleştirilmesine. Bu bilgiler örneğin RegulonDB a veya b EcoGene gibi özel veritabanlarında toplanmış ve ilgili yayınların dikkatli bir okuma ile tamamlanmıştır. Veri yönetimi ve siliko preanalysis Clone Manager yazılımı c ile yapıldı. </li><li> Ilgili kodlama dizileri seçin. Curli sentezi (ÇSGB ve csgA kodlama elyaf monomerler) ve ihracat (csgE csgF ve csgG, Curlin salgılanması karmaşık kodlama) için beş kesinlikle gerekli gen grubu sentetik operon oluşturmak için seçilmiştir. FASTA formatında veri tabanından seçilen dizileri ayıklayın. CsgGFE küme E&#39;de olduğu gibi anti-duyum coli genomunun haritalanması, onun ters tamamlayıcısı counterp içine bu dizisi dönüştürmek&gt; Süreç molekül&gt; molekülü Invert Klon Yöneticisi araçları Operasyon kullanarak sanat. Fonksiyonu &quot;Arter&quot; (Klon&gt; Arter) kullanılarak csgBA arkasında csgEFG sekans yapıştırın. </li><li> Uygun bir promotörün ekleyin. Promotör P RCN kontrolü altında seçilen beş curli genler yerleştirerek, curli kobalt ve nikel varlığında aşırı üretilmiş olarak tahmin edilmektedir. RCN lokus Ni ve Co detoksifikasyon (rcnA) ve soydaş metallo-regülatör (rcnR) sorumlu bir akış pompası kodlar. RcnR rcnA ekspresyonu ve Ni ve Co 19, yanıt olarak, kendi gen kontrol eder. RcnR CDS ihtiva RCN dizisi, bütün RCN intergenik bölge ayrıca rcnA ve 41 birinci nükleotid sekansı csgBAEFG hayali (bütün yapının dizi ek veri olarak verilmiştir Şekil 1), bir ön placedin idi. </li><li> Transkripsiyonel Optimizesinyalleri. Mükemmel bir ribozom bağlanma sitesi (ya da mükemmel RBS = AAGGAGGTATATA) csgBA DNA dizisinin ilk ATG önünde ilave edildi. İkinci bir mükemmel RBS csgEFG sıra önünde ilave edildi. ÇSGB ve csgF ve csgG genleri için endojen RBS muhafaza edildi. </li><li> IGEM standartlara uyması için, cihazın Eco RI kısıtlama siteleri, Pst I (prefix) ve SPE I ve xba I (sonek) içeren standart bir BioBrick önek ve sonek ile çevrili olmalıdır. Cihaz d her iki ucunda karşılık gelen diziler yapıştırın. </li><li> Herhangi Eco RI, Pst I, SPE I ve cihazın xba Ben tanıma sitesi eleyin. Daha fazla montaj işlemi kolaylaştırmak için, BioBrick parçası kendisi bu kısıtlama sitelerin herhangi içeremez. Cihazın siliko kısıtlama analizi bir Pst I csgA sırayla yer rcnR sırayla, bir Pst I site açığacsgE gen ve bir Eco RI sitesi. Bu siteler sırasıyla aygıtı sırasını (ek bilgi) pozisyonu 80 (Mut1), 1340 (Mut2) ve 1830 (Mut3) bulunur ve sessiz mutasyonların tarafından aşağıdaki gibi modifiye edilmiştir. Mut1 Pst I site CGTCTG değişti CTGCAG Mut2 Pst I site CAGCAG değişti CTGCAG GAATT değişti Mut3 Eco RI sitesi GAATTC </li><li> Klon Manager yazılımı (Operasyon&gt; Proses molekülleri&gt; Tercüme moleküller) kullanarak çeviri simülasyon yoluyla çalıştırın. Yabani tip curli protein ve sentetik operon tarafından kodlanan proteinler arasında mükemmel bir homoloji doğrulamak üzere dizi hizalama programı BLAST kullanın. </li><li> Sentetik operon ısmarla. Ticari gen sentezi hizmetleri dünya çapında çok sayıda şirket edinilebilir, bizim ortak Genecust (Lüksemburg) idi. Yapay operon (3165 bp) 4 mikrogram birkaç hafta sonra alınan ve pUC57 (pIG2) yerleştirildi. </li></ol>2. Polistiren üzerine yapışkan bakteri görselleştirin ve sayısal <ol><li> M63 az orta (glikoz% 0.2) 2 ml ile 24 kuyu polistiren plakanın her doldurun ve bir gecede kültür 106 hücre ile her bir kuyunun aşılamak. Sallayarak olmadan 18 ila 48 saat boyunca 30 ° C&#39;de bakteriler büyümek. Her sütun (4 kuyu) bir yöntemdir temsil eder. Gerektiğinde uygun kobalt miktarı (25 ila 100 mM) ve antibiyotik (ampisilin 100 μg.L -1) ekleyin. 