Fetal Fare Visseral Organlardan Otonom Sinir progenitörlerin Floresans aktive Hücre Sıralama (FACS) İzolasyon için bir optimize Prosedürü

Bu prosedürün genel amacı, periferik sinir sistemi gangliyonlarından saflaştırılmış nöronal progenitörlerin bir popülasyonunu elde etmektir. Bu, önce fetal farelerden ilgilenilen organın veya spesifik gangliyonların diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Dokular daha sonra tek tek hücreleri çevredeki ortama serbest bırakmak için kısmen ayrışır.

Daha sonra, hücre süspansiyonu, artık doku kümelerini veya büyük agregaları uzaklaştırmak için filtrelenir. Son olarak, hücre süspansiyonu, o hücre popülasyonundaki bir floresan raportörün ifadesine dayalı olarak ilgilenilen popülasyonu izole etmek için akış sıralanır. Sonuç olarak, gen ekspresyon paternleri, gelişimin farklı aşamalarında izole edilen progenitörler arasında veya farklı nöronal hücre tiplerinin saflaştırılmış popülasyonları arasında karşılaştırılabilir.

Bu tekniğin, antikor etiketlemesine dayalı hücre popülasyonlarının izolasyonuna göre ana avantajı, genellikle immün reaktiflerin mevcut olmamasıdır. Belirli bir geni ifade eden hücreleri etiketleyen, ayrı nöronal alt kümelerde floresan protein üreten genetik olarak tasarlanmış fare hatları, bu hücre popülasyonlarının izolasyonunu sağlar. Bu yöntemi nöral progenitörlerin bağırsaktan izolasyonu ve ağzın nörojen izi için göstersek de, floresan raportörleri ifade eden diğer model sistemlere de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, kaynak dokuları aşırı sindirme eğiliminde oldukları için mücadele edeceklerdir ve bu da hücre canlılığının kaybına neden olur. Diseksiyona başlamadan önce, ilgili yapıların odakta olduğundan emin olmak için embriyoları parlak alan aydınlatması ile görüntüleyin. Daha sonra, bir floresan stereo mikroskop kullanarak floresan raportörün ekspresyonunu tarayarak transgen pozitif embriyoları tanımlayın.

Ötenaziden sonra, embriyolar diseksiyon kabına minimum miktarda PBS ekleyerek başlar, böylece dokular diseke edilirken embriyo yüzmez. Embriyonun derisini vücudun yanları boyunca ve karın boyunca karaciğer seviyesinde açın. Embriyoyu sırt üstü yuvarlayın ve yerine sabitlemek için ince forseps kullanın.

Ön ayak seviyesinde, diyafram seviyesine başka bir forseps çifti yerleştirin ve ardından hızlı bir şekilde yerleştirin. İç organları kuyruğa doğru aşağı çekin ve iç organları karaciğerden genital tüberküle kadar çıkarmak için sırt vücut duvarından uzağa çekin. Göğüs boşluğundan kalp veya akciğerler gibi herhangi bir organ iç organlara bağlı olarak çıkarsa, daha fazla ilerlemeden önce bunları çıkarın.

Karın iç organları karkastan ayrıldıktan sonra, karaciğerin altına, midenin yanına bir çift forseps yerleştirin ve karaciğeri bağırsaktan nazikçe uzaklaştırın. Daha sonra arka bağırsağı dorsal üretradan dikkatlice inceleyin ve bağırsağı ürogenital sistemden çıkarın. Son olarak, dalağın midenin altında görünmesi için bağırsağı ters çevirin.

Dalak ve pankreası çıkarın. Mesentary'ye tutunarak bağırsak halkalarını ayırın. Daha sonra mezenteri ve beraberindeki damar sistemini bağırsaktan nazikçe çekerek çıkarın.

Bağırsağı doğrudan forseps ile tutmaktan kaçının. Bağırsak kırılırsa, ayrışma aşamasında ayrı parçaları bir araya getirin. Her doku tipini, doku tipine ve embriyo fenotip tipine göre buz gibi HBSS içeren 15 mililitrelik konik bir tüpte bir araya getirin.

Peletlemeden sonra, alt diseke edilmiş dokular mümkün olduğu kadar çok HBSS'yi aspire eder. Daha sonra doku peletini maksimum bir ila birkaç mililitre ACU içinde yeniden süspanse edin. Her numune arasında pipet uçlarının değiştirilmesi.

Doku tiplerinin çapraz kontaminasyonunu önlemek için, tüpleri 20 ila 45 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. İzole edilen dokunun aşamasına bağlı olarak, dokunun ayrışması ve filtrelenmesi, dokunun açık ayrışmasını önlemek için prosedürün en zor kısmıdır. Ve sonuç olarak, düşük hücre canlılığı.

Ayrışma süresini sınırlayın ve tüm doku parçalarını yarıya kadar tamamen ayırmaya çalışmayın. Ve ayrışma süresinin sonunda, tüpü su banyosunun kenarına kuvvetlice vurarak ve tüpü bir bilek hareketiyle aşağı fırlatarak dokuyu manuel olarak parçalayın. Şimdi ayrışmış numuneleri buzun üzerine taşıyın ve her numune için yeni bir pipet ucu kullanarak her tüpe hemen bir mililitre taze hazırlanmış su verme ekleyin, doku neredeyse tamamen ayrışana kadar numuneyi yukarı ve aşağı doğru itin.

