Name: Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Keşfedin yüksek içerikli enflamasyon tarama yöntemini Danio rerio larvaları kullanarak immün modülatör bileşikleri belirlemek için. Bu otomatik analiz immünoloji araştırmalarında yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; Biz mükemmel hayvancılık için Nadeshda Wolf, Nadine Eschen ve Susanne Delong teşekkür ederiz. CW Helmholtz programın bir doktora bursu ile desteklenmiştir<em&gt; BioInterfaces</em&gt; Uluslararası enstitü &#39;(BIFIGS). Daha fazla destek CG 7. Avrupa Topluluğu Çerçeve Programı (PIRG07-GA-2010-267552) içinde KIT-RISC hibe ile ve Marie Curie Uluslararası Yeniden Entegrasyon Grant tarafından sağlandı. Marie Curie İlk Eğitim Ağı (238.821) - AHS (Karaciğer ve Pankreas Geliştirme ve Hastalık Biyoloji) BOLD tarafından desteklenmiştir. UL Dopaminet FP7 (Yedinci Çerçeve Programı) (223.744) tarafından desteklenmiştir.</p&gt;

1. Hayvan Taşıma Çene tahlil kullanımı 3 dpf&#39;e larva homozigot çift transgenik cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 ve AB (yabani tip) balıklar arasında grup çiftleşmelerin doğan için. Doğal yumurtlama tarafından embriyosu toplamak ve 29 bunları yükseltmek ° Petri kaplarında E3 ortamda C (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4 ve mavi% 0.1 metilen, pH 7.0 ile dengelenmiş). Bu plaka başına 50-70 geçmeyen embriyo yoğunluğunu korumak için gereklidir. 2. Larva Sıralama Floresan muhabiri ifadesi, spontan inflamasyon ve uygun yaşa bağlı gelişim için bir floresan stereoskop altındaki tüm larva kontrol edin. 3. Eleme Orta Hazırlama (Daima taze hazırlamak) DMSO (1% final) ve MS222 (0.05 g / l) ile desteklenmiş metilen mavi olmadan E3 orta hazırlayın. 4. CuSO4Hazırlama (Daima taze hazırlamak) İlk CuSO 4 tarttın (M r = 159.6 g / mol) dH ve 20 mM stok solüsyon hazırlanır 2 O. E3/DMSO (% 1) / MS-222 120 uM CuSO 4 çalışma çözeltisi (20 mM stok çözeltisinden) hazırlayın. Işıktan CuSO 4 çözümü koruyun. 5.. 384-iyi Plaka Hazırlama (Greiner 384 Şey Mikroplaka) Bir ters pipetle her oyuğa E3/DMSO (% 1) / MS-222 ile 20 ul ön-ekleyin. Artan bir pipet ucu delik herhangi bir yaralama maruz kalmadan dikkatli embriyoların işlemek için gerekli olduğunu, bu delik 2 mm uç kesim tarafından yapılır. Her iyi (tedavi edilmemiş kontrol için 84 ul) orta ve 74 ul tek larva aktarın. Gerekirse, ayrıca içinde bir yanal konuma yönlendirmeye larvalar, esnek bir Eppendorf Microloader pipet ucu (; 5242 956,003 Eppendorf) kullanılarak. Bir robot sıvı ile bütün Aşağıdaki sıvı taşıma adımları gerçekleştirinlarvaların hepsi eşzamanlı tedavi sağlamak için iş istasyonu taşıma. 6. İlaç Tedavisi Aşağı pipetleme tarafından ilaç stok plaka bileşiklerin 5 kez karıştırın. Her bir kuyuya 7.5x ilaç stokunun plakası 16 ul ekleyin ve 5 kez karıştırın. Larva yaralanmasını önlemek ve 10 ul / s orta dağıtmak için kuyu içinde ucu konumunu ayarlayın. De içinde ilacın homojen dağılımını sağlamak için kuyu orta 4 kez karıştırın. 7. Kuluçka 29 1 saat için tarama plakası inkübe ° C ışıktan yanı CuSO 4 gibi bileşiklerin korumak için alüminyum folyo ile kaplı. 8. Kimyasal Yaralama Negatif kontrol, mix 4 kez hariç her kuyuya 120 mM CuSO 4 çalışma çözeltisi 10 ul ekleyin ve 29 1 saat boyunca tekrar inkübe ° C 9. Yıkama Bana 80 ul çıkarın ve alışverişi<html> her birinden fenoksimetilpenisilin de iki kez (20 ul adımlarla) bileşikleri kaldırmak ve CuSO ila 4 seviyesindedir. 10. Görüntü Alma 90 dakika sonra ilk bakır tedavisi: bir ters otomatik mikroskobu (Olympus tarama ^ R yani) görüntü alımı başlatabilirsiniz. Sağ ve sol posterior lateral hattı neuromasts görünür olması için ilk z seviyesini ayarlayın. Görüntü her yanı bir kez kanallar aydınlık saatte, 4 odak düzlemleri (50 mikron mesafe) Cy3 ve GFP 4x nesnel (NA = 0.13) kullanarak. Görüntü ve veri işleme ile ilgili ek bilgiler talep üzerine mevcuttur. 