Name: Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Öğrenin, postmortem dokudan kardiyomiyosit çekirdeklerini izole etme yöntemini. Yoğunluk sedimentasyon santrifüjasyonu ve akış sitometrisi ile yüksek saflıkta çekirdek elde edilir. Bu teknik, gen ifadesi ve epigenetik analizler için kalp biyolojisi araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sitometrisi ile yardım için Marcelo Toro kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, İsveç ve Kalp-Akciğer Vakfı, AB Komisyonu 7.ÇP &quot;CardioCell&quot;, İsveç Araştırma Konseyi, AFA sigortalar ve ALF tarafından desteklenmiştir. OB Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir.

1. Kardiyak Çekirdek İzolasyonu <ol><li> % 1 BSA / PBS kaplama solüsyonu 10 ml Coat ultrasantrifüjdeki tüpler (Beckman santrifüj tüpünde # 363.664). Tüpler Cap ve onları bir tüp rotator 30 dakika döndürün. Kaplama çözümü çıkarın ve santrifüj tüplerine hava kuru (fare kalp başına bir tüp farklı canlı türlerinin tek bir fare kalpleri, dönüşümlü olarak 5&#39;e kadar fare kalpleri veya kalp dokusunun 1 gr analizi için gerekli izin (örneğin insan) işlenebilir bir tüp içinde). </li><li> Bütün aşağıdaki adımları buz üzerinde yapılmalıdır. Bistüri ile taze veya ek donmuş fare kalpten sol ventrikül parçalara ayır. Not, bu protokol fare kalp için optimize edilmiş değil, aynı zamanda sıçan veya insan kalp adapte edilebilir. Alternatif olarak, farklı canlı türlerinin kalp dokusunun 1 g kadar kullanabilirsiniz. </li><li> Bistüri ile küçük hücreler halinde numune kesin. </li><li> Lizis tamponu ile 15 ml ile doldurulmuş bir 50 ml Falcon tüp içine doku parçaları transfer edin. </li><li> Homojenize10 sn için 24,000 rpm bir T-25 Ultra-Turrax prob homojenizör (IKA) ile kalp dokusu. </li><li> 30 ml lizis tamponu eşit hacmi Homojenat sulandırınız. </li><li> Daha fazla doku ve serbest çekirdekler homojenize bir cam douncer (40 ml) kullanın. Büyük bir boşluk havaneli sekiz vuruş yapın. </li><li> Ham çekirdek, 100 mikron ile 70 mikron naylon örgü hücre süzgecinden (BD Biosciences), ardışık yoluyla izole geçirin. </li><li> Ham çekirdekler 10 dakika süreyle 700 xg&#39;de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) izole aşağı Spin. </li><li> Ters tüpler tarafından dikkatle Süpernatantı ve kağıt havluyla tüpün içini silin. Çekirdekler pelet rahatsız dikkat edin. </li><li> Ham çekirdek çözümü birkaç kez pipetleme ve aşağı sakaroz tampon 5ml izole eritin. Çözünmüş pelet ile sükroz tampon, bir başka 25 ml ilave edilir. </li><li> Kaplamalı ultrasantrifüjdeki tüp (adım 1.1) için taze hazırlanmış sakaroz tampon 10 ml ekleyin. &lt;/ Li&gt; <li> Dikkatli bir şekilde adım 1.9 den sükroz tampon içinde yeniden süspanse çözünmüş çekirdekler pelet ile sükroz tampon katma 10 ml kaplamak. </li><li> Bir JS13.1 ücretsiz sallanan rotor koymadan önce santrifüj tüplerine dengelemek ve yüksek hızlı santrifüj (Beckman Avanti S-25) içine rotor yerleştirin. </li><li> 60 dakika süre ile 4 ° C&#39;de 13,000 x g&#39;de çekirdekler Örnek dönerler. </li><li> Spin tamamlandığında, rotor dikkatlice tüpleri çıkarın ve ters tüpleri ile süpernatantı atın ve kağıt havlu ile tüplerin içerisinden kalan enkaz silerek. </li><li> Çekirdeklerin depolama tamponu (NSB artı tampon) 1 ml içinde çekirdekleri pelet eritin. Not: NSB artı bir DNA stabilizatörü olarak 1.5 mM spermin içerir. </li><li> Kardiyomiyosit çekirdeklerinin İmmünoboyama, adım 2.1 ile devam edin. </li></ol> 2. Akım Sitometri için pozitif <ol><li> Immünboyama için negatif kontrol hazırlayın. Bir çekirdek numunenin 20 ul dışında tablet ve bir atınNSB artı tamponu dd 980 ul. </li><li> Immunolabel kardiyomiyosit çekirdeklere 1:500 dilüsyon içinde çekirdek örnek anti-pericentriolar malzeme 1 antikoru (tavşan anti-PCM-1, Atlas Antikorlar) ekleyin. Adım 2,1 hazırlanan negatif kontrol etmek anti-PCM-1 antikoru ile aynı seyreltme, in izotip antikor ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;da negatif kontrol ve numune inkübe edin. </li><li> NSB artı tamponu (10 dakika için 700 xg&#39;de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) tüpler aşağı döndürün. Süpernatan atın ve NSB artı tampon 1 ml çekirdekleri pelet erimesi) ile en az bir kez negatif kontrol ve numune yıkayın. </li><li> 1:1000 dilüsyon negatif kontrol ve