Name: Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin, fare hipotalamus beyin dilimlerinde GFP etiketli nöronlarda kalsiyum yanıtlarını kırmızı floresan boya ile görüntüleme yöntemini. Konfokal mikroskopi ile uzamsal ve zamansal analiz yapılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz çalışmalarına katılan meslektaşlarımızın burada özetlenen ederim. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 &#39;koku duyusunun Bütünleştirici analizi&#39; dan hibe ve Volkswagen Vakfı (TLZ) tarafından desteklenmiştir. TLZ Volkswagen Vakfı Lichtenberg Profesörü.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
	 <a target="_blank" href="
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sinirbilim bir önemli soru beynin sosyal bilgiler nasıl işlediğini anlamak. Sosyal tanıma için gerekli bilgilerin bir baskın kaynağı koku veya pheromonal sinyalleri tarafından kodlanmıştır. Nöronal burun nüfus ve özellikle beyin, hipotalamus sinyallerin tanınması ile bu sinyallerin tespiti, birçok sosyal süreçler ve etki hormonlar ve diğer nöroendokrin faktörler 13-16 anahtar bir rol oynamaktadır. Birden çok fonksiyonlu nöronlar çekirdekler içeren hipotalamus gibi beyin bölgelerinde nöronal yanıtları analiz t...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Kedi. N ° </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Titreşimli-Blade Mikroskobik damanı V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Mikroskobik damanı V 50 için Aygıt CU 65 Soğutma </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 İnkübatör, CB210-UL </td><td> Cilt </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Süper yapıştırıcı, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> İkili spatula, kaşık şekilli </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Microspoon spatula, kaşık şekilli </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Bahar Makas, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Bıçakları </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> Bahar Makas, Vannas - 3mm Bıçakları </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Wagner Makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> Tıbbi Forseps, Dumont 7b </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> Büyük Dikdörtgen Açık Banyo Odası (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Konfokal Mikroskop BioRad Işıltı 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

hipotalamik fare beyin dilimleri gfp etiketli nöronlar in görüntüleme kalsiyum cevapları

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Beyinde bilgi kodlama, kesin moleküler adımları yanı sıra hipotalamus kalır gibi beyin bölgelerinin çok fonksiyonlu çekirdekler belirli nöronların aktivitesi açısından merkezi bir soru altında yatan mekanizmalar hakkında bilgimiz çok büyük bir artış olmasına rağmen. Bu sorun, çeşitli nevrohormondur sinyal iletim cascades düzenlenmesinde rol oynayan moleküler bileşenlerin tanımlanmasını içerir. Hücre içi Ca2 + yükselmesi iki sinyal iletim seviyesinde ve sinaptik de nöron duyarlılık düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Yeni araçlar, belirli bir promotör kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade ederek beyin nöronlarının sayısız nöronlar belirlemenize yardımcı olmak için ortaya çıkmıştır. Hem mekansal ve zamansal olarak uyaran-indüklenen izlemek için Ca 2 GFP etiketli nöronlar, olmayan bir yeşil floresan Ca 2 + göstergesi boya n + yanıtlarıeeds kullanılır. Buna ek olarak, konfokal mikroskopi doku içindeki derinliği farklı düzlemlerde nöronlar görselleştirmek ve out-of-odak floresans sınırlamak için kabiliyeti nedeniyle doku dilimleri görüntüleme bireysel nöronların bir favori yöntemidir. Nöronlar 1 GFP-etiketli rasyometrik Ca 2 + gösterge fura-2 kombinasyon halinde kullanılmıştır. Ancak, boya ultraviyole (UV) ışık tarafından heyecanlı. UV ışık lazer ve sınırlı optik penetrasyon derinliği maliyeti birçok laboratuvarda kullanımı engellemiştir. Ayrıca, GFP floresan fura-2 sinyalleri 2 etkileyebilir. Bu nedenle, bir kırmızı floresan Ca 2 + gösterge boyası kullanmaya karar verdi. Fura-kırmızı büyük Strokes vites bir tek uyarılma dalgaboyu kullanılarak GFP ile kombinasyon halinde kırmızı renkli floresans analiz izin verir. Biz olfaktör nöronlar 3 GFP etiketli birlikte fura-kırmızı kullanarak önceden iyi sonuçlar vardı. Olfaktör doku dilimleri için protokoller e işe yaradıqually iyi hipotalamik nöronlar 4. Ca 2 tabanlı Fura-kırmızı + görüntüleme de başarıyla GFP etiketli pankreatik β-hücreleri ve HEK hücre 5,6 olarak ifade GFP etiketli reseptörleri ile kombine edildi. Fura-kırmızı küçük bir cilvesi göstergesi kalsiyum 7 bağlar kez 650 nm&#39;de onun floresans yoğunluğunu azaltır olmasıdır. Bu nedenle, düşük Ca2 + konsantrasyon ile dinlenme nöronların floresan nispeten yüksek yoğunluğuna sahiptir. Unutulmamalıdır, diğer kırmızı Ca 2 +-göstergesi boyalar var veya şu anda geliştirilmekte olan, farklı nöron ve beyin bölgelerinde daha iyi ya da daha iyi sonuçlar verebilir.

