Dıştan Uygulanan Doğru Akım Elektrik Alanında Nöral Prekürsör Hücre Göç Kinetik Analizi için galvanotaksis Assay

Bu prosedürün genel amacı, doğru akım elektrik alanı varlığında yetişkin kaynaklı nöral öncü hücrelerin göçünü görselleştirmektir. Bu, ilk olarak yetişkin fareden subependimal nöral öncü hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, Galvan Axxis odacıklarının hazırlanması ve nöral öncü hücrelerin odacıklara aktarılmasıdır.

Son adım, Galvan Axxis odası boyunca bir doğru akım elektrik alanı uygulamak ve nöro öncülerin göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış görüntüleme yapmaktır. Sonuç olarak, hızlandırılmış görüntüleme mikroskobu, nöro öncüllerin Galvan taktik özelliklerini farklılaşmış ve farklılaşmamış durumlarında yakalar. Bu yöntem, nöro öncü hücre galvaniz vahası hakkında bilgi sağlayabilse de, nöro onarımı geliştirmek için lezyon bölgelerine nöro öncüllerin işe alınması için bir fare vuruş modeli gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Rob Pilley Post olacak. Bu prosedüre başlarken, NPC'lerin yedi gün boyunca kültürde kalmış olması gerekir, böylece serbest yüzen birincil nörosferler hasat etmeye hazırdır. Gerektiğinde, üç kare cam yerleştirerek üç Galvan Axxis haznesi hazırlamaya başlayın.

Birincisi, gece boyunca altı normal hidroklorik asit şişesinde kapak kaymaları. Ertesi gün erken saatlerde, matra jelini buz üzerinde yavaşça çözülecek şekilde ayarlayın. Dört saat sonra, odayı inşa etmek için kullanıma hazır olacaktır.

İlk olarak, yeni kareden altı dikdörtgen cam şeridi kesmek için elmas uçlu bir cam kesici kullanın. Birincisi, kapak fişleri. Asitle yıkanmış kare kızakları ve dikdörtgen kızakları laminer bir akış başlığına aktarın.

Cam şeritleri %70 etanol ve ardından doku kültürü dereceli otoklav suyu ile yıkayın. Havada kurumaya bırakın veya tüy bırakmayan kağıt üzerinde kurutun. Ardından, her kare cam sürgünün bir yüzeyinin çevresine vakumlu gres sürün ve bunları 60 milimetre plastiğin tabanına kapatın.

Petri kapları. Dikdörtgen cam şeritlerin bir tarafına vakumlu gres sürün ve bunları karenin karşı kenarlarına kapatın. Cam, her yemeğin ortasında merkezi bir oluk bulunan kareler oluşturmak için kayar.

Bu modifiye edilmiş cam kareleri veya odaları bir başlıkta en az 15 dakika UV ile sterilize edin. Daha sonra, odaların merkezi oluğuna 250 ila 300 mikrolitre poliol lizin pipetleyin. Daha sonra odaları, inkübasyon sona ermeden yaklaşık 15 dakika önce, iki saat oda sıcaklığında inkübe edin.

Matri jel çözeltisini iki saat sonra hazırlayın, poliol lizini aspire edin ve merkezi olukları bir mililitre otoklav suyuyla yıkayın. Daha sonra 250 ila 300 mikrolitre Matri jel solüsyonunu merkezi oluklara pipetleyin ve odaları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, matrigel çözeltisini aspire edin.

Ardından merkezi olukları bir ila iki mililitre SFM ile nazikçe yıkayın. Şimdi kültürlenmiş hücrelere hazırlık olarak 100 mikrolitre E-F-H-S-F-M veya F-B-S-S-F-M pipetleyin. Daha sonra, kültür içeren nöros küresinin dört ila beş mililitresini yeni bir 60 milimetrelik Petri kabına pipetleyin.

Ardından Petri kabını, beş x görüntüleme objektifinin altındaki sayma mikroskobunun sahnesine yerleştirin. Beş ila sekiz tam nöroküreyi her odanın merkezi oluğuna nazikçe aktarmak için bir P 10 pipeti kullanın. Dörde kadar.

Nörosferler bir kerede transfer edilebilir, ancak bunları merkezi oluklardaki nörosferlerle ayırmaz. Matrigel alt tabakasını bozmadan dikkatlice etrafa yayın. Daha sonra merkezi oluklara 150 mikrolitre daha E-F-H-S-F-M veya F-B-S-S-F-M ekleyin.

Şimdi kültür, nemlendirilmiş bir inkübatördeki hücreler. Kültürde 17 ila 20 saat sonra, farklılaşmamış NPC'ler 69 ila 72 saat sonra kullanılabilir olacaktır. Kültürde, farklılaştırılmış NPC'ler mevcut olacaktır.