24-plaka ilk 3 satır 3 tekrarlar ortalayarak yapışık bakteri ölçmek için kullanılan, son satırın sol biyofilm görselleştirmek için kullanılır. </li><li> 24-plaka 3 İlk satır için: Her kuyucuk için, planktonik hücreleri içeren süpernatant kurtarabilirsiniz. </li><li> Dikkatle 1 M63 ml ve havuz 2.2 &#39;de elde edilen ilk süpernatant ile 1 ml yıkama) ile de her durulama. Bu yüzme havuz hücreleri (= S) olarak ifade edilir. </li><li> 1 ml o da biyofilm Kurtarkazıma ve yukarı ve aşağı pipetleme f M63 (= B). Vortex 15 sn. Her modalite karşılık bağlılığı yüzdesini vermek için 600 nm (OD600) de optik yoğunluk gelen yüzey bağlı ve yüzme bakteri sayısını tahmin edin. </li><li> Bağlılık yüzdesi formül kullanılarak hesaplanır: Bx100 / (3XS + B). </li><li> Sadece 24-plaka son satır için: planktonik hücreler atın. </li><li> M63 plakanın altındaki gelişen biyofilm 1 ml ile yıkayın. </li><li> 80 de 1 saat süre ile açık bir plaka kurutun ° C. </li><li> Iyi yüzey bağlı bakteri görselleştirmek için su ile yıkamalar geniş ardından, her içinde 2 dakika süreyle% 20 kristal menekşe renkli 100 ul ekle. Üç bağımsız testler (plakalar) tekrarlanabilirlik sağlamak için yapılmak zorundadır. </li></ol> 3. Mikroskopi tarafından Camına Bağlanan Bakteri görselleştirin <ol><li> Bir floresan şasi alın. E. Hangi constitutivel coli SCC1 e suşuy MG1655 20 plazmid taşıyan sentetik operon curli için uygun bir konak olan üst suşundan gözlenebilir bir fark ile yeşil flüoresan proteini (GFP) ifade eder. </li><li> S23 suşu elde pIG2 plazmid (Eco RI / Pst I pUC57 plazmid yerinde takılı = sentetik curli operon) ile SCC1 Transform. Kontrol suşu S24 21 elde etmek için plazmid bir kontrol (pUC18) ile SCC1 Transform. </li><li> S23 ve kontrol gecede precultures (S24) 30 suşu ° M63 glikoz ile desteklenmiş orta (% 0.2) ve ampisilin (100 μg.L -1) C büyütün. </li><li> Precultures 100 ul ile Petri kapları içinde aynı ortam, 15 ml inoküle. Kobalt (örn. 25 uM) ve uygun konsantrasyonda ilave edin ve kobalt olmaksızın negatif kontrol unutma. Her Petri kabındaki 3 dikdörtgen cam lamel tanıtın. Sallayarak olmadan 30 ° C&#39;de bir gece inkübe edin. </li><li> Fro lamel çıkarınPetri kabı ve dikkatlice boşaltın m. Her bakteriyel artıklarını silerek 70 ° etanol ile emprenye küçük bir pamuk malzeme ile alt yüzünü dikkatle temizleyin. Konfokal gözlem için, lamel daha fiksasyonu sağlamak için birkaç milimetre üzerinde hem üst biter temizleyin. </li><li> Bağlanan bakteri flöresanlı bir mikroskop altında gözlemlenerek, doğrudan fakat hızla, ama dikkatlice örnek kurumasını önlemek edilebilir. </li><li> Konfokal gözlem için, yüzü yukarı yerleştirilen biyofilm kapsadığı üst yüzü ile bir cam slayt üzerine lamel yatırmak. Biyofilm sonra reçine ile cam slayt sabitlenir daha büyük bir lamel ile kaplanır. Biyofilm şimdi alt yüzünde olacak şekilde kurulum Invert. </li><li> Konfokal lazer mikroskop altında kurulum yerleştirin. Bir sağ Axioplan2 LSM510 (Zeiss) konfokal lazer mikroskop Platim platformu f kullanıldı. </li><li> Ayarlama. Excite 488 nm&#39;de GFP ve aralığında bakteriyel floresans 500 ile 600 nm toplamak<html> . Konfokal tarama modu lazer görüntüleri almak için 40x yağ immersiyon objektif kullanın. 1 mikron bir adımı kullanarak katı yüzeyinden büyüme ortamı ile arayüz biyofilmlerin genel olarak üç boyutlu yapılar, tarama. </li><li> IMARIS yazılımı (Bitplane, Zürich, İsviçre) ile üç boyutlu projeksiyonlar gerçekleştirin. İstatistiksel boyuna kesitler boyunca ortalama z değeri analizi ile biyofilm kalınlığı belirleyin. 22, başka bir yerde tanımlandığı gibi biyofilm biovolumes kantitasyonu konfokal z-yığınlarının elde edilebilir. </li></ol> Bir RegulonDB transkripsiyon birimleri, proje ve sigma, genler ve ribozom bağlanma yerleri, sonlandırıcılar, spesifik transkripsiyonel bağlayıcı sitelerin yanı sıra, düzenleyici ifadeler içine kendi organizasyonu içine operon organizasyonu ve ayrışma ile ilgili mekanistik bilgi sağlar.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp b EcoGene veritabanı E. hakkında güncel bilgiler içermektedir coli K-12 genom ve kapsamlı gen bibliyografya dahil proteom dizileri. Büyük bir EcoGene odağı çeviri başlangıç ​​sitelerin yeniden değerlendirme olmuştur. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> c <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> Chun Chau Sze, Nan Yang Teknik Üniversitesi, Singapur e Hediye. f Platim mikroskopik platformu UMS3444 BioSciences&#39;ı Gerland - Lyon Sud.