numune tüpüne anti-tavşan floresan sekonder antikor (FITC veya APC) ekleyin. </li><li> 1 saat boyunca 4 ° C de negatif kontrol ve numune inkübe. </li><li> NSB artı tamponu (10 dakika için 700 xg&#39;de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) tüpler aşağı spin ile en az bir kez negatif kontrol ve numune yıkayın. Süpernatant atın ve) NSB artı tampon 1 ml çekirdekleri pelet çözülür. </li><li> Akım sitometri analizi ve sıralama ile devam edin. </li></ol> 3. Akım Sitometri <ol><li> Adım 1.1 &#39;de tarif edildiği gibi sıralama akış sitometrisi başlamadan önce,% 1 BSA / PBS çözeltisi ile Coat çekirdekler toplama tüpleri (Falcon 15 ml). </li><li> Örnek 30 um ve bir hücre süzgecinden negatif kontrol filtre ve (BD Akın) ilk akış sitometresi ile negatif kontrol yerleştirin. Forward scatter (FSC), forward scatter darbe genişliği (FS darbe genişliği) ve yan dağılım (SSC) (Şekil 2a ve b) dayalı, çekirdekler ve mayoları (tek çekirdek) tanımlamak için birinci ve ikinci kapısı tanımlayın. Örnek leke bir DNA (DRAQ5 (1:500)) ekleme başlangıçta çekirdek nüfusu belirlemek için yardımcı olabilir. </li><li> Immunolabeled örnek yükleyin ve non-kardiyomiyosit çekirdek (PCM-1-negatif) gelen kardiyomiyosit çekirdeklerin (PCM-1-positve) izole etmek için üçüncü kapısı tanımlar. Sıralama başlayın(Şekil 2 c ve d). </li></ol> İsteğe bağlı: nükleer DNA içeriği (ploidi) analiz etmek ve çekirdekleri (örn. Hoechst 33342 veya DRAQ5) (Şekil 2e) için leke uygun bir DNA eklemek hücre döngüsü analizi gerçekleştirmek için. <ol start="4"><li> Flow sitometri sıralama sonra, buz çekirdekleri yerleştirin ve sıralama saflık (Şekil 3a ve b) belirlemek için yeniden analiz. </li><li> 15 dakika için soğutmalı santrifüj 1500 xg&#39;de toplama tüpleri içinde sıralanır çekirdekleri aşağıya Spin. </li><li> Aşağı uygulama ile uyumlu bir tampon içinde çekirdekler pelet içinde çözülür. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Çekirdek morfoloji ve DNA bütünlüğü lekeleri tarafından değerlendirilmeli ve mikroskobu (Şekil 1) ile görüntülenebilir. Başarılı PCM-1 etiketleme Epifloresans mikroskop ile ve akım sitometri (Şekil 1 ve Şekil. 2c ve d) tarafından değerlendirilebilir. PCM-1-positiettik ve negatif popülasyonunda (Şekil 2c ve d) birbirinden ayrılmalıdır. Fare sol ventrikül tüm çekirdeklerin yaklaşık% 30 (Şekil 2d) kardiyomiyosit çekirdeklerinin olmalıdır. Saflık Sıralama sıralanır çekirdeklerin (Şekil 3a ve b) yeniden analiz edilerek değerlendirilebilir. Her iki çekirdek popülasyonları% 95 aşan bir sıralama saflıkta olmalıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> Şekil 1.. PCM-1 kardiyomiyosit çekirdekler tanımlar. Kardiyak çekirdekler (a) PCM-1 (b) ve yetişkin bir fare kalbinde Nkx2.5 (c) antikorları ile boyanmış edilir. (D) PCM-1-etiketli çekirdekleri kardiyomiyosit sitoplazma (miyozin ağır zincir (MHC)) ile çevrilidir ve PCM-1 boyanmasının (ölçek çubukları 20 mikron ve 10 kardiyomiyosit çekirdeklerinin doğru kimlik belgeleyen, transkripsiyon faktörü Nkx2.5 ifade edilir mikron (d, inset)). (E) DNA ile görselleştirildiği Kardiyak çekirdekleri izole DRAQ5 leke. (F ve g) CardiomyocYTE çekirdekler PCM-1 (ölçek çubuğu 10 mikron) karşı antikorlar ile etiketlenir. Not, doku bölümünde miyosit çekirdek ve izole çekirdek (oklar), PCM-1 epinuclear boyanma paterni. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> Şekil 2. Kardiyomiyosit çekirdeklerinin Akış sitometrik sıralama. (A) Kardiyak çekirdeklerin forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) ile tanımlanır. (B) ikinci bir kapısı FSC ve FS darbe genişliği 5 ile tek çekirdek tanımlar. (C, d) Fluorescent perdeleme kalp dokudan kardiyomiyosit çekirdeklerin ayrılması (PCM-1-pozitif) ve non-kardiyomiyosit (PCM-1-negatif) çekirdekler sağlar. (E) Fare kardiyomiyosit çoğunlukla (&gt;% 80) diploit (2n) olan, sadece küçük bir alt kümesini (4n) 6 tetraploid olduğunu. Not, insan kardiyomiyositlerin poliploidi çekirdeğinin daha yüksek bir frekans (&gt; 2n) 7,8 içerir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <strong&gt; Şekil 3. Sıralanır kardiyomiyosit ve non-kardiyomiyosit çekirdeklerin saflığı analizi. Sıralanır non-kardiyomiyosit (a) ve kardiyomiyosit çekirdekler (b) yeniden analizi. Hem nüfusları% 99 aşan bir sıralama saflık göstermektedir.