11. Görüntü İşleme 1. Sıralama Veri Ham görüntüleri bizim özel LabView yazılımı komut ile işlenir. Görüntü işleme hattında ilk operasyon kanalı, iyi ve zaman noktası bilgilerini tarafından mikroskop oluşturulan veri klasörü ham görüntülerin sıralama edilir. ove_step &quot;&gt; 2. Genişletilmiş odak Daha sonra yazılım kanalların her biri için 4 odak düzlemleri uzanan odak görüntüler oluşturur. 3. RGB-bindirme Son bir adım olarak 3 kanal arasından genişletilmiş odak görüntüleri son RGB-bindirme görüntüsüne yol için birleştirilir. 4. Otomatik algılama neuromast Bir örüntü tanıma aracı (LabView Rapid IA prototip aracı) RGB bindirme görüntüleri içinde neuromasts tanımlayan ve neuromasts etrafında bir ilgi ampirik olarak tanımlanan alanı oluşturur. 5.. Niceleme Yaralı neuromasts çevreyi ilgilendiren ampirik olarak tanımlanan alan içinde kırmızı floresan lökositlerin (kırmızı piksel olarak yansıyan) l eukocytes (Paol) tarafından ccupied p ercent bir rea o bir ilköğretim okuma sonuçlanan puanlanır. Ortalama 95,27 ±% 2.11 (FDA1) ve 95,12 ± AçıkKuyular (larva) ve% 1.56 (FDA2) doğru tespit edilmiş ve daha sonra daha fazla veri işleme tabi tutulmuştur. Ham veri çıkışı (her bir tespit için neuromast Paol) bir txt dosyası saklanır ve daha fazla ham verilerin işlenmesi MATLAB komut için veri girişi olarak hizmet vermektedir. 12. Veri İşleme 1. IMAPS Bir renk kodu ham veri çıkışı Paol grafiksel görselleştirme bireysel deneyler başarı değerlendirilmesi sözde inflamasyon haritaları (IMAPS) (Şekil 2) ile gerçekleştirilebilir. Parlak yeşil, yüksek bir başlangıç ​​inflamatuvar indeks yansıtır; siyah bir inflamasyon gösterir. Bu hızlı bakış sonra daha fazla veri analizleri dahil edilebilir başarısız deneyler, hızlı tespiti için izin verir. 2. Kontrollerin ortalama Her deneysel plaka yansıtan 320 bileşikler içerirtek bir veri sırasıyla, bileşik ve zaman noktası yanı sıra 32 pozitif ve negatif kontrollerin başına gelin. 32 kontrol çoğaltır ortalama ve standart sapması hesaplanır vardır. Kontroller için 2 standart sapma içinde, sadece veri noktaları dahildir. 3. Normalleştirme Normalizasyon tablo analiz yapılır. Negatif kontrol olmak DMSO ortalama değeri, 0 olarak ayarlanır ve bakır denetimi için en yüksek ortalama Paol pozitif ve negatif kontrol arasındaki maksimum fark 1 olarak ayarlanır, böylece 1 olarak ayarlanır. Her bir bileşiğin Paol doğrusal enterpolasyon veya deneysel plaka üzerinde ilgili denetimlere extrapolated. 4. Final okuma-out: İnflamatuar endeksi Yeterli tekrarlanan deneyler (yani 15) yapılmıştır sonra, tekrarında deneyler normalize ham veri okuma-out son bir sonuçlanan ortalaması alınır - inflamatuarindex. Bakır kontrol ilk inflamatuvar indeks zaman sıfır noktası için% 100 ile başlar ve görüntü alımı başlangıç ​​zamanı (90 dakika ilk bakır tedavi sonrası) ile doğrudan ilintilidir. 5.. Monoton üstel regresyon uydurma Zamanla iltihap çözünürlüğü dolayı biz kullanarak ilk iltihabı doğru monoton üstel doğrusal olmayan regresyon uydurma gerçekleştirmek <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> - Bir 0 t = 0 azından başlangıçtaki tepkisi için bir ölçüsü olan bir 1 saat boyunca büyüklükte eğimi ile ilgilidir. 6. 2-B özelliği alanı arsa (Şekil 4) Özelliği alanı oluşturmak için bir non-lineer regresyon uygulanır ve küme analizi, böylece farklı immün-modülatör kategoriler ilginç adaylar otomatik tanımlama (anti-inflammat sağlayan karakteristik bölgeye özelliği alanı bölerORY, anti-çözünürlük, pro-inflamatuar, pro-çözünürlük). Tüm bileşikler parametreler bir 0 ve bir 1 göre 2-D plot gösterilir. 