Amiloid prekürsör protein intrasellüler Domain saflaştırılması ve toplama

Bu prosedürün amacı, A ICD olarak da bilinen amiloid öncü protein hücre içi alanını saflaştırmak ve A ICD'nin atomik kuvvet mikroskobu ile termal agregasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol sunmaktır. Bu, ilk olarak bakterilerde A ICD'nin A GST füzyonunun eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, G-S-T-A-I-C-D proteini, GST'yi A ICD'den ayırmak için trombin ile saflaştırılır ve GST çıkarılır.

Daha sonra A ICD'nin termal agregasyonu indüklenir. Son olarak, A ICD agregaları atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak görüntülenir. Sonuç olarak, A ICD'nin biyokimyasal ve biyofiziksel analiz için yeterli miktarda homojenliğe kadar saflaştırılabileceğini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, karmaşık kromatografi adımları gerektiren mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, oldukça saf ve çözünür olmasıdır. Bir ICD, standart reaktifler ve ekipman kullanılarak tezgah üzerinde izole edilebilir. Bu protokol tarafından üretilen bir ICD, daha fazla biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyon için uygundur.

Prosedürü gösteren Amina ti olacaktır. Laboratuvarım için eski bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Andres Oberer, rekombinant A PP hücre içi alanını veya A ICD'yi ifade etmek için A ICD'nin atomik kuvvet mikroskobu görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini gösterecek. Tek bir koloni ile GST'nin C terminaline kaynaşmış insan A ICD'sini barındıran, pgx 41 vektörü ile dönüştürülen BL 21 hücreleri ile başlayın, 10 mililitre LB suyunu ampisilin ile aşılayın ve ertesi sabah kuvvetli çalkalama ile gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

400 mililitre LB ampisilin'i bir litrelik bir şişede beş mililitre gece boyunca kültür ile inkübe edin. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0,4 ila 0,6'ya ulaşana kadar kuvvetli çalkalama ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu normalde iki ila 2.5 saat sürer ve G-S-T-A-I-C-D ekspresyonunu indükler.

0.4 milimolar IPTG ekliyoruz ve 37 santigrat derecede inkübe ediyoruz ve beş saat boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalıyoruz. Hücreleri 15 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 6.000 kez G'de santrifüjleyin ve peleti eksi 80 santigrat derecede saklayın. Lizis hazırladıktan, tamponladıktan ve bakterileri buz üzerine attıktan sonra, pelete 20 mililitre tampon ekleyin ve bir pipet ile buz üzerinde vorteksleme ve tasyon kombinasyonunu iyice kullanın.

Reese, bakteri peletini askıya alır, Reese askıya alınmış bakteri lizatını önceden soğutulmuş bir emülgatör veya French press ile geçirir. 30.000 PSI'de lizatı ikinci kez emülgatörden geçirin ve lizatı önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. 15.000 kez G ve dört santigrat derece lizatı 30 dakika boyunca santrifüjleyin.

Supinatı ayırın ve önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. % 50'lik bir glutatyon bulamacından 500 mikrolitre ekleyin. Numune dönerken dört santigrat derecede 30 dakika döndürün.

İnkübasyondan sonra taze elüsyon tamponu yapın. Lizat ve bulamacı, kurs filtreli tek kullanımlık beş inçlik bir polistiren kromatografi kolonuna dökün. Kolonu üç mililitre PBS ile beş kez yıkayın.

Sütunun altını kapatın ve 500 mikrolitre oda sıcaklığı, elüsyon tamponu ekleyin. Sütunun üst kısmını kapatın ve beş dakika oda sıcaklığında döndürün. Erken ağırlığı soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir mikro çöp tüpüne toplayın.

Elüsyonu iki kez daha tekrarlayın. Elüatı, ertesi gün dört santigrat derece boyunca dört litre PBS'de 10.000 moleküler ağırlıklı bir kesme diyaliz membranında diyaliz edin. Bir saat boyunca dört santigrat derecede dört litre PBS'ye karşı diyalize girin.

