Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bakterilerin sıvı ortamdan ayrılmalarını kolaylaştırmak için bakterilere yapışık bir özellik kazandırmaktır. Bu, ilk olarak karmaşık genetik düzenlemeyi atlamak ve yapışkan polimerlerin kolay ve büyük üretimini sağlamak için sentetik bir kıvrılma tasarlanarak elde edilir. İkinci adım olarak, yapışık bir bakteri polistiren üzerinde görselleştirilir ve ölçülür, bu da sentetik cihazın verimliliğinin hızlı bir şekilde tahmin edilmesini sağlar.

Daha sonra, yapışık bir bakteri konfokal mikroskopi ile cam üzerinde görselleştirilir. Biyofilmi doğrudan gözlemlemek ve yapısı hakkında bilgi edinmek için, hem yapışma, yüzde ölçümü hem de mikroskobik gözlemlere dayalı olarak sentetik cihazı barındıran suşta önemli bir yapışma artışı gösteren sonuçlar elde edilir. Sentetik biyoloji yaklaşımının konvansiyonel klonlama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, uygun sinyallerle yalnızca mutlak açık gerekli genleri barındıran yapının çok hızlı bir şekilde elde edilebilmesidir.

Bu yöntem, metal yüklü bakterilerin radyoaktif atıklardan uzaklaştırılmasının zorluğunun ele alınması gibi biyoremediasyon alanındaki önemli bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, genetik düzenleyici sinyaller ve veri tabanlarının kullanımı hakkında temel bilgilere ihtiyaç duyulduğundan mücadele eder. Görsel gösterim, biyo filmin nicelleştirilmesine ve görselleştirilmesine odaklanacaktır, çünkü biyoçerçevelerin kırılganlığı nedeniyle bu iki adımın öğrenilmesi çok zordur.

Sentetik leşi tasarlamanın ilk adımı, kıvırcık genlerin genetik organizasyonunu belirlemek ve endojen, transkripsiyonel ve translasyonel sinyallerini lokalize etmektir. Bu, REON DB veya eco gene gibi özel veritabanları kullanılarak gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, kıvırcık sentez, CSGB ve CSGA için kesinlikle gerekli olan beş geni seçmek ve lif monomerlerini kodlamak ve C-S-G-E-C-S-G-F ve CSGG, kıvrılma salgı kompleksini kodlamak, seçilen dizileri veritabanından daha hızlı formatta çıkarmaktır veri yönetimi ve in silico ön analiz, C-S-G-G-F-E kümesi e coli genomunda antisens olduğu için klon yönetici yazılımı ile gerçekleştirilecektir.

Bu dizinin ters tamamlayıcı karşılığına dönüştürülmesi gerekir. Klon yöneticisi araçlarını kullanın, işlem molekülü ters çevirin, fonksiyon ligate'i kullanarak C-S-G-E-F-G dizisini C-S-G-B-A'nın arkasına yapıştırın. Ardından, C-S-G-B-A-E-F-G iCal dizisinin önüne uygun promotör PRCN'yi ekleyin.

RCN lokusu, nikel ve kobalt detoksifikasyonundan sorumlu bir FLX pompası RCNA'yı ve onun akraba metallo regülatörü RCNR'yi kodlar. Kobalt veya nikelin yokluğunda, baskılayıcı RCNR, DNA üzerindeki RCNR kutusuna bağlanır ve aşağı akış genlerinin tam transkripsiyon aktivasyonunu önler. Kobalt veya nikelin hücre içi konsantrasyonu yükselirse, kobalt veya nikelin RCNR proteinine bağlanması, baskılayıcının promotöre sabitlenmesini önler ve seçilen beş kıvırcık genin promotörün kontrolü altına yerleştirilmesiyle P-R-C-N-A'nın transkripsiyonel aktivitesi artar.

PRCN kıvırcıklarının kobalt ve nikel varlığında aşırı üretildiği tahmin edilmektedir. Daha sonra, CS gba'nın ilk A TG'sinin önüne mükemmel bir ribozom bağlanma bölgesi veya RBS, DNA dizisi ve C-S-G-E-F-G dizisinin önüne ikinci bir mükemmel RBS ekleyerek transkripsiyonel sinyalleri optimize edin. I GM standartlarına uymak için, cihazın ECO R one ve X-bar one için kısıtlama bölgeleri içeren standart bir biyo tuğla öneki ve daha fazla montajı kolaylaştırmak için SPE one ve PST one için kısıtlama bölgeleri içeren bir son ek ile çevrili olması gerekir.