13. Veri İşleme ve Depolama Bizim veri rutinleri adımları &#39;sonuçları yanı sıra kullanıcı 10 tarafından talep edilen detaylı bir görünüm işleme hızlı bir görüntünün genel ve veri sağlayarak, uyuşturucu ekranları görselleştirmek ve temsil etmek için web sayfası yaratmak taşıma. Diğer ilgili heterojen, biyolojik ve kimyasal veritabanlarına Yumuşak bağlantıları karşılaştırmalı ve roman çalışmaları 11 için değerli bir kaynak sağlamak için de entegre edilmiştir. Bu rutinleri tarafından, uygun veri standartları ve metainformation bu verilerin uzun süreli saklanması için ayarlanır. 14. Temsilcisi Sonuçlar Bir pilot ekran biz 640 oluşan bir kütüphane analiz FDA granül başlaması, ilerlemesi veya çözünürlüğü üzerindeki etkileri bilinen biyoaktif bileşikler onaylıocytic inflamatuvar yanıt. Biz farklı etki mekanizmaları göstergesi olabilir immun düzenleyici fenotipleri 4 tip sınıflandırılır gözlenen etkileri dayanarak: anti-inflamatuar (1), anti-çözünürlük (2), pro-inflamatuar (3) ve pro-çözünürlük (4) , olduğu bir tekdüze olmayan regresyon uydurma (e ao ​​+ Alx -) kaynaklanan parametreler bir 0 ve 1 ile ifade edilebilir başlangıç ​​enflamasyon doğru. Bir 1 eğrisinin eğimi karakterize ve böylece enflamasyon çözünürlüğü açıklar ise A 0 enflamatuvar yanıt büyüklüğünü temsil eder. 2-B özelliği alanı arsa (a 0 vs 1) tüm bileşikler gösteriliyor farklı immun düzenleyici kategorilerden vurdu adayları (Şekil 3) otomatik tanımlama sağlar. 640 bileşikler dışında 45% 50 veya daha az başlangıç ​​inflamatuvar indeks azaltarak önemli bir anti-inflamatuar etki yapmıştır. Thi içindekategorisindeki biz 6 bileşikler bizim yaklaşımın geçerliliğini doğrulayan non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID), farmakolojik sınıfına ait bulundu. Ancak, NSAİİ en güçlü anti-inflamatuar ilaçlar arasında değildir sırada yer aldı. Dışında NSAİİ ile biz örneğin Anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB), antibiyotik ve proton pompa inhibitörleri gibi birçok ek farmakolojik ilaç sınıfları bulundu. 7 bileşiklerin potansiyel yanlısı çözünürlük ilaçlar için ampirik olarak tanımlanan eşiği kriterlerini karşıladı. 18 ilaç, pozitif kontroller ile karşılaştırıldığında yaralandı neuromasts abartılı lökosit göçünün neden bir pro-inflamatuar etki yapmıştır. Sadece 2 bileşikleri inflamatuvar yanıt zamanında çözünürlük önledi. Pilot ekran Coul birçok hit adayların anti-enflamatuar etkisi (yukarıda belirtilen farmakolojik ilaç sınıfları örnek adayları)d sonraki ikincil Chin testler (veriler gösterilmemiştir) doza bağımlı bir şekilde teyit edilmesi. Birincil ekran olarak uygulanan 4 potansiyel yanlısı çözünürlüklü ilaçların yeniden test eylem belirtilen kipi teyit etmedi. İlaçların 2 daha yüksek konsantrasyonlar (20 uM) hafif bir anti-inflamatuar bir potansiyele sahip olduğunu. 20 uM - üçüncü bir ilacın 5 arasında değişen konsantrasyonlarda ilaç marjinal bir non-doza bağımlı bir anti-enflamatuar etkisi sergilemiştir. Dördüncü ilaç test edilen konsantrasyonlarda inflamatuvar yanıt üzerine etkisi yoktur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Şekil 1.. Chin testin Workflow. Bireysel bileşik transgenik cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larva (3 dpf) manuel 384-iyi microtiter plakalar dağıtılır. İlaçlar iyi bir Zephyr Kompakt Liquid Handling Workstation kullanarak her aynı anda eklenir. Tahlil plakaların 29 daha sonra 1 saat boyunca inkübe edilirler ° C. CuSO 4 ile muamele </sub&gt; 1 - h yaralanması verir ve akut bir enflamatuvar yanıt başlatır çözeltisi (10 uM son konsantrasyon). Son olarak, bakır çözümleri ve uyuşturucu yıkanır ve otomatik görüntü alma (ilk bakır tedaviden sonra 90 dakika) başlatılır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Şekil 2. . Kanalları sırasıyla Cy3 (solda) ve GFP (sağda), 