<ol><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+sensor+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li>
<li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li>
<li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li>
<li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li>
<li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains%3A+role+of+flagella%2C+curli+and+colanic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces%3A+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li>
<li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg%28II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li>
<li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Zn%28II%29%2C+Cu%28II%29%2C+and+Fe%28II%29+ions+to+Alzheimer%27s+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li>
<li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li>
<li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li>
<li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li>
<li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li>
<li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpxR%2FOmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li>
<li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li>
<li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li>
<li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li>
<li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site%3A+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li>
<li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li>
<li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere%3A+new+perspectives+for+studying+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li>
<li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandini%2C+P+%22Biological+Adhesives%22">Biological Adhesives</a>. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).</li>
<li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li>
<li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li>
<li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JE+%22Experiments+in+molecular+genetics%22">Experiments in molecular genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Kritik adımlar Bu sentetik biyoloji yaklaşımda en önemli adım gen tasarımıdır. Sentetik gen tasarım etkili bir sistem üretimi sağlamak için titiz olmak zorundadır. Nükleer atık ve biyo-dekontaminasyon: kendi salgı sisteminin içinde yer proteinleri kodlayan elyaf monomerler ve üç gen kodlayan iki gen bir roman uygulama için yeni bir işlevsel birim oluşturmak için güçlü ve metal-uyarılabilir kolaylaştırıcı ile monte edilmiştir. Planlı ve tahmin edildiği gibi, bu cihaz ortamda kobalt miktarını art...