<ol><li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li>
<li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li>
<li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content%2C+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li>
<li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content%2C+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts%3A+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li>
<li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li>
<li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li>
<li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2-5%28eGFP%2Fw%29+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li>
<li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28(2009).</li>
<li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li>
<li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li>
<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Kardiyomiyosit çekirdeklerinin doğru tespit miyokard 2,3 rejeneratif süreçlerinin analizi için çok önemlidir. Taze dokudan kardiyomiyositler izole etmek için, geleneksel teknikler özellikle hücre dışı matris proteinlerine enzimatik sindirimi ve düşük hızlı santrifüjleme ile interstisyel hücreleri daha sonra saflaştırma dayanmaktadır. Embriyonik kök hücreler (ESC) ile yaşayan kardiyomiyositlerin saflaştırma gibi Sirpa 9 veya mitokondriyal boyalar 10 gibi yüzey işaretleri ile immün tarafın...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Lizis Tampon </td></tr><tr><td> Reaktif Adı </td></tr><tr><td> 0,32 M sakaroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl2 </td></tr><tr><td> 5 mM magnezyum asetat </td></tr><tr><td> 2.0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0.5 mM EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 2. Sakkaroz tampon </td></tr><tr><td> Reaktif Adı </td></tr><tr><td> 2.1 M sakkaroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM magnezyum asetat </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 3. Çekirdekler depolama tamponu (NSB plus) </td></tr><tr&gt; <td> Reaktif Adı </td></tr><tr><td> 0,44 M sakaroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 1,5 mM spermin </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifler ve Ekipmanları </td><td> Şirket </td></tr><tr><td> Izotip tavşan IgG-ChIP Grade # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> Tavşan anti-PCM-1 antikoru, # HPA023374 </td><td> Atlas Antikorlar </td></tr><tr><td> Eşek sn. antikoru, anti-tavşan Alexa 488 Fluor, # A-21206 veya eşdeğer san. floresan antikor </td><td> Yaşam Teknolojileri </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> Hücre süzgeçler 30 mikron, 70 mikron ve 100 mikron </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> Cam douncer (40 ml) ve&quot;L&quot; havaneli </td><td> VWR (Wheaton Sanayi A.Ş.) </td></tr><tr><td> T-25 Ultra-Turrax Homojenizatör </td><td> IKA Almanya </td></tr><tr><td> Aracı S25 N-18 G Dispergatör </td><td> IKA Almanya </td></tr><tr><td> Beckman Avanti Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Falcon tüpler 15 ml ve 50 ml </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman Santrifüj Tüpleri # 363664 </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> JS13.1 ücretsiz sallanan rotor </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Akını sitometresi </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Tüp Rotator </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