Şimdi bir çift etanol sterilize forseps kullanarak, yeni bir 15 mililitrelik konik tüpün ağzına üç santimetre kare 38 mikron naylon örgü zar yerleştirin. Ardından, zarın merkezine pipetleyerek tek tek yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini ağ boyunca filtrelemek için dar delikli uçlar kullanın. Hücre süspansiyonu filtrelendikten sonra, numune tüpünü bir ila beş mililitre söndürme ile durulayın ve kalan hücreleri filtreleyin.

Ardından, filtrelenmemiş doku örneklerinin tüpe girmesini önlemek için dikkatli olarak zarı çıkarın. Peletlemeden sonra, hücre süspansiyonları süpernatanı aspire eder ve peleti bir ila beş mililitre söndürmede yeniden süspanse eder. Ardından, her bir hücre süspansiyonunu naylon bir ağdan geçirilerek az önce gösterildiği gibi beş mililitrelik polistiren tüplere süzün.

Yalnızca EGFP kompanzasyon kontrolü için floresan numunesinin küçük bir alikotunu rezerve ederek başlayın. Daha sonra yabani tip doku örneğini iki kısma bölün, biri yalnızca yabani tip ve diğer yedisi A a d.Only olarak etiketleyin. Şimdi tüm numune tüplerini bir ila beş su ile doldurun ve numuneleri peletledikten sonra her tüpteki son 200 mikrolitre süpernatan hariç hepsini aspire edin.

Son olarak, sıralanacak örneklere yedi a a d ekleyin ve yalnızca yedi a d kontrolünü ekleyin. Daha sonra 1.5 mililitre mikro santrifüje 0.75 mililitre triazol LS ekleyin. Numune toplama tüpleri, yedi A D pozitif ölü hücreden kaçınmak ve yüksek yoğunlukta GFP floresan sergileyen hücreleri toplamak için kompanzasyon parametrelerini ve kapıları ayarlamak için kontrol numunelerini kullanarak başlar.

Kompanzasyon parametrelerini ayarladıktan sonra, geniş delikli bir nozul ve düşük akış hızı ile mümkün olan en düşük basınçta ayırmaya başlayın. Triol LS'nin aşırı seyreltilmemesi için her bir mikro santrifüj tüpüne maksimum 25.000 hücre toplayın. Girdabı sıraladıktan hemen sonra, her bir hücre tüpü triol l'de yakalanır.

Bu ilk şekilde, koitustan 15.5 gün sonra, parlak alan aydınlatması altında ventral olarak görüntülenen bütün bir Euro genital sistemi burada gösterilmektedir. Aynı örnek, TH EGFP transgen ekspresyonu ile tanımlandığı gibi adrenal ve medial yerleşimli çölyak gangliyonlarındaki EGFP pozitif hücrelerin dağılımını göstermek için floresan aydınlatma altında görüntülenir. Kotus TH EGFP subdiseke mesanesinden 15.5 gün sonra bu lateral görünüm, pelvik gangliyonlar, mesane duvarı ve üretradaki transgen ekspresyonundan floresan gösterir.

Aynı EGFP'nin bu dorsal görünümünde, pozitif hücreler, akış için hücre süspansiyonları üretmek üzere ön dorsal üretra doku ayrışmasında belirgindir: sıralama, yeterli enzimatik sindirim ile düşük hücre değişkenliklerine neden olabilecek aşırı sindirimden kaçınma arasında hassas bir dengedir. Bu foto mikrograflar, ayrışma süresinin yarısında alt ürogenital sistem ve bağırsak dokularını gösterir. Manuel öncesi ve sonrası uygun şekilde sindirilmiş dokunun bu fotoğraflarında görüldüğü gibi, üç parça alt diseke edilmiş organ, enzimatik olarak çok uzun süre veya çok yüksek bir enzim konsantrasyonunda tedavi edilen dokularda hala açıkça görülmektedir.

Bununla birlikte, ortaya çıkan süspansiyon, herhangi bir kalıntı büyük doku parçasına uygun ayrışmadan yoksundur ve manuel filtreleme, tipik olarak% 90'dan daha fazla yaşayabilir hücreler sergileyen akış sitometri profilleri üretir ve bu canlı popülasyonda raportörü ifade eden hücreler, hücreler yüksek yoğunluklu EGFP ekspresyonunu korur. Siyah popülasyon, ölü olan ve yedi a d floresan kalıbının alınmasıyla etiketlenen tek hücrelerden oluşur. Gri popülasyon, yedi a a d'yi dışlayan ve bu nedenle canlı olan ileri ve yan saçılmaya dayalı singlet hücrelerden oluşur.

Yeşil popülasyon, kapılı GFP pozitif alandandır ve yedi A a d'yi dışlayan ve EGFP floresan sergileyen tek canlı hücrelerden oluşur. Bu prosedürle, nöronal progenitörlerin sempatik zincir, dorsal kök, gangliyonlar veya akciğer gibi diğer periferik dokulardan izolasyonu, popülasyonlar arasındaki gen ekspresyon profillerindeki farklılıklar veya farklı soyların gelişimi hakkındaki soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.