50 mikron mesafelerde - Genel ham görüntülerin resmi rakam 4 odak düzlemleri (3 Z = 0) ham görüntüleri gösterir. Oklar (Z = 1,2) neuromasts etrafında kümelenmiş lökosit örnek neuromasts, ok uçları (Z = 1,2) noktasına işaret etmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Şekil 3. İnflamasyon Haritalar (IMAPS) bireysel denemelerin başarısı bir renk kodu inflamatuvar yanıt (ham veri) yansıtan IMAPS biçimde tespit edilebilir. Parlak yeşil, yüksek bir başlangıç ​​enflasyon yansıtır<html> mmatory yanıt; siyah bir inflamasyon gösterir timepoint 0 (solda) ve zaman noktası 5 (sağ) IMAPS açıkça bir deney daha fazla veri işleme dahil edilmelidir olmadığını göstermektedir.. DMSO kontrolü kuyular (satır 1 ve 12), koyu yeşil veya siyah görünür, oysa Bakır kontrolleri (satır 13 ve 24), yeşil tonlarda değişen gösterilmez. Zaman noktası 5 anda, inflamasyon hemen şimdi yeşil veya siyah koyu tonlarda gösterildiği, bakır kontrolleri giderildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Şekil 4. FDA 320 bileşiklerin 2-D özelliği, uzay komplo kütüphane ve kendi kontrolleri onayladı. Tüm bileşik kuyular doğrusal olmayan bir ortaya çıkan parametreleri 0 ve 1, dayalı bir 2-D özelliği, uzay komplo görüntülenebilir regresyon uydurma (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; ilk inflamasyon doğru / Denklem 1 &quot;&gt;). Bu özellik alanı arsa ilaçların göstergesi olabilir aşağıdaki 4 immün-modülatör kategorilerden birine ait ilginç adayların otomatik tanımlama sağlar eylem &#39;modu:. anti-inflamatuar (1), anti-çözünürlük (2), pro-inflamatuar (3) ve pro-çözünürlük (4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakamı görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+advance%3A+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li>
<li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li>
<li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42(2007).</li>
<li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo%3A+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li>
<li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151(2010).</li>
<li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li>
<li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciencenet%27+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li>
<li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvester%27%3A+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<p class="jove_content"&gt; Burada bir bütün hayvan bağlamda immün-modülatör bileşiklerin tanımlanması sağlayan tam otomatik yüksek verimli tarama strateji sunmak. Akut inflamatuvar yanıt Böylece izin izleme<em&gt; In vivo</em&gt; Ve gerçek zamanlı olarak.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz yaraları lökosit istihdamı konusunda ilaç etkileri tamamen işlevsel bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi bağlamında göreli kolaylıkla okudu olabilir, çünkü ilaç keşfi veya ilaç repurposing çabaları için değerli bir model organizma olarak zebrabalıkları uygulamak için bir protokol sağlar. Bizim yaklaşım benzersiz bir avantaj kimyasal yaralama ve böylece yüksek verimlilik formatında otomasyon ve tarama izin, manuel larva manipülasyon eskimiş işler olmasıdır.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ayrıca, olumsuz veya toksik ilaç etkilerinin yanı sıra güçlü off-hedef etkilerini kolayca kurulum önerilen ile değerlendirilebilir. FDA onaylı kütüphane Ancak verilen tarama konsantrasyonlarda herhangi bir toksik bileşikler içermiyordu. Bununla birlikte, test kütüphanesi aynı farmakolojik madde sınıfı mevcut üyeleri arasında mevcut veri kümesi (örneğin immun düzenleyici fenotip, ilaç konsantrasyonu) karşılaştırmak için belirgin toksik bileşikler için öneriyoruz. Ihtiyaç olması aksi takdirde gelecek vaat eden bir immun düzenleyici fenotipi gencin bir madde ailesi, toksik üyeleri, düşük konsantrasyonlarda yeniden test edilebilir.