post-mortem doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

En stratejileri sadece sitoplazmik protein işaretleyicileri 1 güveniyor gibi kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlenmesi doku kesitlerinde zor olmuştur. Gibi çoğalması ve apoptosis gibi kardiyak miyositler Nadir olaylar kardiyak miyosit çekirdeklerinin doğru bir tanımlama homeostazında ve patolojik durumların 2 hücresel yenilenme analiz gerektirir. Burada, pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) ve sonraki akım sitometri sıralama karşı antikorlar ile yoğunluğu sedimantasyon ve immün tarafından otopsi doku kardiyomiyosit çekirdekleri izole etmek için bir yöntem sağlar. Bu strateji, taze doku ve dondurulmuş arşiv malzemesi gayet iyi çalışma avantajı ile yüksek verimlilik analizi ve izolasyon sağlar. Bu da zaten biyobankalar toplanan malzeme çalışma kolaylaştırır. Bu teknik uygulanabilir ve türler, geniş bir aralık içinde test edilmiştir ve karbon-14 3, hücre-CY olarak birden çok alt-uygulamalar için uygundurcle analizi 4, timidin analogları görselleştirme (örneğin BrdU ve DUK) 4, transcriptome ve epigenetik analizi.

Kardiyak çekirdeklerin yoğunluğu sedimentasyon ile izole edilmiş ve akım sitometri kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve sıralamak için pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) karşı antikorlar ile immunolabeled edilir.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Çoğu stratejinin yalnızca sitoplazmik marker proteinlere dayanması nedeniyle, doku kesitlerinde kardiyomiyosit çekirdeklerinin tanımlanması zorlayıcı olmuştur1. Nadir olaylar ...