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri güncellemek<sup&gt; 2 +</supBir kırmızı floresan Ca kullanarak beyin dokusunda dilimler GFP etiketli nöronlar&gt; sinyalleri<sup&gt; 2 +</sup&gt; Gösterge boyası.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Beyinde bilginin kodlanmasının altında yatan mekanizmalara dair bilgilerimizdeki muazzam artışa rağmen, ... ile ilgili temel bir soru...

Bu prosedürün genel amacı, yeşil olmayan floresan bir kalsiyum indikatör boyası kullanarak, beyin kesitlerinde hem GFP etiketli nöronlardaki hem de mekansal ve zamansal olarak stimülüsle indüklenen kalsiyum yanıtlarını izlemektir. Bu işlem, öncelikle spesifik hücrelerde GFP eksprese eden transgenik bir farenin beyninin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise mikrotom ile doku kesitlerinin hazırlanmasıdır.Ardından, boyanın beyin hücreleri tarafından alınmasını sağlamak için kalsiyum indikatör boya yükleme solüsyonu dilimlerin üzerine pipetlenir. Son adım, konfokal mikroskopi kullanarak floresan hücrelerin zaman damgalı kaydının gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, GFP etiketli nöronlardaki kalsiyum yanıtları, çok renkli kalsiyum görüntüleme analizi kullanılarak gösterilir.Bu tekniğin mevcut konfokal mikroskopi yöntemlerine göre temel avantajı, kırmızıya kaydırılmış floresan kalsiyum indikatör boyası kullanarak yeşil floresan GFP etiketli nöronlarda kalsiyumu görüntüleyebilmemizdir. Boyanın geniş Stokes kayması, tek bir eksitasyon dalga boyu kullanarak kırmızı floresansın yeşil GFP ile kombinasyonunda çok renkli analiz yapmamıza olanak tanır. Bu yöntem fikri ilk olarak, yalnızca yeşil floresan protein olan genetik floresan etiketleme yöntemiyle tanımlayabildiğimiz nöronlardaki kalsiyum sinyallerini izleme problemiyle karşılaştığımızda ortaya çıktı.Şimdi bu prosedürün çeşitli kritik adımlarını göstereceğim. Prosedüre, ısıtılmış agar çözeltisini kare bir Petri kabına bir santimetre yüksekliğe gelecek şekilde dökerek başlayın; %4'lük agar jel soğutulup sertleştikten sonra bir santimetreküp boyutunda bloklar halinde kesilir ve saklama için bir şişeye yerleştirilir. Fareyi dekapite ettikten sonra, kafa derisini tek ağızlı bir jiletle frontal kemikten eksternal oksipital çıkıntıya kadar merkezi sagital yönde kesin.Ardından, kesilmiş olan kafa derisini önce rostral lateral yönde, daha sonra ventral yönde daha fazla açın. Son olarak iki lateral ve bir rostral kesi yapın.Foramen magnum bölgesinde, küçük yaylı makasla kafatasını dikkatlice kesin. Bu aşamada, oksipital, interparietal ve parietal kemiklerin ayrılmış olması gerekir. Eğer dura mater hala mevcutsa, beyne zarar vermemek için bir penset yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın.Ardından, squamal kemiği, anterior etmoidal ve frontal foramen çıkarın. Artık beyin, ters çevrilmiş bir mikro kaşık spatula ile kolayca çıkarılabilir ve kranial sinirler kesilebilir. Beyin, ventral yüzeyi aşağı gelecek şekilde, kesilmeye dayanıklı bir yüzeyin üzerine ventral tarafı üzerine konulmalıdır.Serebellumu çıkarmak için tek kenarlı bir jilet kullanın. Bu düz kesim yüzeyi, koronal beyin kesitlerinin alınabilmesi için beynin bir plakaya monte edilmesinin temelini oluşturacaktır. Ardından, beyini kesik yüzeyi tabana gelecek şekilde, az miktarda hızlı kürlenen yüksek performanslı siyanoakrilat yapıştırıcı süper yapıştırucu kullanarak mikrotomun taban plakasına yapıştırın.Ardından, dilimleme sırasında beyni desteklemek ve sabitlemek için, beynin ventral tarafına bir santimetreküp agar jel bloğu yapıştırarak mikrotom taban plakasına sabitleyin. Bağ kuruyan sonrası, plakayı mikrotomun altı santigrat derece sıcaklıktaki soğuk oksijenle doyurulmuş hücre dışı solüsyon içeren banyosuna yerleştirin. Daha sonra, beyni düşük dilimleme hızıyla 300 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin; tüm beyin kesitleri tamamlanana kadar koronal beyin dilimleri toplayın.