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Biz onların uyguladığı immün-düzenleyici etkisine göre otomatik olarak kategorize ilaçların olasılığını göstermiştir. , Anti-inflamatuar bileşiklerin kategoriye ait olan ilaçların bağımsız deneyin, doza bağımlı bir şekilde etkileri uygulamakla bileşiklerin çoğu geçerliliği olabilir. Potansiyel yanlısı çözünürlük ilaçlar olarak saptadığı dört bileşikler şimdiye kadar gibi teyit edilemedi. Yalnızca çözünürlüğü etkilemeden hiçbir ilaç ana kadar literatürde tarif edilmiştir yana Aynı zamanda, bu özel bağışıklık modülatör kategorisi tarif etmek zor olduğunu gösterir. Bununla birlikte, 4 yeniden test ilaçların 3 molar yüksek konsantrasyonlarda anti-inflamatuar bir eğilimi göstermiştir. Ampirik olarak tanımlanan eşik kriterleri optimize yanlış pozitiflerin sayısını azaltmak için yardımcı olmalıdır.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ayrıca, sunulan teknik lökosit göç davranışlarını etkileyen genlerdeki mutasyonların belirlenmesi için kullanılmak üzere imkanı sunuyor<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Sonuç, önerilen yöntem kolaylaştırmak ve ilaç toleransı, toksisite, dozaj yanı sıra potansiyel off-hedef etkileri hakkında hazır bilgi ile potansiyel yeni lider yapılar verimli çabaları repurposing ilaç keşfi veya ilaç hızlandırabilir. Bu nedenle, ilaç geliştirme erken aşamalarında basit, maliyet ve zaman tasarrufu sağlayan bir strateji olarak hizmet vermektedir.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Bakır (II) sülfat susuz </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA onaylı ilaç kütüphanesi </td><td> Enzo Yaşam Bilimleri </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 kuyucuk plakası olmayan bağlama, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> siyah </td></tr><tr><td> Olympus tarama ^ R </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Kompakt Liquid Handling İstasyonu </td><td> Kaliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

kolaylaştırılması İlaç keşfi: zebra balığı an otomatik yüksek içeriği enflamasyon assay

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvaları, küçük boyutu ve işleme ve gözlem göreceli olarak kolay ve aynı zamanda, bir verildiğinde sadece bileşiklerin banyo su ilave edilebilir ve kolaylıkla emilir olması nedeniyle küçük molekül ekranlarını 1,2 tüm hayvanlar için özellikle uygundurlar &lt;% 1 DMSO çözüm. Zebra balığı larva ve lökositlerin floresan proteinleri transgenik hatlarının durumu optik netlik nedeniyle, zebrabalıkları in vivo akut inflamatuvar yanıt izleme benzersiz bir avantaj sunuyoruz. Sonuç olarak, yüksek verimlilik ile immün-modülatör bileşiklerin tanımlanması amaçlayan yüksek içeriği küçük molekül ekranlar için zebrabalıkları kullanan, inflamasyon indüksiyon senaryoları fin dokusunda lokalize nickler örneğin bir sarısı yüzeyine yönlendirilmiş lazer hasarı düşündüren, 3-6 öne sürülmüştür embriyoların 7 veya tailfin amputasyon 3,5,6. Bu yöntemlerin ana dezavantajı, ancak idimanuel larva manipülasyon gereksinimi dolayısıyla yüksek verimli tarama önlenmesi, yaralama ikna etmek. Kimyasal yolla oluşan inflamasyon (Chin) testi 8 tanıtılması bu engelleri ortadan kaldırdı. Yaralama verdirdiler olduğundan kimyasal aynı anda tedavi edilebilir embriyo sayısı neredeyse sınırsızdır. Bakır sülfat ile zebrabalıkları larva Geçici tedavi seçici yanal çizgi sistemi ve yaralı neuromasts hızlı granülosit işe sonuçları saç hücrelerinde hücre ölümüne neden olur. Inflamatuvar yanıt bileşik transgenik cldnB :: GFP / lysC :: neuromast hücrelerin