Biyo tuğla parçasının kendisi herhangi bir ECO R one, PST bir SPE one ve X-bar R one tanıma siteleri içeremez. Bu nedenle, bu bölgeler sessiz mutasyon değişiklikleri ile elimine edildi, cihazın siliko kısıtlama analizinde bir PST, CSGA dizisinde bir bölge, RCNR dizisinde bir PST, RCNR dizisinde bir bölge ve CSGE geninde bir ECO R ortaya çıktı. Bu bölgeler sessiz mutasyonlarla değiştirildi.

Sentetik opor tasarımı tamamlandıktan sonra, klon yöneticisi yazılımını kullanarak bir çeviri simülasyonu gerçekleştirin. Yabani tip kıvırcık proteinler ile sentetik tarafından kodlanan proteinler arasındaki mükemmel homolojiyi doğrulamak için dizi hizalama programı blast'ı kullanın ve bu prosedürü iki mililitre M 63 içeren 24 kuyulu polistiren plakanın her bir oyuğu için başlatın,% 0.2 glikozlu minimum ortam, her kuyucuğu bir gecede bakteri kültürünün 10 ila altı hücresi ile aşılayın. Bakterileri 30 santigrat derecede 18 ila 48 saat boyunca sallamadan büyütün, 24 oyuklu plakanın her bir sütunu bir modaliteyi temsil eder.

İhtiyaç duyulduğunda uygun miktarda kobalt ve antibiyotik eklenir. İlk üç sıra, üç tekrarın ortalamasını alarak A'ya bağlı bakterileri ölçmek için kullanılır. Kalan son sıra, 18 ila 48 saat sonra kristal viyole boyama ile biyofilmi görselleştirmek, 24 oyuklu plakanın ilk üç sırasından her bir oyuktan planktonik hücreleri içeren supinatı geri kazanmak ve supinatı bir hemoliz tüpüne aktarmak için kullanılır.

Her bir kuyuyu bir mililitre M 63 ortamı ile dikkatlice durulayın ve yıkamayı ilk supinat ile hemoliz tüpüne çekin. Bu havuza S adı verilen yüzme hücreleri denir ve mikroplaka içindeki kuyucukların dibi yapışık hücrelerle kaplıdır. Biyofilmi geri kazanmak için her birine bir mililitre M 63 ekleyin.

Pipet ucuyla iyice kazıyın ve ardından yukarı ve aşağı pipetleyin ve biyofilm fraksiyonunu yeni bir hemoliz tüpüne aktarın. Tüpü 15 saniye boyunca girdaplayın. Biyofilm fraksiyonunu hemoliz tüplerinde toplayın.

Bu havuz, hemoliz tüplerinden 200 mikrolitre supinat ve biyofilm fraksiyonunu 96 oyuklu bir plakaya transfer eden B adı verilen yüzeye bağlı hücreleri temsil eder. 600 nanometredeki optik yoğunluktan yüzeye bağlı ve yüzen bakteri sayısını tahmin edin. Her bir modalite için yapışma yüzdesi, B çarpı 100'ün üç katı S artı formülü kullanılarak hesaplanır B.To 24'ün yalnızca son sırası için biyofilmi görselleştirin, kuyu plakası plankton hücrelerini bu kuyucuklardan atar.

Plakanın dibinde gelişen biyofilmi durulamak için her oyuğa bir mililitre M 63 ekleyin. Üstü açık plakayı bir saat sonra 80 santigrat derecede bir saat kurutun, her kuyucuğa iki kez 100 mikrolitre% 20 kristal menekşe ekleyin ve ardından suyla iyice yıkayın. Bu protokol için floresan bir kasa gereklidir.

Sentetik kıvırcığı taşıyan plazmit için uygun bir konakçı, ana suş MG 1 16 55'ten gözlemlenebilir bir fark olmaksızın yeşil floresan proteini yapısal olarak eksprese eden e coli SCC bir suştur. S 23 suşunu elde etmek için konak suşunu sentetik kıvrılmayı taşıyan bir disk 57 plazmidi ile dönüştürün. Kontrol suşunu elde etmek için konak suşunu bir kontrol plazmid diski 18 ile dönüştürün.

S 24, S 23 ve S 24 suşlarının ön kültürlerini 30 santigrat derecede gece boyunca büyür. Ertesi gün glikoz ve ampisilin ile takviye edilmiş M 63 ortamında, bir Petri kabına 20 mililitre M 63 ortamı ekleyin ve ardından Petri kaplarına 15 mililitre M 63'ü 100 mikrolitre ön kültür ile aşılayın. Uygun kobalt konsantrasyonunu ekleyin ve kobalt olmadan negatif kontrolü unutmayın.

Her Petri kabına üç dikdörtgen cam kapak yerleştirin. Bulaşıkları gece boyunca 30 santigrat derecede çalkalamadan inkübe edin. Bakteriler sonraki günlerde doğrudan floresan mikroskop altında görüntülenebilir.