Proteini diyaliz kasetinden çıkarın ve G-S-T-A-I-C-D verimini belirlemek için bir protein miktar tayini testi yapın. 400 mililitre kültürden tipik bir saflaştırma, 20 miligramdan daha fazla saflaştırılmış protein verimi ile sonuçlanacaktır, bu da mililitre başına 10 ila 20 miligram konsantrasyonlardır. Proteini 200 mikrolitreye ayırın, alikotlar ve eksi 80 santigrat derece dondurun.

A ICD'yi GST çözülmesinden kurtarmak için, 200 mikrolitre saflaştırılmış G-S-T-A-I-C-D ve ertesi gün 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edilen mikrolitre trombin başına bir birimden 20 mikro salım ekleyin, herhangi bir agrega materyalini 30 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleme ile temizleyin. GST ve trombini çıkarmak için SUPINATE'i önceden soğutulmuş bir mikro tüpe aktarın. Sırasıyla 50 mikrolitre% 50 glutatyon aro bulamacı ve 50 mikrolitre,% 50 p ve wino zaine aro bulamacı ekleyin.

Beş dakikalık oda sıcaklığında rotasyonla inkübe edin. Agro boncukları çökeltmek için kısa bir süre santrifüjleyin ve supinatı yeni bir tüpe çıkarın. GST'yi glutatyon ile dört kez daha çıkarın.

Aros, saflaştırılmış A ICD'nin beş mikrolitresi üzerinde bir protein kantitasyon testi gerçekleştirir. 400 mililitrelik bir kültürden elde edilen tipik verimler, mililitre başına 0.2 ila 0.5 miligram konsantrasyonda 50 ila 100 mikrogramdır. Taze hazırlanmış A ICD'nin PBS'de mililitre başına 0.1 miligram konsantrasyona seyreltilmesinden sonra, numuneler 48 saat boyunca ısıtılmış bir çalkalayıcıda 800 RPM'de 43 santigrat derecede inkübe edilerek termal agregasyona neden olunur.

Numuneyi 20 kat deiyonize su ile seyreltin ve iki mikrolitreyi taze doğranmış üzerine yerleştirin. Mika, toplanmış A ICD'yi görselleştirmek için numuneyi gece boyunca bir kuruda kurutun, altın keçili olarak dokunma modunda atomik kuvvet mikroskobu kullanın. Nominal uç yarıçapı iki nanometre olan mikro keskin nitrür konsollar.

Görüntüleme sırasında tipik dokunma genlikleri, konsolların rezonans frekansında 10 ila 20 nanometre. G-S-T-A-I-C-D'nin ifadesi ve göreli zenginleşmesi burada gösterilmiştir. Lizizden sonra, füzyon proteininin çoğunluğu çözünür fraksiyonda bulunur ve bu nedenle inklüzyon cisimciklerinden ekstraksiyon gerekli değildir.

Glutatyon arose kolonundan ima edilen malzeme %95'ten fazla saftır. Burada gösterilen preparatta, kolondan ima edilen protein konsantrasyonu mililitre başına 14.5 miligram ve verim 22 miligram idi. Bu preparatın 200 mikrolitresinin gece boyunca 20 ünite trombin ile bölünmesi, füzyon proteininin neredeyse% 100 bölünmesine neden oldu.

Kullanılan trombin miktarı kumasi tarafından tespit edilemeyecek kadar düşüktür. Mavi lekelenme, trombin ve GST'nin çıkarılması bir miktar malzeme kaybına neden oldu. Bununla birlikte, mililitre başına 0.35 miligram konsantrasyonda 70 mikrogram A ICD'nin bu hazırlığında bir verim ile% 90'dan fazla saftı.

Bir FM tarafından görüntülenen bir ICD agregaları tipik olarak steroid amorftur ve boyutları 50 ila 100 nanometre arasında değişir. Agregasyon reaksiyonuna şaperon UBI Quillin one'ın eşmolar bir miktarı eklendiğinde agrega materyali tespit edilemez. Bu videoyu izledikten sonra, EICD'nin nasıl saflaştırılacağı, toplanmasını nasıl indükleyeceğinizi ve a-f-m-e-i-c-d görüntü toplama bölmesini nasıl indükleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknikle saflaştırılmış, moleküler şaperonların EACD agregasyonu üzerindeki etkisine ilişkin soruları yanıtlamak için ışık saçılımı ve filtre tuzağı tahlilleri gibi diğer yöntemlere uygulanabilir.