yanı sıra kırmızı floresan proteini etiketleme granülositler bir yeşil floresan proteinini ifade DsRED2 6,9 zebrabalıkları larvaları kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Hem yüksek-içeriği ve yüksek verimlilik analizleri izin verecek bir tarama stratejisi hazırlamak için biz robot sıvı taşıma ve kombine otomatik MICR tanıttıözel geliştirilen yazılım komut ile oscopy. Bu script yaralı yeşil floresan neuromasts çevreleyen ampirik tanımlanan alan içinde kırmızı floresan lökositler tarafından işgal yüzde alanı puanlama inflamatuvar yanıtın otomatik ölçümü sağlar. Ayrıca, otomatik veri işleme, taşıma, görselleştirme ve depolama tüm MATLAB ve Python geliştirilen özel dayanmaktadır. Kısaca, bir granülositik inflamatuvar yanıt başlaması, ilerlemesi veya çözünürlüğü üzerindeki etkisi için kimyasal bileşiklerin test sağlayan otomatik bir HC / HT ekranı tanıtmak. Bu protokol, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının orkestrasyon yer uyuşturucu mekanizmaları ve yolların daha derinlemesine analizler için iyi bir başlangıç ​​noktası sunmaktadır. Gelecekte, ilaç keşfi önceki aşamalarında dayanılmaz toksik ya da off-hedef etkilerin belirlenmesi yardım ve böylece ilaç gelişimi için prosedürel riskleri ve maliyetleri azaltabilir.

Burada immün-modülatör biyoaktif bileflikler tanımlanmasını amaçlayan bir roman yüksek içeriği kimyasal yolla oluşan inflamasyon testi açıklar. Biz başarıyla inflamatuvar yanıt olarak daha fazla veri işleme, analiz, madencilik ve depolama otomatik ölçümü sağlayan özel geliştirilmiş yazılım komut ile otomatik mikroskopi birleştirdik.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Zebrafish larvaları, küçük boyutları ve manipülasyon kolaylıkları nedeniyle, tüm hayvan küçük molekül taramaları için özellikle uygundur1,2 ve ...

Bu prosedürün genel amacı, in vivo zebra balığı inflamasyon testi kullanarak bileşiklerin immün modülatör aktivitesini belirlemek için fenotipik bir tarama gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle zebra balığı larvalarının 384 kuyucuklu bir plakaya dağıtılmasıyla ve ardından doku penetrasyonuna izin vermek için taranacak bileşiklerin larvalara eklenmesiyle gerçekleştirilir.Ardından, dokuya özgü hasar oluşturmak için bakır sülfat çözeltisi eklenir. Son olarak, bileşikler ve bakır sülfat taze besiyeri ile değiştirilir. Nihayetinde, gerçek zamanlı in vivo mikroskopi verilerinin analizi yoluyla, dokuya özgü lökosit göçünün zaman içindeki boyutunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin temel avantajı, yüzlerce bireyde aynı anda inflamasyon indüklenmesine izin vermesi ve böylece deneysel ve analitik otomasyonu mümkün kılmasıdır. Prosedürü, laboratuvarımdan doktora öğrencisi Christina Whitmanle göstereceğiz. Çene testi için, homozigot çift transjenik ve yabani tip AB balıkları arasında grup çiftleşmeleri ayarlayın, embriyoları doğal yumurtlama yoluyla toplayın ve her plaka başına 50 ila 70 adet embriyoyu E3 ortamında 29 °C'de döllenmeden sonraki üçüncü güne kadar büyütün.Tüm larvaları floresan raporer ekspresyonu, spontan inflamasyon ve yaşa bağlı uygun gelişim açısından floresan stereoskop altında kontrol edin. Tarama besiyeri hazırlandıktan ve 384 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara 20 µL eklendikten sonra, 74 µL besiyeri içindeki tek bir anestezi uygulanmış larvayı her bir kuyucuğa aktarın. Bu işlem için ucu iki mm açıklıkta kesilmiş esnek bir mikro pipet ucu kullanın.Larvayı kuyucuk içerisinde yan pozisyona getirin. İlaç uygulaması sırasında tüm larvaların eş zamanlı olarak işleme tabi tutulmasını sağlamak için sonraki tüm sıvı aktarım adımlarını robotik bir sıvı aktarım istasyonu ile gerçekleştirin. Bileşikleri karıştırmak için ilaç stok