Numunenin kurumasını önlemek önemlidir, bu nedenle aşağıdaki adımlar dikkatli ama hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Petri kaplarından her bir kapak fişini çıkarın ve dikkatlice boşaltın. Konfokal gözlem için tüm bakteri kalıntılarını silmek için alt yüzü %70 etanol ile ıslatılmış küçük bir pamuklu çubukla dikkatlice temizleyin.

Kapak fişini, üst yüzü biyofilm ile kaplı, yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirilmiş bir cam kaydırak üzerine koyun. Biyofilm daha sonra cama sabitlenen daha büyük bir kapak astarı ile kaplanır. Vernik ile kaydırın.

Biyofilm şimdi alt yüzde olacak şekilde kurulumu ters çevirin. Bu deneyde kurulumu konfokal lazer mikroskobunun altına yerleştirin. CT mikro platformunda bir Zeiss LSM beş 10 meta konfokal lazer mikroskobu kullanılır.

40 kez yağa daldırma hedefini seçin. Aşağıdaki ayarları kullanın, GFP'yi 4 88 nanometrede uyarın ve bakteriyel floresansı 500 ila 600 nanometre aralığında toplayın. Görüntüleri elde etmek için 40 kez yağa daldırma hedefini kullanın.

Lazer tarama konfokal modunda. Biyofilmlerin genel üç boyutlu yapılarını katı yüzeyden büyüme ortamı ile arayüze kadar tarayın. Bir mikronluk bir adım kullanarak.

Bir maus yazılımı ile üç boyutlu projeksiyonlar gerçekleştirin, istatistiksel boylamsal kesitler boyunca ortalama C değerinin analizi ile biyofilm kalınlığını belirleyin. Biyofilmin miktar tayini, biyo hacimler konfokal Z yığınlarından çıkarılabilir. Metale tepki olarak aşırı kıvırcık üretmek için tasarlanmış e coli'nin yapışma yetenekleri basit yöntemlerle değerlendirilebilir.

Örneğin, 24 iyi cilalanmış Irene plakası üzerindeki kristal viyole boyama, mor renk yoğunluğundaki farkla gösterildiği gibi, her bir oyuğun dibinde biyofilm oluşumunun hızlı bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Görünüşe göre vahşi tip suş, mühendislik suşundan daha az yapışıktır. Kantitatif bir yöntem, vahşi tipteki polistiren ve çeşitli kobalt konsantrasyonları ile tasarlanmış suşlar üzerindeki yapışma yüzdelerini ölçmektir.

Bu grafikte sunulan sonuçlar, mühendislik suşunun yüzde bağlılığının, kobalt yokluğunda vahşi tip suşunkinden 1,5 kat daha yüksek olduğunu ortaya koymaktadır. Ek olarak, 25 mikromolar veya 50 mikromolar kobalt konsantrasyonlarının yapışma mühendisliği hücrelerinin yüzdeleri sırasıyla %30 ve %40'a ulaşan ortamlarda artan kobalt konsantrasyonlarının varlığında önemli bir yapışma takviyesi gözlenmiştir. Yapışma yetenekleri, cam slaytlar üzerinde yetiştirilen GFP etiketli bakterilerle mikroskopi kullanılarak da karşılaştırılabilir, yeşil bakterilerin siyah bir arka plan üzerinde epi floresan mikroskobu gözlemleri, tasarlanmış suşun bir biyofilm oluşturduğunu, vahşi trippe suşunun ise yalnızca oklarla gösterilen mikro koloniler oluşturduğunu ortaya koymaktadır.

Konfokal mikroskopi analizi, biyofilm üç boyutlu yapının genel bir görünümünü sağlar. Üstten görünüm rekonstrüksiyonları panel A'da ve yandan görünüm rekonstrüksiyonları panel B'de gösterilmiştir.Sonuçlar, mühendislik suşunun daha yapışkan olduğunu ve vahşi tipten daha yoğun ve daha kalın bir biyofilm oluşturduğunu doğrulamaktadır. Bu prosedürü denerken, örneğin radyoaktif atık su bağlamında modifiye e coli veya occus karıncalarının biyo aracılık potansiyelini araştırmak için operasyon tasarımını iki kez kontrol etmek önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, klon yöneticisi yazılımı kullanılarak sentetik bir açıklığın nasıl tasarlanacağını ve bakteri suşlarının ifadesinin nasıl hızlı bir şekilde ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Sentetik genler ve genetiği değiştirilmiş organizmalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Mevcut yasalara göre tabi olmaları gerekir ve bu işlem yapılırken otoklavla dönüştürülmüş bakteriler gibi önlemler her zaman alınmalıdır.