Abiyotik destek Bakteriyel yapışma biyoremediasyonunun, biyokataliz veya mikrobiyal yakıt hücreleri önemli bir rol oynar. Biyoremediasyon süreçleri organik maddelerin düşmeye veya metal dağılımı (immobilizasyon, buharlaşma) veya türleşme değiştirmek için mikroorganizmaların kapasiteleri kullanmak. Bu yararlı faaliyetler endüstriyel ve evsel atıkların kirli su tedavisi için geliştirilen yapay sistemleri de karasal ve sucul ekosistemlerde görülen, fakat. Mikrobiyal aktivite yoğunluğu ve kalitesi değil, aynı zamanda mikroorganizmaların yaşam tarzı (serbest yüzen veya biyofilm içine gömülü) üzerine, fiziko-kimyasal etkenlere bağlıdır. Biyofilm oluşumunu farklı mekanizmalar ile biyosit direnç teşvik bir metabolizma ile ilişkilidir. Bu olgu dolayısıyla en biyoremediasyonun süreçlerinde teşvik edilecektir. Ayrıca, biyofilm oluşumunu kontrol etmek için mühendislik Escherichia coli hücreleri başarıyla uygulanmışbioçipler 2-3 tam hücreli sensörleri hareketsiz. Metallerin yüksek konsantrasyonu mikroorganizmaların adaptasyonu hücre içine metal konsantre çeşitli hücre dışı matris bileşenleri için bu gibi adsorpsiyon gibi mekanizmalar, akış pompasının aktivasyonu ya da spesifik taşıyıcılar aracılığıyla gerçekleşir. Genetik mühendisliği yoluyla bu bakteri etkinlikler Artıran özellikle Raghu ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi zayıf miktarda yüksek derecede toksik metaller halinde de, laboratuar ölçeğinde metal kirliliğinin etkili ve ucuz bir tedavi sağlar. 2008 4. Bakteriyel iyileştirme bu durumda, iyon değişim reçineleri kullanan klasik kimyasal işlemler ile karşılaştırıldığında, bir rekabetçi ve maliyet tasarrufu yöntemi temsil eder. Yazarlar E. tarif coli şasi genetik bir çok kopyasını dönüşümden sonra bir plazmid sağlayan aşırı akış pompası kodlama gen rcnA eledi ve tarafından kobalt alımını ve ilk saklama için tasarlanmıştırkobalt için tercihli alımını taşıyıcı. Böyle bir gerilme radyoaktif atık tedavi etmek için iyon değiştirme reçineleri için etkili bir alternatif olarak görünmektedir, ama önemli bir mesele çözümlenmemiş işlemi 4 sonunda kirlenmiş bakteri geri kazanılmasıdır. Çalışmalarımızın amacı, cam veya plastik gibi abiyotik destekleri ayrılmamak için özel tasarlanmış bir zorlanma mümkün mühendisi nedenle oldu. Adhezinleri ve Gram-bakteri tespit yapışık fimbrialar bütünü Arasında, biz curli üretim sağlayan bir sistem tasarlamak için seçtim. Curli E. çıkıntı ince (2-5 nm çapında) ve yüksek agregatif amiloid lifler bir kristalin-olmayan ve çözünmeyen matris olarak 5-7 coli ve Salmonella yüzey. Curli aynı zamanda cansız yüzeyler ve biyofilmlerin 8 gelişme kolonizasyonu yer alırlar. Son zamanlarda Curli cıva iyonlarını 9 bağlamak için gösterilmiştir. Amiloidleri yüksek gerçekten sahip olduğu bilinenörneğin Cu 2 gibi metallerin iyonları için afinite +, Zn 2 + ve Fe 3 + 10. Bu özellik daha da metal kirli atık su arındırma artırabilir. CSG küme curli elyaf üretimi için sorumludur ve iki divergently transkripsiyonu operonlar (Şekil 1) teşkil edilir. ÇSGB, csgA ve csgC genlerin iki curli alt birimleri, CsgA ve ÇSGB kodlama, duygusu operon oluşturmaktadır. CsgC curli biyogenezi sistemi içinde redoks aktivite yer olması ve gözenek davranışı 11 CsgG etkileyecek gibi görünüyor. Bununla birlikte, curli üreten bakterilere çoğunda csgC yokluğunda da protein curli biyogenez üzerindeki kontrolü sadece bir sekunder seviyesi sağlar gösterir. Sistemi basitleştirmek için, biz gen az sayıda çalışmayı tercih edilmiştir. CsgDEFG düzenleme ve ulaşım gerekli proteinlerin operonencodesCsgA ve ÇSGB hücre yüzeyi için. CsgD csgBAC operonunun bir transkripsiyon aktivatörü ve curli fimbriya ve bu tür selüloz 12 gibi diğer biyofilm parçaların üretimi kontrol ederek ve inhibe kamçı üretimi 13 ile biyofilmin oluşumunun kontrol edilmesinde önemli bir rol oynar. CsgE, CsgF ve CsgG büyük curli protein alt birim CsgA çözünür bir protein olarak salgılanır, üzerinden dış-membran içine bir curli-özgü salgı cihaz oluşturmaktadır. CsgA polimerizasyonu ile oluşan zar-bağlı protein nucleator ÇSGB (14 gözden) üzerine, in vivo olarak bağlıdır. Çeşitli iki-bileşenli sistemler içeren karmaşık bir düzenleyici yollar curli 15-16 gen ekspresyonunu kontrol etmek için gösterilmiştir. Bu karmaşık düzenlemeler bakteriler çevresel uyaranlara yanıt olarak curli üretimi yoluyla kalın biyofilmlerin formu sağlamak, fakat endüstriyel uygulamalar için kontrol etmek zordur. Met kurtarma kolaylaştırmak içinbir endüstriyel işlem sırasında bakteriler al-doldurulmuş, bir katı destek bakteri tespit aslında iyi tanımlanmış bir parametreye (ler) i tarafından kontrol edilmesi gerekmektedir. Curli ve yapışık özelliklerini kendi amiloid doğaya 17 ile bağlantılıdır ve biyoremediasyonun süreçlerini iyileştirmek için kullanılan olabilir, ama basit ve kolayca kontrol cihazı oluşturulmak zorundadır. Bu 7 genlerin 18 arasında, 5 bir dizi kesinlikle curli sentezi (ÇSGB ve csgA kodlama elyaf monomerler) ve ihracat (csgE csgF ve csgG, curli salgılanması karmaşık kodlama) için genler gerekli sentetik operon oluşturmak için seçilmiştir. Curli &quot;doğal&quot; düzenlemesi, tasarlanmış ve sentezlenmiştir güçlü ve kobalt-overinducible organizatörü (Şekil 2) kontrol altında bu 5 CSG ​​genleri içeren sentetik operon kaçmak için. Curli kodlama bölgenin adım adım analiz ve fonksiyonel bir syn için tasarım prosedürüsempatik operon tarif edilmektedir. Polistiren ve cam bakteriyel yapışmayı görselleştirmek ve ölçmek için iki yöntem açıklanmaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> sentetik P RCN ihtiva eden bir 3165 bp EcoRI / PstI fragmanı pUC57 ile (pMB1 ori, 2710 bp) - csgBAEFG operon; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Amp r, (pMB1 ori, 2686 bp) ÇOKLU plazmid </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP etiketli MG1655, CC Sze hediye) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> 2 CoCl </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0.1 M stok çözelti oda sıcaklığında </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-kuyulu plakalı </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Polistiren 24-kuyucuğu </td></tr></tbody></table>