Bu prosedürün genel amacı, postmortem dokulardan kardiyomiyosit çekirdeklerini izole etmektir. Bu işlem, önce dokunun bir prob homojenizatör ve cam ezici ile homojenize edilmesi ve ardından birkaç filtrasyon adımının uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, yoğunluk sedimentasyon santrifüjasyonu ile nükleer fraksiyonun diğer hücresel fraksiyonlardan izole edilmesidir.Ardından, kardiyomiyosit çekirdekleri PCM1'e karşı üretilmiş bir antikor ile immün olarak etiketlenir. Son adım, etiketlenmiş kardiyomiyosit çekirdeklerinin floresan aktivasyonlu hücre ayıklama yöntemiyle izole edilmesidir. Nihayetinde, daha ileri işlemlere geçmeden hemen önce, ayıklanan nükleer fraksiyonların yeniden analizi ile kardiyomiyosit çekirdeklerinin saflığı doğrulanır.Bu tekniğin temel avantajı, kardiyomiyosit çekirdeklerinin hem taze hem de dondurulmuş arşiv dokularından yüksek kapasiteli bir şekilde eşit derecede iyi analiz edilebilmesidir. Kardiyomiyositlerdeki DNA tabanlı çalışmalarle birkaç nedenden dolayı özellikle zordur. İlk olarak, kardiyomiyositler kalpteki hücrelerin yalnızca yaklaşık %20-30'unu oluşturur.Ayrıca, bunlar önemli derecede çekirdeklidir. Dahası, kardiyomiyositler önemli derecede poliploiddir. Burada açıklanan bu yöntem, tüm bu engelleri aşmaktadır.Prosedüre başlamadan önce, ultrasantrifüj tüplerini 10 mililitre %1 BSA artı PBS kaplama çözeltisi ile kaplayın. Tüpleri 30 dakika boyunca döndürdükten sonra, kaplama çözeltisini uzaklaştırın ve tüplerin havada kurumasını bekleyin.Şok dondurulmuş bir fare kalbinden sol ventrikülü bir bistüri yardımıyla ayırarak kardiyak çekirdek izolasyon prosedürüne başlayın. Ayrıştırılan örneği küçük segmentler halinde kesin ve ardından doku parçalarını 15 mL liziz tamponu ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Ardından, kalp dokusunu bir prob homojenizatör ile 24.000 RPM'de 10 saniye boyunca homojenize edin ve ardından homojenatı eşit hacimde liziz tamponu ile 30 mL'ye tamamlayarak seyrelitin. Çekirdekleri serbest bırakmak için homojenatı, geniş açıklıklı bir havanla sekiz darbe uygulayarak cam bir homojenizatöre aktarın.Ardından ham çekirdekleri geçirin. Önce 100 mikronluk bir hücre süzgecinden, sonra 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe izole edin. Şimdi ham çekirdek izolatını 700 ×g'de ve dört °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırmak için tüpü ters çevirin ve ardından tüpün içini bir kağıt havluyla silin. Çekirdek peletini bozmamaya dikkat edin. Ham çekirdekleri yeniden süspande etmek için çözeltiyi birkaç kez pipetle çekip boşaltın.Beş mililitre sükroz tamponunda izole edin ve ardından çekirdek süspansiyonuna 25 mililitre daha sükroz tamponu ekleyin. Sonrasında, önceden hazırlanmış kaplamalı ultrasantrifüj tüplerinden birine 10 mililitre taze hazırlanmış sükroz tamponu ekleyin. Ardından, yeniden süspanse edilen çekirdek peleti çözeltisini tamponun üzerine dikkatlice ekleyin.Tüpü serbest salınımlı bir rotorda dengeledikten sonra, rotoru yüksek hızlı bir santrifüje yerleştirin ve çekirdek örneğini 60 dakika boyunca 13,000 ×g'de ve dört °C'de santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, tüpleri rotordan dikkatlice çıkarın ve tekrar ters çevirin. Süpernatantı atmak için, daha önce yaptığınız gibi tüpün içindeki kalan kalıntıları bir kağıt havluyla silin ve ardından çekirdek peletini bir mililitre çekirdek saklama tamponu içinde yeniden süspande edin.