Hücre Özgül Analizi Arabidopsis Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

Bu prosedürün genel amacı, bir yapraktan hücre tipine özgü protoplastların bir popülasyonunu izole etmektir. Bu, yapraktaki belirli hücre tiplerinde GFP'yi eksprese eden ilk büyüyen bitkilerle gerçekleştirilir. İkinci adım, enzimatik bir sindirim kullanarak yaprakları hasat etmek ve protoplastlar üretmektir.

Daha sonra, protoplastlar floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması veya gerçekler kullanılarak filtrelenir ve sıralanır. Son adım, floresan mikroskobu kullanarak sıralamanın doğruluğunu onaylamaktır. Sonuç olarak, sıralanan protoplastlar, hücre tipine özgü gen ekspresyonunun analizi, proteomik analiz veya metabolik profil oluşturma için kullanılabilir.

Floresan aktif hücre sınıflandırması daha önce kökler için başarılı bir şekilde kullanılmıştır, ancak yaprak hücrelerini izole etmek için kullanılır. Bu yöntemden önce GFP ile etiketlenmiş, klorofil floresansından kaynaklanan girişim nedeniyle sınırlandırılmıştır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi hızlı olduğu kadar kritiktir, ancak hücre sıralaması sırasında meydana gelebilecek kapsamlı fizyolojik değişiklikleri en aza indirmek için dikkatli numune hazırlama çok önemlidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, hücre sıralayıcının nasıl kurulacağının veya doğru sıralamanın nasıl onaylanacağının farkında olmayacakları için mücadele edeceklerdir. Bu yöntem, bitki sistemleri biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Yaprak gibi karmaşık çok hücreli bir organda gen düzenleme ağlarının tanımlanmasıyla ilgili sorun, farklı hücre tiplerinin farklı gen gruplarını ifade etmesidir.

Bu genetik bilgi, bütün bir yaprağın hasat analizinde kaybolur ve prosedürü gösterir. Yanımda, laboratuvarımızda bu çalışma için teknik destek sağlayan Ellison As ve Sanjeev Kuma olacak. İlk olarak, dokuz santimetrelik yuvarlak bir Petri kabını, proto kaplama enzimleri ve transkripsiyonel ve RNA inhibitörleri içeren 20 mililitre A çözeltisi ile doldurun.

Ardından, burada gösterilen numune gibi birden fazla yaprak içeren numuneler için istenen yaprak materyalini hasat edin. Yaprakları 15 yapraklı bir yığına kadar düzenleyin. Ardından yaprakları bir milimetre genişliğinde şeritler halinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.

Yaprak şeritlerini bir çift düz cımbız kullanarak hemen Petri kabına aktarın, şeritleri nazikçe ayırın ve ardından numuneleri her seferinde beş dakika boyunca iki kez vakumla süzün. Daha sonra, Petri kabını oda sıcaklığında 90 RPM'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ve proto alçı numunelerini üç ila dört saat boyunca yerleştirin. Kuluçka sırasında, yaprak şeritlerini yarım saatlik aralıklarla birbirinden ayırmak için cımbız kullanın.

Sindirimden sonra, protoplast çözeltisini 70 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe yavaşça süzün. Yaprak şeritlerini çıkarmak için şeritler korunacaktır. Protoplastlar süzülecektir.

Şimdi yaprak şeritlerini nazikçe durulamak için dört mililitre A çözeltisi kullanın ve yıkamayı 50 mililitrelik tüpte toplayın. Daha sonra protoplast süspansiyonunu yuvarlak tabanlı tüplere aktarın ve protoplastları 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek, mümkün olduğu kadar sırtüstü yatağı nazikçe aspire edin ve ardından protoplastları aynı santrifüj koşulları altında beş mililitre çözelti A ile yıkayın.

Son olarak, sırtüstü natanı çıkardıktan sonra, sıralamadan hemen önce sıralama için PROTOPLASTLARI uygun bir çözelti A hacminde yeniden süspanse etmek için bir kesme P 1000 ucu kullanın. Protoplast çözeltisindeki kümeleri ayırmak için kesilmemiş bir P 1000 ucu kullanın. Protoplastları 50 mikronluk bir fillon filtreden bir kaynak tüpüne filtreleyerek hücreleri daha da ayırın.

Ardından, hücre kaynak nozülünün tıkanmasını önlemek için hücre çözeltisini uygun şekilde seyreltin. Optimum hücre tedarik koşullarını belirledikten sonra, 488 nanometre Argonne lazerli GFP pozitif Proto plus'ı tanımlayın ve 580 30 Bant geçiren filtreden gelen çıktıyı 530 40 bant geçiren filtreye karşı çıkarın. GFP pozitif protoplastların yüksek 530, düşük 580 popülasyonda ortaya çıkacağını unutmayın.