tek sentetik curli operon oluşturma tarafından mühendislik bağlanan bakteriler

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Burada açıklanan yöntem, E. yeniden dizayn oluşmaktadır Güçlü ve metalden-overinducible promotörün kontrolü altında curli genlerin en az sayıda montaj göre, bakteriyel yapışmayı ve bunun sonucunda elde görüntülenmesi ve miktarlarının coli içinde yapışma özellikleri. Bu yöntem uygun mühendislik soyutlama ilkeleri ve sentetik biyoloji standardizasyonu ve BBa_K540000 BioBrick sonuçları (En yeni BioBrick cihazı, mühendislik, iGEM 2011) geçerlidir. İlk adım, yabani tip soyla arasında yapışma yeteneklerinin arttırılması bu nedenle metal yanıt olarak curli aşırı ayrılmış sentetik operonunun tasarımı içerir, ve. Orijinal curli operon transkripsiyonel ve translasyonel sinyalleri optimize etmek ve curli &quot;doğal&quot; düzenleme kaçmak için siliko güncellenmiştir. Bu yaklaşım, başarı ile curli üretim bizim mevcut anlayış test etmek izin verdi. Moreover, basit bir metal-düzenlenmiş arttırıcının için endojen karmaşık organizatörü (10&#39;dan fazla transkripsiyonel tanımlanır) geçerek curli yönetmelik basitleştirilmesi kontrol etmek çok daha kolay uyum sağlar. İkinci adım basit yöntemlerin uygulanması ile uyum yeteneklerini kalitatif ve kantitatif değerlendirmesini içerir. Bu yöntemler, biyofilm oluşumunda rol oynayan biyolojik yapıların ne olursa olsun bakteri yapışık bir geniş aralık için de geçerlidir. 24-iyi polistiren plakalar Aderans testi kristal viyole boyandıktan sonra bakteriyel biyofilm hızlı bir ön görselleştirme sağlar. Bu niteliksel test yapışma yüzdesi ölçümü ile bilenmiş olabilir. Böyle bir yöntem çok basit ama iyi bir tekrarlanabilirlik ve yeniden hem de daha önce 1 açıklandığı gibi sadece kristal violet boyama daha doğru. Floresans ve lazer conf tarafından cam slaytlar GFP etiketli bakteri GörselleştirmeÖcal mikroskopi fenomen doğrudan gözlem ile 24 oyuklu plaka deney ile elde edilen sonuçlar güçlendirmek için izin verir.

E. vahşi tip CSG sırası siliko açıklama olarak transkripsiyonel ve translasyonel sinyallerin optimizasyonu ile ilişkili coli K12 tek sentetik curli operon P RCN-CSG Şekil 3 (tamamlayıcı veriler tam sırası) gösterilir tasarlamak için izin verdi. Protokol 2 ve 3 protokol curli üretimi ile ilişkili yapışma görselleştirmek ve ölçmek için kullanılmıştır. 24-iyi polistiren plakalar üzerinde kristal viyole boyama (protocole 2) her bir kuyunun dibinde biyofi...

Bir sentetik operon kodlama hem salgı cihaz ve curli liflerin yapısal monomerlerin tasarımı açıklanmaktadır. Bu amiloidleri ve yapışık polimerlerin aşırı bir bağlılık ölçülebilir bir kazanç sağlar<em&gt; E. coli</em&gt; Şaşi<sup&gt; 1</sup&gt;. Aderans görselleştirmek ve ölçmek kolay yolları açıklanmıştır.