Şimdi, onic F1 27 tozuna DMSO çözeltisi ekleyerek %20'lik onic F1 27 DMSO çözeltisi hazırlayın. Ardından, çözeltiye iki dakika boyunca doğrudan sonikasyon uygulayarak çözünür hale getirin. Bundan sonra, 50 µg hücre geçirgen furred am içeren bir tüpe beş µL %20'lik onic F1 27 çözeltisi ekleyin.Çözeltiyi bir pipetle karıştırın. Ardından karışıma 45 µL hücre dışı çözelti ekleyin ve vorteksleyin. Kısaca, 325 µL daha hücre dışı çözelti ekleyin ve tüpü üç dakika daha sonikasyona tabi tutun.Sonikasyondan sonra, nihai kalsiyum indikatörü D yükleme çözeltisini elde etmek için 1,156 mililitre oksijenle doyurulmuş hücre dışı çözelti ekleyin. Koronal beyin kesitlerini, her kuyucuğa altı kesit gelecek şekilde, oksijenle doyurulmuş hücre dışı çözelti ile doldurulmuş altı kuyucuklu bir hücre kültürü plağına aktarın. Ardından, beyin kesitlerine zarar vermemeye dikkat ederek bölmelerdeki oksijenle doyurulmuş hücre dışı çözeltiyi aspire edin.Ardından, her bir kuyucuğa doğrudan 750 µL kalsiyum indikatörü D yükleme çözeltisi pipetleyin. Beyin dilimleri, rore am içeren çözelti ile kaplanmış olmalıdır. Bundan sonra, dilimleri oksijen-karbondioksit hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 45 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.İnkubasyonun sonunda, hücrelerin aşırı yüklenmesini önlemek için kalsiyum indikatörü DI yükleme solüsyonunu taze oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyon ile değiştirin. Stimülasyon kaynaklı floresan sinyal değişimlerini izlemek için, fure red yüklü beyin dilimlerinden birini kayıt haznesine aktarın ve istediğiniz şekilde konumlandırın. Hazneyi konfokal mikroskop düzeneğine monte ettikten sonra, hücre dışı kalsiyum indikatörü boyasının fazlasını uzaklaştırmak için dilimi 10 dakika boyunca oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyon ile perfüze edin.Kayıt haznesinden çıktıktan sonra, PERFUSE sekiz bir vakum şişesinde toplanır. Ardından, kesit mikroskop altında düşük büyütme ile incelenir. Kesitin yönü not edilir ve kesitteki ilgi alanı, bizim durumumuzda beyindeki hipotalamik bölge, bulunur.Ardından, yüksek büyütmeye geçin. GFP görüntüleri toplayarak ve eş zamanlı olarak URA kırmızı sinyalinin floresan yoğunluğunu kontrol ederek kesitteki ilgili hücreyi bulun. Lazer gücünü, URA kırmızı floresan yoğunluğundaki değişimlerin ölçülmesine izin verecek ve iki floroforun ağarmasını önleyecek bir değere ayarlayın.Ardından, fure ve GFP sinyallerini toplamak için 0,5 ila iki hertz arasındaki hızlarda görüntü almaya başlayın. Bu şekil, koronal beyin kesitindeki GN, RHR Tau GFP nöronlarının konfokal görüntüsünü göstermektedir. Bu, beyin kesiti fure am ile yüklendikten sonra gözlenen nispeten tekdüze floresan sinyaldir ve bu da kalsiyum indikatör boyası ile yüklenmiş nöronları gösteren birleştirilmiş görüntüdür.Farklı hipotalamik beyin bölgelerindeki bireysel GFP etiketli nöronlardan elde edilen somatik uyaranla indüklenmiş kalsiyum yanıtı örnekleri burada sunulmuştur. Farklı hipotalamik çekirdeklerin GN RHR eksprese eden nöronları arasındaki belirgin kalsiyum sinyalleri, yöntem ustalaştıktan sonra, aynı süre zarfında belirli bir hücredeki toplam kalsiyum değişiminin bir tahmini olarak eğri altındaki alan kullanılarak karşılaştırılabilir. Bu teknik, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde, kalsiyum indikatör boyasının hazırlanması, yüklenmesi ve kesitlerin inkübasyonu dahil olmak üzere 90 dakikadan kısa sürede tamamlanabilir.

