Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, elektrik veya laboratuvar altyapısına ihtiyaç duymadan bir örnekten PCR'a hazır nükleik asitleri ve immünoreaktif proteini izole etmektir. Nükleik asitlerin ve proteinlerin izolasyonu, örneği liziz etmek için örneğin guanidin ve tiyosiyanat ile karıştırılması ve karışımın ekstraksiyon pipetindeki sorbent üzerinden geçirilmesiyle başlar. Sorbent üzerinden geçirilen beşinci ve son işlemden sonra, immünoreaktif proteini izole etmek için karışımı protein ekstraksiyon tamponuna aktarın ve bir kenara ayırın.

Ardından, sorbent üzerinden %95 ethanol geçirilerek sorbent ve bağlanmış nükleik asitler yıkanır. Daha sonra, sorbent üzerinden beş dakika boyunca ortam havası geçirilerek sorbent ve bağlanmış nükleik asitler birçok kez kurutulur. PCR'a hazır nükleik asit izolasyonu için son adım, immünoreaktif protein izolasyonu amacıyla 250 µL tris veya benzer bir sulu çözelti kullanarak nükleik asitlerin sorbentten ayrıştırılmasıdır.

Numune ve protein ekstraksiyon tamponu karıştırıldıktan sonra, ikinci bir ekstraksiyon pipeti kullanarak karışımı 15 kez sorbent üzerinden geçirin. Bir sonraki adım, %95 ethanol'ü sorbent üzerinden defalarca geçirerek, bağlı proteinle birlikte sorbentin yıkanmasıdır. Ardından, beş dakika boyunca sorbent üzerinden ortam havası geçirilerek sorbent ve bağlı protein kurutulur.

Protokolün son adımı, proteinin sorbentten elüe edilmesidir. Nihayetinde, bu prosedürde kullanılan ekstraksiyon pipeti, PCR'a hazır nükleik asitlerin ve immünoreaktif proteinlerin elektrik gerektirmeden izole edilmesini sağlar. Merhaba, benim adım Dave Pawlowski.

Buffalo, New York'taki Kubrick Incorporated şirketinde kıdemli araştırma bilimcisiyim; bugün, örnek lize öncesinde santrifüj, vorteks veya başka herhangi bir harici laboratuvar ekipmanına ihtiyaç duymadan, proteinleri ve nükleik asitleri aynı hat üzerinde izole edecek bir tekniği öğreneceğiz. Örneklerin sıvı formda olduğundan emin olun. Eğer örnek katıysa (örneğin gıda veya dışkı), örnek su veya fosfat tamponlu salin gibi sıvı bir ortama süspanse edilmelidir.

Bir 1,5 ml'lik tüp içerisinde 500 µL örneği, 500 µL 6 M guanidin tiyosiyanat ile karıştırın. Ardından, ortam havasını tahliye etmek için bir ekstraksiyon pipetinin lastik kısmını sıkın. Lastiğin yavaşça genişlemesine izin vererek, 1 ml'lik örneğin tamamını emici materyal üzerinden ekstraksiyon pipetine çekin.

Sorbent boncukların ve numunenin hazneye akması için ekstraksiyon aracını ters çevirin. Hazne içindeki numune ile birlikte sorbent boncukları öğütün. Bu sırada numunenin ekstraksiyon pipetinden dışarı çıkmamasına dikkat edin.

Ekstraksiyon pipetini ters çevirin ve örneği orijinal 1,5 mililitrelik tüpe boşaltın. Bir mililitrelik örneğin tamamını, sorbent üzerinden orta hızla geçecek şekilde ekstraksiyon pipetine çekin. Sorbenti ekstraksiyon pipetinin boyun kısmında tutmaya dikkat ederek, pompayı sıkarak örneğin tamamını 1,5 mililitrelik tüpe boşaltın.

Örnek sorbent üzerinden toplam beş kez geçecek şekilde, bu işlemi dört kez daha tekrarlayın. Sorbent üzerinden beşinci geçişten sonra, bir mililitrelik örneğin tamamını 15 mililitrelik konik bir tüp içindeki dört mililitre protein ekstraksiyon tamponuna boşaltın. Tüpü ters çevirerek karıştırın, ardından tüpü kapatın ve daha sonraki kullanım için kenara ayırın.

Bir mililitre %95 etanolü sorbent üzerinden üç kez geçirerek izole edilen nükleik asitleri yıkayın ve etanolü orijinal tüpüne geri aktarın. Son geçişten sonra, ikinci bir mililitre %95 etanol yıkama solüsyonu kullanarak yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Prosedürün bir sonraki adımı sorbentin kurutulmasıdır; nükleik asit geri kazanımı sorbent kuruyken en iyi şekilde gerçekleştirilir.

Bu adımın sıkıcı olduğunun farkındayım. Ancak, bu adımı önerilen zaman diliminde tamamlarsanız sonuçlarınız daha iyi olacaktır. Pompayı beş dakika boyunca bastırıp bırakın.