İmmün boyama prosedürüne başlamadan önce, çekirdek örneğinden 20 µL'lik bir alikotu bir faks tüpüne aktarın. Alikota 980 µL çekirdek saklama tamponu ekleyin ve tüpü negatif kontrol olarak etiketleyin. Şimdi, çekirdek örneği ve negatif kontrol tüplerine 1:500 dilüsyonunda anti-PCM1 antikoru ekleyin.Ardından her iki tüpü dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri çekirdek saklama tamponu ile yıkayıp süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, çekirdek peletlerini bir mililitre daha çekirdek saklama tamponu içinde yeniden süspande edin.Ardından, hücre örneklerine 1/100 dilüsyonunda anti-tavşan floresan ikincil antikor ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat inkübe edin. Tüpleri çekirdek saklama tamponu ile yıkadıktan sonra, pelletleri akış sitometrik ayırma ve analiz için bir mililitre çekirdek saklama tamponu içinde yeniden süspanse edin. Videonun başlangıcında olduğu gibi çekirdek toplama tüplerini BSA ve PBS ile kapladıktan sonra, numuneyi ve negatif kontrolü ayrı ayrı 30 mikronluk hücre süzgeçlerinden geçirerek işleme başlayın. Yüklemeden hemen önce bir DNA boyası ekleyin.Çekirdek popülasyonlarının tanımlanması için 1/500'lük bir dilüsyon ekleyin. Negatif kontrolü akış sitometresine yükleyin. Burada gösterilen DOT grafiğine benzer şekilde, kardiyak çekirdekleri tanımlamak için ilk kapılamayı (gate) yerleştirmek amacıyla ileri ve yan saçılma parametrelerini kullanın.Ardından, burada gösterilen DOT grafiğine benzer şekilde, çekirdek singletleri etrafında ikinci bir kapı oluşturmak için ileri saçılma (forward scatter) ve ileri saçılma darbe genişliği (forward scatter pulse width) parametrelerini kullanın. Şimdi immün işaretli örneği yükleyin ve PCM-1 pozitif kardiyomiyosit çekirdeklerini PCM-1 negatif kardiyomiyosit dışı çekirdeklerden ayırt etmek için üçüncü kapıyı yerleştirin. DNA içeriğini analiz etmek ve bu histogramla örneklendirilen analize benzer bir hücre döngüsü analizi gerçekleştirmek için nükleer DNA boyasını kullanın.Çekirdekler PCM1 pozitifliğine göre ayrıştırıldıktan sonra, ayrıştırılan çekirdekleri buza yerleştirin ve her bir ayrıştırılmış örnekten bir alikotu, ayrıştırma saflığını belirlemek için yeniden analiz edin. Son olarak, ayrıştırılan çekirdekleri toplama tüplerinde 15 dakika boyunca 1500 ×g ve 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatantları attıktan sonra, çekirdek peletlerini istenen sonraki uygulama ile uyumlu bir tampon çözelti içinde yeniden süspande edin.Bu ilk şekilde, yetişkin bir fare kalbi nükleer bir boya ile PCM1'e, fare kalp transkripsiyon faktörü NKX2.5'e ve miyozin ağır zincirine veya MHC'ye karşı antikorlarla boyanmıştır. Burada, önceki şekildeki üst üste bindirmenin yakın çekimi gösterilmektedir. Beyaz renkte PCM1 ile işaretlenmiş çekirdeklerin, kırmızı renkte transkripsiyon faktörü NKX2.5'i eksprese ettiğine ve yeşil renkteki kardiyomiyosit sitoplazmasıyla çevreli olduğuna dikkat edin.Bu veriler birlikte, PCM one boyamasının kardiyomiyosit çekirdeklerini belirlemedeki doğruluğunu kanıtlamaktadır. Ek görsel, sonraki üç şekilde tasvir edilen deneyde oklarla daha ayrıntılı olarak belirtildiği üzere, miyosit çekirdeklerindeki PCM one'ın epi nükleer boyama paternini vurgulamaktadır; izole edilmiş kardiyak çekirdekler DNA boyası DRAC five ile ve PCM one'a karşı antikorlarla boyanmıştır. Burada, önceki iki şeklin üst üste bindirilmiş görüntüsünde oklar, izole edilmiş kardiyomiyosit çekirdeklerindeki PCM one'ın epi nükleer boyama paternini bir kez daha vurgulamaktadır.Bu nokta grafiği, PCM one etiketlemesiyle belirtildiği üzere, bu yöntemle izole edilen çekirdeklerin yaklaşık %30'unun kardiyomiyosit çekirdekleri olduğunu göstermektedir. Son olarak, bu histogramların gösterdiği gibi, iki N pikinden anlaşıldığı üzere fare kardiyomiyosit çekirdekleri öncelikle diploidtir ve daha küçük olan dört N pikiyle belirtildiği üzere yalnızca küçük bir alt kümesi tetraploiddir. Bu tekniğin avantajlarından biri, diğer türlere kolayca uyarlanabilmesidir.İnsanlar için olduğu gibi.

