Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, postmortem dokulardan kardiyomiyosit çekirdeklerini izole etmektir. Bu işlem, önce dokunun bir prob homojenizatör ve cam ezici ile homojenize edilmesi ve ardından birkaç filtrasyon adımının uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, yoğunluk sedimentasyon santrifüjasyonu ile nükleer fraksiyonun diğer hücresel fraksiyonlardan izole edilmesidir.

Ardından, kardiyomiyosit çekirdekleri PCM1'e karşı üretilmiş bir antikor ile immün olarak etiketlenir. Son adım, etiketlenmiş kardiyomiyosit çekirdeklerinin floresan aktivasyonlu hücre ayıklama yöntemiyle izole edilmesidir. Nihayetinde, daha ileri işlemlere geçmeden hemen önce, ayıklanan nükleer fraksiyonların yeniden analizi ile kardiyomiyosit çekirdeklerinin saflığı doğrulanır.

Bu tekniğin temel avantajı, kardiyomiyosit çekirdeklerinin hem taze hem de dondurulmuş arşiv dokularından yüksek kapasiteli bir şekilde eşit derecede iyi analiz edilebilmesidir. Kardiyomiyositlerdeki DNA tabanlı çalışmalarle birkaç nedenden dolayı özellikle zordur. İlk olarak, kardiyomiyositler kalpteki hücrelerin yalnızca yaklaşık %20-30'unu oluşturur.

Ayrıca, bunlar önemli derecede çekirdeklidir. Dahası, kardiyomiyositler önemli derecede poliploiddir. Burada açıklanan bu yöntem, tüm bu engelleri aşmaktadır.

Prosedüre başlamadan önce, ultrasantrifüj tüplerini 10 mililitre %1 BSA artı PBS kaplama çözeltisi ile kaplayın. Tüpleri 30 dakika boyunca döndürdükten sonra, kaplama çözeltisini uzaklaştırın ve tüplerin havada kurumasını bekleyin.

Şok dondurulmuş bir fare kalbinden sol ventrikülü bir bistüri yardımıyla ayırarak kardiyak çekirdek izolasyon prosedürüne başlayın. Ayrıştırılan örneği küçük segmentler halinde kesin ve ardından doku parçalarını 15 mL liziz tamponu ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Ardından, kalp dokusunu bir prob homojenizatör ile 24.000 RPM'de 10 saniye boyunca homojenize edin ve ardından homojenatı eşit hacimde liziz tamponu ile 30 mL'ye tamamlayarak seyrelitin. Çekirdekleri serbest bırakmak için homojenatı, geniş açıklıklı bir havanla sekiz darbe uygulayarak cam bir homojenizatöre aktarın.

Ardından ham çekirdekleri geçirin. Önce 100 mikronluk bir hücre süzgecinden, sonra 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe izole edin. Şimdi ham çekirdek izolatını 700 ×g'de ve dört °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırmak için tüpü ters çevirin ve ardından tüpün içini bir kağıt havluyla silin. Çekirdek peletini bozmamaya dikkat edin. Ham çekirdekleri yeniden süspande etmek için çözeltiyi birkaç kez pipetle çekip boşaltın.

Beş mililitre sükroz tamponunda izole edin ve ardından çekirdek süspansiyonuna 25 mililitre daha sükroz tamponu ekleyin. Sonrasında, önceden hazırlanmış kaplamalı ultrasantrifüj tüplerinden birine 10 mililitre taze hazırlanmış sükroz tamponu ekleyin. Ardından, yeniden süspanse edilen çekirdek peleti çözeltisini tamponun üzerine dikkatlice ekleyin.

Tüpü serbest salınımlı bir rotorda dengeledikten sonra, rotoru yüksek hızlı bir santrifüje yerleştirin ve çekirdek örneğini 60 dakika boyunca 13,000 ×g'de ve dört °C'de santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, tüpleri rotordan dikkatlice çıkarın ve tekrar ters çevirin. Süpernatantı atmak için, daha önce yaptığınız gibi tüpün içindeki kalan kalıntıları bir kağıt havluyla silin ve ardından çekirdek peletini bir mililitre çekirdek saklama tamponu içinde yeniden süspande edin.

İmmün boyama prosedürüne başlamadan önce, çekirdek örneğinden 20 µL'lik bir alikotu bir faks tüpüne aktarın. Alikota 980 µL çekirdek saklama tamponu ekleyin ve tüpü negatif kontrol olarak etiketleyin. Şimdi, çekirdek örneği ve negatif kontrol tüplerine 1:500 dilüsyonunda anti-PCM1 antikoru ekleyin.