plağında beş kez yukarı-aşağı pipetleme yapın. Tarama plağına 7,5 x ilaç stok plağından 16 µL ekleyin ve saniyede 10 µL hızında beş kez karıştırın.Tarama plakasını alüminyum folyo ile kapatın ve 29 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Kimyasal yaralama başlatmak için, her birine 10 µL 120 µM bakır sülfat çalışma çözeltisi ekleyin.Negatif kontrol karışımını kuyucuklara dört kez ekleyin ve 29 °C'de bir saat daha inkübe edin. 90. dakikadan itibaren, her kuyucuktaki 80 µL besiyerini iki kez boşaltıp yenileyerek embriyoları yıkayın. İlk bakır uygulamasının ardından, bir Forex objektif kullanarak ters otomatik mikroskopta görüntüler edinin.Sağ ve sol posterior lateral hattan gelen nöromas görünür olacak şekilde başlangıç Z seviyesini ayarlayın ve her bir kuyuyu saatte bir kez görüntüleyin. Brightfield yan üçlü ve GFP kanallarını dört odak düzleminde kullanın. Özel lab view yazılımı, her bir kanal için dört odak düzleminden genişletilmiş odaklı görüntüler oluşturur.Görüntüler daha sonra birleştirilerek nihai bir RGB bindirme görüntüsü oluşturulur. Bir örüntü tanıma aracı, RGB bindirme görüntülerindeki nöromaları tanımlar ve nöromaların etrafında ampirik olarak tanımlanmış bir ilgi alanı oluşturur; yaralı nöromaları çevreleyen kırmızı floresan lökositler skorlanır ve bunun sonucunda lökositlerin veya solgunluğun kapladığı alan yüzdesi şeklinde bir birincil okuma elde edilir. Ortalama olarak, larvaların %95'i düzgün şekilde tespit edilir ve ardından daha fazla veri işlemeye tabi tutulabilir.Bireysel deneylerin başarısı, inflamasyon haritaları veya göz haritaları kullanılarak değerlendirilir. Soluk veriler, yüksek başlangıç inflamasyon indeksini temsil eden parlak yeşil ile renk kodlanmışken, siyah renk inflamasyon olmadığını belirtir. Bu hızlı genel bakış, başarısız olan deneylerin hızlıca tespit edilmesine ve böylece bu deneylerin sonraki veri analizelerinden hariç tutulmasına olanak tanır.0,0 ve 0,5 zaman noktalarındaki iMap'ler, bir deneyin daha ileri veri işlemeye dahil edilip edilmemesi gerektiğini açıkça göstermektedir. Bakır kontrolleri yeşilin farklı tonlarında görünürken, DMSO kontrol kuyucukları 0,5 zaman noktasında koyu yeşil veya siyah görünür. Kontrolleri işlemek için, bakır kontrollerinde inflamasyon artık koyu yeşil tonlarında veya siyah görünerek neredeyse çözülmüştür.32 kontrol tekrarının ortalaması alınır ve standart sapma hesaplanır. Yalnızca iki standart sapma dahilindeki veri noktaları işleme alınır. Negatif kontrol olan DMSO'nun ortalama değeri sıfır olarak belirlenir ve bakır kontrolü için en yüksek ortalama PAOL değeri bir olarak belirlenir; her bileşiğin PAOL değeri, deney plağındaki ilgili kontrollere göre lineer olarak interpola edilir veya ekstrapole edilir.Tekrarlı deneylerden elde edilen normalize edilmiş ham verilerin ortalaması alınarak, inflamasyon çözünmesine bağlı inflamatuar indeks şeklinde nihai bir okuma üretilir. Zamanla, başlangıç inflamasyonuna yönelik monotonik eksponansiyel doğrusal olmayan bir regresyon uydurması gerçekleştirilir. Sıfırın, zaman eşittir sıfır anındaki başlangıç yanıtının ölçüsü olduğu ve birin, özellik uzayını oluşturmak için büyüklüğün zamanla olan eğimiyle ilişkili olduğu bu formül kullanılarak, doğrusal olmayan bir regresyon uygulanır ve bir kümeleme analizi, özellik uzayını karakteristik bölgelere ayırarak farklı immün modülatör kategorilerinden ilgi çekici adayların otomatik olarak tanımlanmasını sağlar.Tüm parametreler, sıfır ACE ve bir ace parametrelerine dayalı olarak 2D grafikte görüntülenir. Veri işleme rutinleri, sonuçların hızlı bir genel bakışının yanı sıra kullanıcının talep ettiği ayrıntılı bir görünümü sunan web sayfaları oluşturur. Bu rutinler tarafından karşılaştırmalı ve özgün