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Burada açıklanan yöntem, minimum sayıdaki curli geninin ... kontrolü altında bir araya getirilerek E. coli yapışma özelliklerinin yeniden tasarlanmasından oluşmaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bakterilerin sıvı ortamlardan ayrılmasını kolaylaştırmak için onlara yapışkan özellikler kazandırmaktır. Bu işlem, öncelikle karmaşık genetik düzenlemeleri devre dışı bırakmak ve yapışkan polimerlerin kolay ve kitlesel üretimini sağlamak için sentetik bir curli tasarlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, sentetik düzeneğin verimliliğinin hızlı bir şekilde tahmin edilmesine olanak tanıyan polistiren üzerindeki yapışkan bakteriler görselleştirilir ve miktarları belirlenir.Ardından, cama yapışmış bakteriler konfokal mikroskopi ile görüntülenir. Biyofilmi doğrudan gözlemlemek ve yapısı hakkında bilgi edinmek amacıyla; hem yapışma miktarı, yüzde ölçümü hem de mikroskobik gözlemlerle, sentetik düzeneği taşıyan suşta yapışmanın önemli ölçüde arttığını gösteren sonuçlar elde edilir. Sentetik biyoloji yaklaşımının geleneksel klonlama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, uygun sinyallere sahip ve yalnızca kesin olarak gerekli olan genleri taşıyan konstrüktlerin çok hızlı bir şekilde elde edilebilmesidir.Bu yöntem, radyoaktif atıklardan metal yüklü bakterilerin uzaklaştırılması zorluğu gibi biyoremediasyon alanındaki temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, genetik düzenleyici sinyaller ve veri tabanı yönetimi hakkında temel bilgi gerektirdiğinden, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler zorluk yaşayabilir. Görsel gösterim, biyofilmlerin kırılganlığı nedeniyle öğrenilmesi oldukça zor olan biyofilm kantifikasyonu ve görselleştirmesi adımlarına odaklanacaktır.Sentetik carron tasarımındaki ilk adım, curly genlerinin genetik organizasyonunu belirlemek ve bunların endojen, transkripsiyonel ve translasyonel sinyallerini lokalize etmektir. Bu işlem, REON DB veya eco gene gibi özelleşmiş veritabanları kullanılarak gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, curly sentezi için kesinlikle gerekli olan beş genin seçilmesidir; CSGB ve CSGA fiber monomerlerini kodlarken, C-S-G-E-C-S-G-F ve CSGG kıvrılma salgı kompleksini kodlar; seçilen diziler veritabanından FASTA formatında çıkarılır, veri yönetimi ve in silico ön analizler, C-S-G-G-F-E kümesi E. coli genomunda antisense olduğu için clone manager yazılımı ile gerçekleştirilir.Bu dizinin ters tamamlayıcısına dönüştürülmesi gerekmektedir. Klon yöneticisi araçlarındaki "operations process molecule invert molecule" işlemini kullanın, ardından ligate fonksiyonunu kullanarak C-S-G-E-F-G dizisini C-S-G-B-A'nın arkasına yapıştırın. Sonrasında, C-S-G-B-A-E-F-G iCal dizisinin önüne uygun PRCN promotörünü ekleyin.RCN lokusu, nikel ve kobalt detoksifikasyonundan sorumlu bir FLX pompası olan RCNA ile onun konjuge metal düzenleyicisi RCNR'yi kodlar. Kobalt veya nikel yokluğunda, represör RCNR, DNA üzerindeki RCNR kutusuna bağlanır ve aşağı akış genlerinin tam transkripsiyonel aktivasyonunu engeller. Hücre içi kobalt veya nikel konsantrasyonu yükselirse, kobalt veya nikelin RCNR proteinine bağlanması, represörün promotöre sabitlenmesini engeller ve seçilen beş kıvrımlı genin promotör kontrolü altına girmesiyle P-R-C-N-A'nın transkripsiyonel aktivitesi artar.PRCN curly'nin kobalt ve nikel varlığında aşırı üretileceği öngörülmektedir. Ardından, CS gba DNA dizisinin ilk ATG'sinin önüne mükemmel bir ribozom bağlanma bölgesi veya RBS ve C-S-G-E-F-G dizisinin önüne ikinci bir mükemmel RBS ekleyerek transkripsiyonel sinyalleri optimize edin. iGEM standartlarına uyması için cihaz, EcoRI ve XhoI için kısıtlama bölgeleri içeren standart bir biobrick öneki ile daha sonraki montajı kolaylaştırmak için SpeI ve PstI için kısıtlama bölgeleri içeren bir son ek ile çevrelenmelidir.Bio brick parçasının kendisi herhangi bir ECO R one, PST one SPE one ve X-bar R one tanıma bölgesi içermemelidir. Bu nedenle, söz konusu bölgeler sessiz mutasyon değişiklikleriyle ortadan kaldırılmıştır; cihazın in silico kısıtlama analizi, CSGA dizisinde bir PST one bölgesi, RCNR dizisinde bir PST one bölgesi ve CSGE geninde bir ECO R one bölgesi olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu bölgeler sessiz mutasyonlarla modifiye edilmiştir.Sentetik operon tasarımı tamamlandıktan sonra, klon yönetici yazılımını kullanarak bir translasyon simülasyonu gerçekleştirin. Vahşi tip curly proteinleri ile sentetik operon tarafından kodlanan proteinler arasındaki mükemmel homolojiyi doğrulamak için blast dizi hizalama programını kullanın; bu prosedüre 24 kuyucuklu bir polistiren plakanın her bir kuyucuğuna 2 mL %0,2 glikoz içeren M 63 minimal besiyeri ekleyerek başlayın. Her kuyucuğu, gece boyunca inkübe edilmiş bakteriyel kültürden 10⁶ hücre ile inoküle edin. Bakterileri 30 °C'de, çalkalamadan 18 ila 48 saat boyunca büyütün; 24 kuyucuklu plakanın her bir sütunu bir modaliteyi temsil eder.Gerektiğinde uygun miktarda kobalt ve antibiyotik eklenir. İlk üç satır, üç tekrarın ortalaması alınarak A yapışkan bakterilerini miktarlandırmak için kullanılır. En soldaki son satır, 18 ila 48 saat sonra kristal viyole boyaması ile biyofilmi görselleştirmek için kullanılır; 24 kuyucuklu plakanın ilk üç satırındaki her bir kuyucuktan planktonik hücreleri içeren süpernatant geri kazanılır ve süpernatant bir hemoliz tüpüne aktarılır.Her bir kuyucuğu bir mililitre M 63 besiyeri ile dikkatlice durulayın ve yıkama sıvısını ilk süpinat ile birlikte hemoliz tüpüne çekin. Bu havuz, S olarak adlandırılan yüzer hücreler olarak tanımlanır. Mikroplakadaki kuyucukların dibi yapışkan hücrelerle kaplıdır. Biyofilmi geri kazanmak için her birine bir mililitre M 63 ekleyin.Pipet ucuyla kazıyın, ardından pipetle yukarı aşağı çekerek biyofilm fraksiyonunu yeni bir hemoliz tüpüne aktarın. Tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin. Biyofilm fraksiyonunu hemoliz tüplerinde toplayın.Bu havuz, yüzeye tutunmuş hücreleri temsil eder. Hemoliz tüplerindeki süpernatant ve biyofilm fraksiyonunun 200 µL'sini 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Yüzeye tutunmuş ve yüzen bakteri sayısını 600 nm'deki optik yoğunluktan tahmin edin. Her bir modalite için yapışma yüzdesi, B x 100 / (3 x S + B) formülü kullanılarak hesaplanır. 