Nükleik asitleri ve sorbent yatağını kurutmak için ekstraksiyon pipetinin içinden ortam havası geçirin ve ekstraksiyon pipetinin ucundaki kalıntı etanolü silin. Bir Kim wipe kullanarak, sorbent üzerinden beş kez 250 µL 10 mM Tris geçirerek nükleik asitleri geri kazanın. Tris tamponu, PBS gibi uygun herhangi bir başka sulu çözelti ile değiştirilebilir.

Elde edilen çözelti, ekstre edilmiş nükleik asitleri içerir; protein ekstraksiyonunu önce gerçekleştirmek için, tüpü tersyüz ederek numuneyi önceden ayrılmış protein ekstraksiyon tamponu ile karıştırın, bu 5 mL'lik numunenin yaklaşık iki ila üç mililitresini yeni bir ekstraksiyon pipetinin sorbentine aktarın. Tüm numuneyi aynı 15 mL'lik konik tüpe pipetle boşaltın. Ekstraksiyon pipetinin boyun kısmındaki sorbenti tutmaya dikkat edin.

Bu işlemi tekrarlayın. Numuneyi sorbent üzerinden 15 kez geçirin. Sorbent yatağı üzerinden üç kez bir mililitre %95 Ethanol geçirerek sorbenti ve bağlanan proteini yıkayın, etanolü orijinal tüpüne boşaltın; ardından ikinci bir mililitre %95 ethanol yıkama çözeltisi kullanarak üç kez daha yıkayın.

Prosedürün bir sonraki adımı, sorbentin tekrar kurutulmasıdır. Nükleik asitlerde olduğu gibi, protein geri kazanımı sorbent daha uzun bir süre kurutulduğunda en iyi şekilde gerçekleştirilir.

Ortam havasını ekstraksiyon pipeti boyunca geçirerek ampulü beş dakika boyunca bastırıp bırakın. Protein sorbent yatağını kurutmak için ekstraksiyon pipetinin ucundaki kalıntı etanolü silin. Bir Kim wipe kullanarak, sorbent üzerinden beş kez 250 µL PBS geçirerek proteini geri kazanın.

PBS tamponu, 10 milimolar tris, pH 6,8 gibi uygun herhangi bir başka sulu çözelti ile değiştirilebilir. Elde edilen çözelti, numunenin protein içeriğini barındırır. Enterohemorajik E. coli O157:H7 suşu EDL933 ile ilişkili shiga toksini genleri, ekstraksiyon pipeti kullanılarak gerçekleştirilen bir nükleik asit protein ekstraksiyon prosedürü ile amplifiye edilmiştir.

Shiga toksini genleri olan Shiga toksin bir ve Shiga toksin iki, PR promotörünün kontrolü altında, temperat lambda benzeri bakteriyofajlarda ve defektif bakteriyofajlarda bulunur. E. coli'de SOS yanıtının aktivasyonu, profaj indüksiyonuna ve/veya toksin üretimine yol açar. Bu durumda, SOS yanıtı mitomisin C ile indüklenmiş hücrelerde, işlem görmemiş kontrole kıyasla Shiga toksin iki geninin amplifikasyonunda büyük bir artış görülmektedir.

Bu durum, profaj indüksiyonuna ve faj genom replikasyonuna işaret etmektedir. Videoda açıklanan nükleik asit-protein izolasyon deneylerinden geri kazanılan protein immünoreaktiftir. İzole edilen protein fraksiyonu, hızlı kontrol e coli O 1 57 lateral akış analiz şeritlerine uygulanmıştır.

Kontroller, iki kırmızı bandın varlığıyla görselleştirildiği üzere, Shiga toksini indüksiyonu olsun veya olmasın, E. coli O157 taşıyan tüm örneklerde pozitif bir tanımlama göstermektedir. Veriler ayrıca, nükleik asit ve protein işlemleri ekstraksiyon pipeti kullanılarak gerçekleştirilen E. coli O157 taşıyan örnekler için de pozitif sonuçlar göstermektedir. Bu veriler, her bir örnekten izole edilen proteinin immünaktif olduğunu ve böylece pozitif bir yanıtı tetiklediğini göstermektedir.

İzole edilen protein, altı molar gudina izotiyosiyanat ile izole edilmiş BSA yüklenmiş ve kumasi ile boyanmış %8'lik akrilamid jelinde burada gösterildiği gibi elektroforez için uygundur. Ekstraksiyon, pipetleme ve ilgili protokol kullanıldığında, izole edilen proteinin elektroforetik hareketliliği kontrol örneklerininki ile aynıdır. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem 20 dakikanın altında tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, basit cihazdan proteinlerin ve nükleik asitlerin nasıl izole edileceği konusunda net bir anlayışa sahip olmalısınız. Videomuzu izlemeye vakit ayırdığınız için teşekkür ederiz.