çalışmalar için değerli bir kaynak sağlamak amacıyla diğer ilgili heterojen, biyolojik ve kimyasal veri tabanlarına yönlendiren yumuşak bağlantılar da entegre edilmiştir.Bu verilerin bir pilot taramada uzun süreli depolanması için uygun veri standartları ve meta bilgileri belirlenmiş; 640 FDA onaylı bilinen biyoaktif bileşikten oluşan bir kütüphanede, granülositik inflamatuar yanıtın başlatılması, ilerlemesi veya çözünmesi üzerindeki etkileri analiz edilmiştir. Gözlemlenen etkilere dayanarak; anti-inflamatuar, anti-rezolüsyon, pro-inflamatuar ve pro-rezolüsyon olmak üzere, farklı etki mekanizmalarına işaret edebilecek dört tip immun modülatör fenotip sınıflandırılmıştır. 640 bileşiğin 45'i, başlangıç inflamatuar indeksini %50 veya daha altına düşürerek anlamlı anti-inflamatuar etkiler göstermiştir.Bu kategori içerisinde, gerçek anti-inflamatuar ilaçların farmakolojik sınıfına ait altı bileşik bulunmuştur. Bu yaklaşımın geçerliliğini doğrulayan bu videoyu izledikten sonra, immün modülatör bileşik aktivitesi için yürütülen fenotipik in vivo taramanın, tüm hayvan bağlamında hem tutarlı veri edinimi hem de analizine olanak tanıyacak şekilde nasıl büyük oranda otomatikleştirilebileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz zebrafish transgenik embriyolar multiwell plakaları otomatik olarak görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirme raporu. Fibroblast Büyüme Faktörü muhabiri gen ekspresyonu üzerine küçük bir molekül, BCI, doza bağımlı etkileri ölçmek ve yüksek verimli zebrafish kimyasal ekranlar kurulması için teknoloji yeteneğini göstermektedir.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Laboratuvarımız 7 günlük eski Zebra balığı larvaları birkaç farklı davranışların tespiti için yararlı bir yeni yüksek verimli otomatik görüntüleme sistemi geliştirdi. Sistem, larva çevresel toksik ya da eczacılık maruz kalmış sonra davranış ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Protokol entübasyonda yetişkin zebra balığı ile bir biyolojik açıklar; daha sonra Diseksiyon ve bağırsak sitometresi, confocal mikroskobu ve qPCR için hazırlanıyor. Bu yöntem yönetime biyoaktif bileşiklerin bağırsak alımı ve uyarılmış yerel bağışıklık uyarıcı izlemek için izin verir. Sözlü prezervatiflerinin bağırsak dinamiklerini test etmek için uygundur.

Yetişkin zebra balığı sözlü entübasyon: bağırsak alımını biyoaktif bileşiklerin değerlendirmek için bir Model

Bu iletişim kuralı fluorescently etiketli gıda yüksek üretilen iş moda larva zebra balığı bağırsak yoluyla transit süresini ölçmek için hedeftir.

Yüksek işlem hacmi ölçüm larva zebra balığı kullanarak Gut Transit süre

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Burada, son teknoloji ürünü bir robotik enjeksiyon sistemi kullanılarak zebra balığı larvalarına otomatik tümör ksenogreft implantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, sistemin başarılı performansını gösteren enjeksiyon videoları ve doğrulama verileri sunuyoruz.

Kanser Araştırmaları ve Tıbbı için Zebra Balığı Larvalarında Tümör İmplantasyonunun Otomatikleştirilmesi

Visual analitik (VA), etkileşimli veri analiz yeni bir yaklaşım. Bu video, yüksek verimli biyolojik deneyler tarafından getirilen veri aşırı sorunu tartışmak ve bu soruna bir çözüm olarak VA teklif. Içinde ve immünolojik veri setleri arasındaki Tableau denilen bir VA aracını kullanarak video analizi göstermektedir.

Visual Analitik Teknikleri ile İmmünolojik Veri Analizi kolaylaştırılması

Keşfedin yüksek içerikli enflamasyon tarama yöntemini Danio rerio larvaları kullanarak immün modülatör bileşikleri belirlemek için. Bu otomatik analiz immünoloji araştırmalarında yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Daha fazla video keşfet