Düşük 530, düşük 580 popülasyonunda GFP olmayan Protoplastlar ile, ölü ölmekte olan protoplastlar ve döküntüler, sıralanan protoplastların floresan mikroskobu ile görselleştirilmesi için yüksek 580 popülasyonunda görünür, protoplastları doğrudan en az sekiz hacim çözelti A'ya sıralayın Konsantreyi ayırdıktan sonra, santrifüjleme protoplastları ile protoplastlar sekiz hacim çözelti A'ya ayrılabilir ve zenginleştirmeyi doğrulamak için bir floresan mikroskobunda görselleştirme için toplanabilir. Bu ilk görüntü, koruyucu hücrelerde GFP'yi ifade eden TP 382 hücre hattının zenginleştirilmesinin bir örneğini göstermektedir. Amplifikasyondan önce ve sonra bu yöntem kullanılarak elde edilen verim örnekleri bu tabloda özetlenmiştir.

500 pikogram ile 50 nanogram arasında elde edilen miktarlar, ovation PICO WTA sistemi ile amplifikasyon ve ardından kantitatif PCR yeni nesil dizileme veya mikrodizi ile analiz için yeterlidir. Bu sonraki görüntü serisi, az önce açıklanan yöntemle izole edilmiş ve sıralanmış çeşitli protoplast hücre dizilerini göstermektedir. Bu ilk protoplastlar KC 2 74'ten türetilmiştir, geriye bir KC 2 74'ün enine bir kesiti kalır.

Yaprak, GFP'nin vaskülatürde eksprese edildiğini gösterir. Bu protoplastlar KC 4 64 yapraklarından izole edilmiştir ve bir KC 4 64 yaprağının enine kesiti, GFP ekspresyonunun A dal epidermisinde bulunduğunu göstermektedir. Son olarak, bu protoplastlar TP 3 82 yapraktaki TP 3 82 yapraklarından türetilmiştir.

GFP burada koruma hücrelerinde ifade edilir. 5 80 30 nanometre ile 5 30 40 nanometre bant geçiren filtrelerin çıktısını gösteren tipik faks alma nokta grafikleri gösterilir. Gösterilen sıralama kapısı, genellikle sıralama sırasında kullanılanlardır.

İnhibitörlerin yokluğunda sıvanmış kömür dört yapraklı protoplastların bu ilk durak grafiği, tek bir düşük 530, düşük 580 popülasyonu göstermektedir. Oysa vahşi tip kömürden elde edilen bu nokta grafiği, inhibitörlerin varlığında sıvanmış dört yapraklı protoplastlar proto, inhibitörlerin neden olduğu stres ve renklenme nedeniyle meydana gelen 580 floresanstaki kaymayı göstermektedir. Bu nokta grafikleri, sırasıyla KC yedi dört, KC 4 64 ve TP 3 82 çizgilerinden yapraktan türetilmiş protolastlardır.

Bu örnekler ayrıca, GFP'nin yüksek 530 düşük 580 popülasyonunda bulunduğunu gösteren inhibitörlerin varlığında da sıvandı. Bu temsilci için, önce her bir fraksiyon tipi için kantitatif PCR deney örnekleri elde edildi. Numuneler daha sonra ovation PICO WTA sistemi ve kantitatif PCR kullanılarak amplifiye edildi.

GFP'ye özgü primerler kullanılarak gerçekleştirildi. Gösterilen değerler kırmızıda en yüksek ve yeşilde en düşük olanlardır: Referans gen olarak aktin iki kullanan ortalama veya tek değerler yatay sarı çubuklarla gösterilir. Sonuçlar, sıralanmış fraksiyonlardaki GFP hücre içeriğinin optik değerlendirmelerinin yeniden doğrulanmasıdır.

Yüksek 530 ve düşük 580 nüfus, ölçülebilir en yüksek GFP ekspresyonu seviyelerini sergiledi. Yüksek 530 yüksek 580 popülasyonu yaklaşık 1000 kat daha düşük GFP ekspresyonu sergilerken, düşük 530, düşük 580 ve düşük 530 yüksek 580 popülasyonları, kontrol tam yaprak ve sınıflandırılmamış protoplast popülasyonlarınınkilerle karşılaştırılabilir düşük GFP ekspresyonu seviyeleri sergiledi Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse bitkiden sıralanmış hücre popülasyonuna kadar dört ila beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, sıralama doğruluğunu korumak için hücre sıralayıcıyı sürekli olarak izlemeyi ve gerekirse yeniden kalibre etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü buldum. Farklı hücre tiplerinde gen ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak ve karşılaştırmak için mikroışın analizi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Şimdi bu teknik geliştirildiğine göre, farklı gelişim aşamalarında belirli yaprak hücresi tiplerinde gen ekspresyonunu analiz ediyoruz ve bunu, agronomik projesinde üretilen tüm yapraktan elde edilen verilerle karşılaştıracağız.

Bu videoyu izledikten sonra, floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması kullanarak tek hücreli yaprak türlerinin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.