Muhasebe mikroskobu altında, canlı hücre görüntüleme migrasyon analizi için en iyi hücrelere sahip odayı seçin. Hücreler yuvarlak, nörosferlerinden neredeyse tamamen ayrılmış olmalı ve henüz bir başlıkta süreçler oluşturmaya başlamamış veya yeni başlamış olmalıdır. Bir hazne kapağı hazırlayın.

Kare bir cam kapak astarını %70 etanol ile, ardından otoklavlanmış su ile yıkayın ve iki paralel kenara bir şerit vakumlu gres uygulayın. Şimdi odayı örtün. İlk olarak, kültür ortamını merkezi oluktan aspire edin ve ardından kapağı hızlı bir şekilde kapatın, bir çatı gibi dikdörtgen duvarlara kaydırın.

Daha sonra, kılcal hareket kullanarak, merkezi oluğa 100 mikrolitre taze ortam yükleyin. Şimdi kültür ortamı havuzları için kenarlıklar oluşturmak için vakumlu gres kullanın. Canlı hücre görüntüleme sistemindeki merkezi oluğun her iki ucunda, kullanılacak agros jel tüpleri, gümüş, gümüş klorür elektrotları ve iki adet 60 milimetrelik petri kabı hazırlanmıştır.

Kültür ortamı rezervuarları olarak, odaların 37 santigrat derece %5 karbondioksit ortamında 20 ila 30 dakika dinlenmesine izin verin. Bu süre zarfında, iki boş Petri kabının kapaklarını ve Galvan Axxis hazneli Petri kabının kapağını, bir Dremel veya alet pipeti ile delikler açarak, merkezi oluğun her iki tarafına 1,5 ila iki mililitre ortam açarak hazırlayın ve her boş Petri kabına yedi ila sekiz mililitre SFM ekleyin. Odanın merkezi oluğunun her iki tarafına bir Petri kabı yerleştirin ve her tabağa bir elektrot yerleştirin.

Elektriksel sürekliliği sağlamak için hazne ile Petri kapları arasındaki boşluğu doldurun. Agros jel köprüleri ile, elektrik akımını ölçmek ve güç kaynağını açmak için elektrotları seri olarak bir M metre ile harici bir güç kaynağına bağlayın. Doğrudan merkezi oluk boyunca elektrik alanının gücünü ölçmek için bir hacim ölçer kullanın.

Güç kaynağının çıkışını gerektiği gibi ayarlayın. Şimdi görüntüleme sisteminde hızlandırılmış modülü başlatın. Axio vision yazılımında Çok boyutlu edinimi seçin ve gör'e tıklayın.

Kanallar için altıncı kanalı seçin, hızlandırılmış çekim için T'ye tıklayın. Zaman atlamalı aralık ayarlarını bir dakikaya ayarlayın, zaman noktasından önce, sonra ayarları alanlarında süreyi sekiz saate ayarlayın, zaman noktasından önce ve sonra zaman noktasını seçin. Şimdi başlat'a tıklayın ve deneyin tahlil tamamlandıktan sonra istenen süre boyunca çalışmasına izin verin, IHC analizi ile devam edin.

Kinematik analiz, milimetre başına 250 milivolt DCEF varlığında, farklılaşmamış NPC'lerin, bu alan kuvvetinde katoda doğru yüksek oranda yönlendirilmiş ve hızlı galvan axxis sergilediğini, farklılaşmamış NPC'lerin %98'inden fazlasının, görüntülendikleri altı ila sekiz saatin tamamı boyunca göç ettiğini ortaya koydu. A-D-C-E-F'nin yokluğunda. Hücrelerin rastgele hareketi gözlendi.

Ölü hücreler göç etmediğinden, bu süre zarfında canlı kaldıklarını gösterir. A-D-C-E-F'nin yokluğunda veya varlığında, farklılaşmış fenotipler, farklılaşmış hücrelerin A-D-C-E-F alt kümelerinin hem varlığında hem de yokluğunda ihmal edilebilir bir göçe uğramıştır. DCEF'in yönüne dik olarak hizalanma eğiliminde olan genişletilmiş süreçler, ancak gözle görülür bir hücre gövdesi translokasyonu gözlenmedi.

İmmün boyama, NPC'lerin altı saatlik DC EF maruziyetinden sonra nöral öncü belirteç yuvasının pozitif ekspresyonunu sürdürdüğünü doğruladı. Olgun fenotiplere farklılaşmak için indüklenen NPC'leri içeren tahlillerde, hücrelerin çoğu, altı saatlik DCEF maruziyetinden sonra olgun astrosit işaretleyici glial fibriler asidik proteini veya GFAP'yi eksprese eder. Bu prosedürü takiben, genetik nakavt modelleri kullanılarak doğru akım elektrik alanının hücre motilitesine dönüştürülmesinde rol oynayan hücresel mekanizmalar hakkında bilgi edinilebilir.

Ya da efendim, örneğin.