imaging-calcium-responses-gfp-tagged-neurons-hypothalamic-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Vomeronazal organ (VNO), sosyal ve üreme bilgilerini ileten tür içi kimyasal sinyalleri tespit eder. VNO dokusunda G-CaMP2 eksprese eden transgenik fareler kullanarak Ca2+ görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Bu yaklaşım, vomeronazal nöronların çok sayıda feromon uyarısına verdiği karmaşık yanıt modellerini analiz etmemize olanak tanır.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

Kaynak: Bancroft, E. A., {{}} ve diğerleri. Spontan Ca2+{{}} Akıları ve Aşağı Akış Etkilerinin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm.  (2020) {{TAG_ 46}}Bu video, fare embriyolarından türetilen ventral orta beyin nöronlarındaki kalsiyum akışının gerçek zamanlı görselleştirmesini göstermektedir. Bir kalsiyum indikatörünü ifade etmek için viral bir vektör kullanılarak, nöronlar, spontan ve nörotransmitter kaynaklı kalsiyum aktivitesi sırasında floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemek için konfokal bir...

Fare Embriyolarından Türetilen Ventral Orta Beyin Nöronlarında Kalsiyum Akışının Görselleştirilmesi

Biz yukarıda ikili birincil somatosensor corticies (S1) Thy1içinde çift optik pencerelerden nöronal aktivite ölçmek için deneysel bir işlem tarif-GCaMP6s transgenik fareler 2-foton (2 P) mikroskopi vivo içindekullanma.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca2 + geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Burada canlı, uyuşturuldulu bir laboratuvar faresinin genikül ganglionunun nasıl ortaya çıkarılacağını ve bu nöronların topluluklarının uyaranları tatmak için tepkilerini ölçmek için kalsiyum görüntülemenin nasıl kullanılacağını ve farklı uyarıcılarla birden fazla denemeye izin vermeyi sunuyoruz. Bu, hangi nöronların hangi şok tabancalarına yanıt verdiğine derinlemesine karşılaştırmalar sağlar.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Mevcut protokol, lomber-6 DRG nöron topluluklarının somatik ve viseral uyaranlara tepkilerini ölçmek için in vivo kalsiyum görüntülemeyi ana hatlarıyla belirtir. Farklı uyaranlara yanıt veren nöronlar arasında kapsamlı karşılaştırmalar yapılabilir. Bu protokol, akupunktur gibi viseral ağrı ve somatik stimülasyon mekanizmalarını araştırmak için değerlidir.

In vivo (İn canlı) Dorsal Kök Gangliyon Nöronlarının Somatik ve Viseral Uyaranlara Yanıtının Kalsiyum Görüntülemesi

Hipokampusun dentat girusu, öğrenme ve hafızada temel ve farklı işlevleri yerine getirir. Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde dentat girustaki granül hücrelerinin in vivo kalsiyum görüntülemesi için bir dizi sağlam ve verimli prosedürü tanımlar.

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi 

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin, fare hipotalamus beyin dilimlerinde GFP etiketli nöronlarda kalsiyum yanıtlarını kırmızı floresan boya ile görüntüleme yöntemini. Konfokal mikroskopi ile uzamsal ve zamansal analiz yapılır.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Daha fazla video keşfet