Ardından her iki tüpü dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri çekirdek saklama tamponu ile yıkayıp süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, çekirdek peletlerini bir mililitre daha çekirdek saklama tamponu içinde yeniden süspande edin.

Ardından, hücre örneklerine 1/100 dilüsyonunda anti-tavşan floresan ikincil antikor ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat inkübe edin. Tüpleri çekirdek saklama tamponu ile yıkadıktan sonra, pelletleri akış sitometrik ayırma ve analiz için bir mililitre çekirdek saklama tamponu içinde yeniden süspanse edin. Videonun başlangıcında olduğu gibi çekirdek toplama tüplerini BSA ve PBS ile kapladıktan sonra, numuneyi ve negatif kontrolü ayrı ayrı 30 mikronluk hücre süzgeçlerinden geçirerek işleme başlayın. Yüklemeden hemen önce bir DNA boyası ekleyin.

Çekirdek popülasyonlarının tanımlanması için 1/500'lük bir dilüsyon ekleyin. Negatif kontrolü akış sitometresine yükleyin. Burada gösterilen DOT grafiğine benzer şekilde, kardiyak çekirdekleri tanımlamak için ilk kapılamayı (gate) yerleştirmek amacıyla ileri ve yan saçılma parametrelerini kullanın.

Ardından, burada gösterilen DOT grafiğine benzer şekilde, çekirdek singletleri etrafında ikinci bir kapı oluşturmak için ileri saçılma (forward scatter) ve ileri saçılma darbe genişliği (forward scatter pulse width) parametrelerini kullanın. Şimdi immün işaretli örneği yükleyin ve PCM-1 pozitif kardiyomiyosit çekirdeklerini PCM-1 negatif kardiyomiyosit dışı çekirdeklerden ayırt etmek için üçüncü kapıyı yerleştirin. DNA içeriğini analiz etmek ve bu histogramla örneklendirilen analize benzer bir hücre döngüsü analizi gerçekleştirmek için nükleer DNA boyasını kullanın.

Çekirdekler PCM1 pozitifliğine göre ayrıştırıldıktan sonra, ayrıştırılan çekirdekleri buza yerleştirin ve her bir ayrıştırılmış örnekten bir alikotu, ayrıştırma saflığını belirlemek için yeniden analiz edin. Son olarak, ayrıştırılan çekirdekleri toplama tüplerinde 15 dakika boyunca 1500 ×g ve 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatantları attıktan sonra, çekirdek peletlerini istenen sonraki uygulama ile uyumlu bir tampon çözelti içinde yeniden süspande edin.

Bu ilk şekilde, yetişkin bir fare kalbi nükleer bir boya ile PCM1'e, fare kalp transkripsiyon faktörü NKX2.5'e ve miyozin ağır zincirine veya MHC'ye karşı antikorlarla boyanmıştır. Burada, önceki şekildeki üst üste bindirmenin yakın çekimi gösterilmektedir. Beyaz renkte PCM1 ile işaretlenmiş çekirdeklerin, kırmızı renkte transkripsiyon faktörü NKX2.5'i eksprese ettiğine ve yeşil renkteki kardiyomiyosit sitoplazmasıyla çevreli olduğuna dikkat edin.

Bu veriler birlikte, PCM one boyamasının kardiyomiyosit çekirdeklerini belirlemedeki doğruluğunu kanıtlamaktadır. Ek görsel, sonraki üç şekilde tasvir edilen deneyde oklarla daha ayrıntılı olarak belirtildiği üzere, miyosit çekirdeklerindeki PCM one'ın epi nükleer boyama paternini vurgulamaktadır; izole edilmiş kardiyak çekirdekler DNA boyası DRAC five ile ve PCM one'a karşı antikorlarla boyanmıştır. Burada, önceki iki şeklin üst üste bindirilmiş görüntüsünde oklar, izole edilmiş kardiyomiyosit çekirdeklerindeki PCM one'ın epi nükleer boyama paternini bir kez daha vurgulamaktadır.

Bu nokta grafiği, PCM one etiketlemesiyle belirtildiği üzere, bu yöntemle izole edilen çekirdeklerin yaklaşık %30'unun kardiyomiyosit çekirdekleri olduğunu göstermektedir. Son olarak, bu histogramların gösterdiği gibi, iki N pikinden anlaşıldığı üzere fare kardiyomiyosit çekirdekleri öncelikle diploidtir ve daha küçük olan dört N pikiyle belirtildiği üzere yalnızca küçük bir alt kümesi tetraploiddir. Bu tekniğin avantajlarından biri, diğer türlere kolayca uyarlanabilmesidir.

İnsanlar için olduğu gibi.