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Kardiyomiyosit döngüsünün ölçülmesi zordur. Burada açıklanan protokol, neo-kardiyomiyosit çekirdek oluşumu ve çekirdek ploidisinin doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayarak bu zorluğa önemli bir katkı sağlar.

Kardiyomiyosit DNA Sentezi ve ploidinin Eşzamanlı Değerlendirme: Bir Yöntem kardiyomiyosit Yenilenme ve ciro miktarının belirlenmesi Yrd

Kardiyomiyositlerde hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için, iki transgenik fare hattı kullanarak protokoller sunuyoruz: kardiyomiyosit çekirdeklerinin kesin olarak tanımlanması için Myh6-H2B-mCh transgenik fareler ve hücre bölünmesini hücre döngüsü varyasyonlarından ayırt etmek için CAG-eGFP-anilin fareleri.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Bu çalışmanın amacı, kardiyomiyositleri yetişkin kalpten tekrarlıca izole etmek ve DNA içeriğini ve nükleasyonu ölçmek için bir yöntem geliştirmektir.

İmmünsitokimya ve Ploidi Analizi için Sabit Kalplerden Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (&lt;50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Antegrad perfüzyon tekniği ile yüksek kaliteli bireysel fare kalp hücrelerini izole etmek için basit bire yöntemi geliştirdik. Bu yöntem Langendorff içermez ve kardiyak fibroblastlar veya progenitörler gibi ventrikül ve atriyal miyositleri veya interstisyel hücreleri izole etmek için yararlıdır.

Farelerden Kardiyomiyosit İzolasyonu için Antegrad Perfüzyon Yöntemi

Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.

Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Burada, miyokard enfarktüsü sonrası (MI) fare kalbinden yüksek canlılığa sahip yeterli miktarda tek kardiyomiyosit olmayan izole etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu, sonraki tek hücreli dizileme, akış sitometri analizi ve birincil hücre kültürü için kullanılabilir.

Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yetişkin Fare Kalbinden Tek Hücreli RNA Dizilimi için Kardiyomiyosit Olmayan Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Koroner endarterektomi doku örnekleri, optimize edilmiş bir dissosiyasyon protokolü kullanılarak tek çekirdekleri izole etmek için işlendi. İzole çekirdeklerin bütünlüğü üç tamamlayıcı yaklaşımla doğrulandı: zar bütünlüğünü değerlendirmek için tripan mavisi dışlama boyama, nükleer morfolojiyi doğrulamak için DAPI tabanlı konfokal mikroskopi ve nükleer verim ile saflığı nicelikten ölçemek için akış sitometrisi.

Koroner Endarter Baypas Grefti Hastalarının Koroner Endarterektomi Dokusundan Tek Çekirdek İzolasyonu

Öğrenin, postmortem dokudan kardiyomiyosit çekirdeklerini izole etme yöntemini. Yoğunluk sedimentasyon santrifüjasyonu ve akış sitometrisi ile yüksek saflıkta çekirdek elde edilir. Bu teknik, gen ifadesi ve epigenetik analizler için kalp biyolojisi araştırmalarında kullanılır.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet