Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Bu prosedürün genel amacı, yeşil olmayan floresan bir kalsiyum indikatör boyası kullanarak, beyin kesitlerinde hem GFP etiketli nöronlardaki hem de mekansal ve zamansal olarak stimülüsle indüklenen kalsiyum yanıtlarını izlemektir. Bu işlem, öncelikle spesifik hücrelerde GFP eksprese eden transgenik bir farenin beyninin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise mikrotom ile doku kesitlerinin hazırlanmasıdır.

Ardından, boyanın beyin hücreleri tarafından alınmasını sağlamak için kalsiyum indikatör boya yükleme solüsyonu dilimlerin üzerine pipetlenir. Son adım, konfokal mikroskopi kullanarak floresan hücrelerin zaman damgalı kaydının gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, GFP etiketli nöronlardaki kalsiyum yanıtları, çok renkli kalsiyum görüntüleme analizi kullanılarak gösterilir.

Bu tekniğin mevcut konfokal mikroskopi yöntemlerine göre temel avantajı, kırmızıya kaydırılmış floresan kalsiyum indikatör boyası kullanarak yeşil floresan GFP etiketli nöronlarda kalsiyumu görüntüleyebilmemizdir. Boyanın geniş Stokes kayması, tek bir eksitasyon dalga boyu kullanarak kırmızı floresansın yeşil GFP ile kombinasyonunda çok renkli analiz yapmamıza olanak tanır. Bu yöntem fikri ilk olarak, yalnızca yeşil floresan protein olan genetik floresan etiketleme yöntemiyle tanımlayabildiğimiz nöronlardaki kalsiyum sinyallerini izleme problemiyle karşılaştığımızda ortaya çıktı.

Şimdi bu prosedürün çeşitli kritik adımlarını göstereceğim. Prosedüre, ısıtılmış agar çözeltisini kare bir Petri kabına bir santimetre yüksekliğe gelecek şekilde dökerek başlayın; %4'lük agar jel soğutulup sertleştikten sonra bir santimetreküp boyutunda bloklar halinde kesilir ve saklama için bir şişeye yerleştirilir. Fareyi dekapite ettikten sonra, kafa derisini tek ağızlı bir jiletle frontal kemikten eksternal oksipital çıkıntıya kadar merkezi sagital yönde kesin.

Ardından, kesilmiş olan kafa derisini önce rostral lateral yönde, daha sonra ventral yönde daha fazla açın. Son olarak iki lateral ve bir rostral kesi yapın.

Foramen magnum bölgesinde, küçük yaylı makasla kafatasını dikkatlice kesin. Bu aşamada, oksipital, interparietal ve parietal kemiklerin ayrılmış olması gerekir. Eğer dura mater hala mevcutsa, beyne zarar vermemek için bir penset yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın.

Ardından, squamal kemiği, anterior etmoidal ve frontal foramen çıkarın. Artık beyin, ters çevrilmiş bir mikro kaşık spatula ile kolayca çıkarılabilir ve kranial sinirler kesilebilir. Beyin, ventral yüzeyi aşağı gelecek şekilde, kesilmeye dayanıklı bir yüzeyin üzerine ventral tarafı üzerine konulmalıdır.

Serebellumu çıkarmak için tek kenarlı bir jilet kullanın. Bu düz kesim yüzeyi, koronal beyin kesitlerinin alınabilmesi için beynin bir plakaya monte edilmesinin temelini oluşturacaktır. Ardından, beyini kesik yüzeyi tabana gelecek şekilde, az miktarda hızlı kürlenen yüksek performanslı siyanoakrilat yapıştırıcı süper yapıştırucu kullanarak mikrotomun taban plakasına yapıştırın.

Ardından, dilimleme sırasında beyni desteklemek ve sabitlemek için, beynin ventral tarafına bir santimetreküp agar jel bloğu yapıştırarak mikrotom taban plakasına sabitleyin. Bağ kuruyan sonrası, plakayı mikrotomun altı santigrat derece sıcaklıktaki soğuk oksijenle doyurulmuş hücre dışı solüsyon içeren banyosuna yerleştirin. Daha sonra, beyni düşük dilimleme hızıyla 300 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin; tüm beyin kesitleri tamamlanana kadar koronal beyin dilimleri toplayın.

Şimdi, onic F1 27 tozuna DMSO çözeltisi ekleyerek %20'lik onic F1 27 DMSO çözeltisi hazırlayın. Ardından, çözeltiye iki dakika boyunca doğrudan sonikasyon uygulayarak çözünür hale getirin. Bundan sonra, 50 µg hücre geçirgen furred am içeren bir tüpe beş µL %20'lik onic F1 27 çözeltisi ekleyin.

Çözeltiyi bir pipetle karıştırın. Ardından karışıma 45 µL hücre dışı çözelti ekleyin ve vorteksleyin. Kısaca, 325 µL daha hücre dışı çözelti ekleyin ve tüpü üç dakika daha sonikasyona tabi tutun.

Sonikasyondan sonra, nihai kalsiyum indikatörü D yükleme çözeltisini elde etmek için 1,156 mililitre oksijenle doyurulmuş hücre dışı çözelti ekleyin. Koronal beyin kesitlerini, her kuyucuğa altı kesit gelecek şekilde, oksijenle doyurulmuş hücre dışı çözelti ile doldurulmuş altı kuyucuklu bir hücre kültürü plağına aktarın. Ardından, beyin kesitlerine zarar vermemeye dikkat ederek bölmelerdeki oksijenle doyurulmuş hücre dışı çözeltiyi aspire edin.

Ardından, her bir kuyucuğa doğrudan 750 µL kalsiyum indikatörü D yükleme çözeltisi pipetleyin. Beyin dilimleri, rore am içeren çözelti ile kaplanmış olmalıdır. Bundan sonra, dilimleri oksijen-karbondioksit hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de 45 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.

İnkubasyonun sonunda, hücrelerin aşırı yüklenmesini önlemek için kalsiyum indikatörü DI yükleme solüsyonunu taze oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyon ile değiştirin. Stimülasyon kaynaklı floresan sinyal değişimlerini izlemek için, fure red yüklü beyin dilimlerinden birini kayıt haznesine aktarın ve istediğiniz şekilde konumlandırın. Hazneyi konfokal mikroskop düzeneğine monte ettikten sonra, hücre dışı kalsiyum indikatörü boyasının fazlasını uzaklaştırmak için dilimi 10 dakika boyunca oksijenlendirilmiş hücre dışı solüsyon ile perfüze edin.

Kayıt haznesinden çıktıktan sonra, PERFUSE sekiz bir vakum şişesinde toplanır. Ardından, kesit mikroskop altında düşük büyütme ile incelenir. Kesitin yönü not edilir ve kesitteki ilgi alanı, bizim durumumuzda beyindeki hipotalamik bölge, bulunur.

Ardından, yüksek büyütmeye geçin. GFP görüntüleri toplayarak ve eş zamanlı olarak URA kırmızı sinyalinin floresan yoğunluğunu kontrol ederek kesitteki ilgili hücreyi bulun. Lazer gücünü, URA kırmızı floresan yoğunluğundaki değişimlerin ölçülmesine izin verecek ve iki floroforun ağarmasını önleyecek bir değere ayarlayın.

Ardından, fure ve GFP sinyallerini toplamak için 0,5 ila iki hertz arasındaki hızlarda görüntü almaya başlayın. Bu şekil, koronal beyin kesitindeki GN, RHR Tau GFP nöronlarının konfokal görüntüsünü göstermektedir. Bu, beyin kesiti fure am ile yüklendikten sonra gözlenen nispeten tekdüze floresan sinyaldir ve bu da kalsiyum indikatör boyası ile yüklenmiş nöronları gösteren birleştirilmiş görüntüdür.

Farklı hipotalamik beyin bölgelerindeki bireysel GFP etiketli nöronlardan elde edilen somatik uyaranla indüklenmiş kalsiyum yanıtı örnekleri burada sunulmuştur. Farklı hipotalamik çekirdeklerin GN RHR eksprese eden nöronları arasındaki belirgin kalsiyum sinyalleri, yöntem ustalaştıktan sonra, aynı süre zarfında belirli bir hücredeki toplam kalsiyum değişiminin bir tahmini olarak eğri altındaki alan kullanılarak karşılaştırılabilir. Bu teknik, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde, kalsiyum indikatör boyasının hazırlanması, yüklenmesi ve kesitlerin inkübasyonu dahil olmak üzere 90 dakikadan kısa sürede tamamlanabilir.