24 kuyucuklu plakanın yalnızca son sırasındaki biyofilmi görselleştirmek için, bu kuyucuklardaki plankton hücrelerini uzaklaştırın.Plakanın tabanında gelişen biyofilm tabakasını durulamak için her kuyucuğa bir mililitre M 63 ekleyin. Açık bırakılan plakayı 80 °C'de bir saat boyunca kurutun; bir saat sonra, her kuyucuğa 100 µL %20 kristal viyole ekleyin ve ardından su ile kapsamlı yıkamalar yapın. Bu protokol için floresan bir şasi gereklidir.Sentetik curli taşıyan plazmid için uygun bir konakçı, ana suş MG 1 16 55'ten gözlemlenebilir bir fark olmaksızın konstitütif olarak yeşil floresan protein eksprese eden e coli SCC one suşudur. S 23 suşunu elde etmek için konakçı suşu, sentetik curli taşıyan bir puck 57 plazmidi ile transforme edin. Kontrol suşunu elde etmek için konakçı suşu, kontrol plazmidi puck 18 ile transforme edin.S 23 ve S 24 suşlarının ön kültürlerini 30 °C'de gece boyunca büyütün. Ertesi gün, glikoz ve ampisilin ile takviye edilmiş M 63 besiyerine, bir Petri kabına 20 mL M 63 besiyeri ekleyin ve ardından Petri kaplarındaki 15 mL M 63'ü 100 µL ön kültür ile inoküle edin. Uygun konsantrasyonda kobalt ekleyin ve kobalt içermeyen negatif kontrolü unutmayın.Her bir Petri kabına üç adet dikdörtgen cam lamel yerleştirin. Kapları, çalkalamadan, 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Bakteriler, sonraki günlerde floresan mikroskobu altında doğrudan gözlemlenebilir.Numunenin kurumasını önlemek önemlidir, bu nedenle aşağıdaki adımlar dikkatli ancak hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Her bir lameli Petri kaplarından çıkarın ve dikkatlice süzün. Konfokal gözlem için tüm bakteri kalıntılarını temizlemek amacıyla, alt yüzeyi %70 ethanol emdirilmiş küçük bir pamuklu çubukla dikkatlice temizleyin.Lam üzerine, biofilm yüzeyi yukarı bakacak şekilde lamel yerleştirin. Biofilm daha sonra, cam lam üzerine vernik ile sabitlenen daha büyük bir lamel ile örtülür.Biyofilm şimdi alt yüzde kalacak şekilde düzeneği ters çevirin. Bu deneyde düzeneği konfokal lazer mikroskobunun altına yerleştirin. CT mikro platformu içerisinde bir Zeiss LSM five 10 meta konfokal lazer mikroskobu kullanılmıştır.40x yağ daldırma objektifini seçin. GFP'yi 488 nanometrede uyaracak ve bakteriyel floresansı 500 ila 600 nanometre aralığında toplayacak şu ayarları kullanın. Görüntüleri elde etmek için 40x yağ daldırma objektifini kullanın.Lazer taramalı konfokal modunda, biyofilmlerin katı yüzeyden büyüme ortamı ile olan ara yüze kadar olan genel üç boyutlu yapılarını bir mikronluk adımlarla tarayın.Bir maus yazılımı ile üç boyutlu projeksiyonlar gerçekleştirin, istatistiksel boylamasına kesitler boyunca ortalama C değerinin analizi ile biyofilm kalınlığını belirleyin. Biyofilmin kantifikasyonu ve biyohacimler, konfokal Z yığınlarından çıkarılabilir. Metallere yanıt olarak curly'yi aşırı üretmek üzere mühendisliği yapılmış e coli'nin yapışma yetenekleri basit yöntemlerle değerlendirilebilir.Örneğin, 24 kuyucuklu cilalı Irene plaklarında kristal viyole boyama, mor renk yoğunluğundaki farkla gösterildiği üzere, her kuyucuğun tabanındaki biyofilm oluşumunun hızlıca görselleştirilmesini sağlar. Yabani tip suşun, mühendislik ürünü suşa göre daha az yapışkan olduğu görülmektedir. Kantitatif bir yöntem ise, çeşitli kobalt konsantrasyonları ile yabani tip ve mühendislik ürünü suşların polistirene yapışma yüzdelerini ölçmektir.Bu grafikte sunulan sonuçlar, kobalt yokluğunda mühendislik ürünü suşun yapışma yüzdesinin, yabanı tip suşunkinden 1,5 kat daha yüksek olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrıca, artan kobalt konsantrasyonlarının varlığında yapışmada belirgin bir güçlenme gözlemlenmiş; 25 µM veya 50 µM kobalt konsantrasyonuna sahip ortamlarda, mühendislik ürünü hücrelerin yapışma yüzdeleri sırasıyla %30 ve %40'a ulaşmıştır. Yapışma yetenekleri, cam lamlar üzerinde büyütülen GFP etiketli bakterilerle mikroskopi kullanılarak da karşılaştırılabilir; siyah arka plan üzerindeki yeşil bakterilerin epi-floresan mikroskopi gözlemleri, mühendislik ürünü suşun bir biyofilm oluşturduğunu, yabanı tip suşun ise oklarla belirtilen yalnızca mikro koloniler oluşturduğunu göstermektedir.Konfokal mikroskopi analizi, biyofilmin üç boyutlu yapısına genel bir bakış sağlar. Üstten görünüm rekonstrüksiyonları A panellerinde, yandan görünüm rekonstrüksiyonları ise B panellerinde gösterilmiştir. Sonuçlar, mühendislik ürünü suşun daha yapışkan olduğunu ve yabanı tipe göre daha yoğun ve kalın bir biyofilm oluşturduğunu doğrulamaktadır. Bu prosedür uygulanırken, örneğin radyoaktif atık sular bağlamında modifiye edilmiş e coli veya occus ants'in biyotemsizleme potansiyelini araştırmak için operasyon tasarımını tekrar kontrol etmek önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, klon yönetici yazılımı kullanarak sentetik bir operonun nasıl tasarlanacağı ve bakteriyel suşların ifadesinin nasıl hızlıca nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sentetik genler ve genetiği değiştirilmiş organizmalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken, transforme edilmiş bakterilerin otoklavlanması gibi mevcut yasalara ve önlemlere uygun hareket edilmelidir.

engineering-adherent-bacteria-creating-single-synthetic-curli

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Bu yazıda mühendislik hücreleri ve sentetik kontrol ve programlanabilir malzeme yüzeylerini işlemek için E. coli mühendislik enable işlevselleştirilmiş yüzeylerin geliştirilmesi için bir dizi protokol sunar.

Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bu makalede, düşük maliyetli bir ticari 3D yazıcıyı, desenli biyosilmların yazdırmayı kolaylaştıracak bir bakteriyel 3D yazıcıya dönüştürme yöntemi açıklanır. Bioprinter ve biyo-mürekkep hazırlama tüm gerekli yönleri, hem de biyolojiler oluşumunu değerlendirmek için doğrulama yöntemleri açıklanmıştır.

Bir do-it-yourself Bioprinter ile tasarlanan Biyosilmların üç boyutlu deseni

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Burada, tetrasiklin kontrollü tabanlı indüklenebilir sentetik devrenin tasarlanması, inşası ve teslimi için bir protokol sunulmaktadır. Sentetik devrelerin parazit eliminasyonu ve sitokin ekspresyonu üzerindeki etkisi, sunulan boru hattının kanalize edilmesiyle incelenebilir. Bu protokol, bulaşıcı hastalıklarda sentetik devre tabanlı terapötikler üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir.

Konakçıya Yönelik Tedavileri İlerletmek için Enfeksiyonda İmmünometabolik Devreler

Bu makale, Modüler Klonlamanın (MoClo) polisistronik operonların klonlanması için nasıl uyarlanabileceğini gösteren adım adım bir protokol sunmaktadır.

In-Cloning araç setini kullanarak Modüler Klonlama (MoClo) ile Polisistronik Operonların Standartlaştırılmış Modüler Montajı

Keşfedin sentetik curli operonu tasarımını ve E. coli'de bakteri yapışkanlığını artırma yöntemini. Konfokal mikroskopi ile biyofilm oluşumunu görselleştirin ve kantitatif analiz yapın.

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Daha fazla video keşfet