Name: Hücre Özgül Analizi Arabidopsis Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Öğrenin Arabidopsis yapraklarından floresan aktive hücre ayırma ile GFP eksprese eden hücre türüne özgü protoplast izolasyonu. Bu yöntem, bitki sistem biyolojisinde gen ifadesi analizi için sağlam bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hücre tipine ve gelişim evrelerine özgü profil üzerine Buchanan-Wollaston laboratuarında çalışma Avrupa Komisyonu 6. Çerçeve Programı&#39;nın en AGRON-omics projesi (hibe # LSHG-CT-2006-037704) tarafından desteklenmektedir. Hücre tipine özgü profil üzerine Gifford laboratuarda çalışmak bir BBSRC Yeni Araştırmacı hibe (BB/H019502/1) tarafından desteklenmektedir. KC274 ve KC464 Arabidopsis hatları AAR Webb (Cambridge University of) elde edilmiştir.

1. Protoplast Nesil <ol><li> Bir jilet ile 1 mm genişliğinde şeritler (Şekil 1) içine Hasat yaprak malzeme ve kesim. Için en fazla 15 yaprak, tek bir yaprak daha içeren örnekleri kolay kesim öncesinde yığılmış olabilir. </li><li> Derhal 20 ml solüsyon içeren bir 9 cm olan yuvarlak Petri kabı içine yaprak şerit aktarma A (400 mM, mannitol, 20 mM MES hidrat, 20 mM KCI, 10 mM CaCI2, 2 mM MgCl2,% 0.1 BSA, 2.5 mM β-merkaptoetanol, protoplasting enzimler (% 1.2 selüloz R-10,% 0.6 selüloz RS ve% 0,4 &#39;macerozyme R-10) ve RNase ve transkripsiyonel inhibitörleri (1 x ProtectRNA ve 10 ug / ml Aktinomisin D) içeren pH 5.7), yavaşça yaprak şeritler ayırmak ve 2 × 5 dk sızmak vakum. </li><li> Bir orbital çalkalayıcı üzerinde yer Petri tabağına 3-4 saat boyunca oda sıcaklığında ve protoplast 90 rpm&#39;ye ayarlayın. <ol><li> İnkübasyon sırasında, şeritler bir yaprak kullanılarak, her biri diğerinden ayrılması gerekiryarım saatlik aralıklarla, düz cımbız ayarlayın. </li></ol></li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde 70 mikron hücre süzgecinden (Fisher Scientific) yerleştirin ve yavaşça yoluyla protoplasting çözüm filtre. Bu protoplast geçmesi için izin verirken elek tarafından muhafaza edilecektir yaprak şeritler kaldıracaktır. </li><li> 4 ml solüsyon aynı elekten A ve hafifçe filtre ile yaprak şeritler yıkayın. </li><li> Yuvarlak dipli tüpler içine protoplast aktarın ve pelet protoplast 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de protoplast çözümü santrifüj. </li><li> Yavaşça protoplast bozmadan kadar süpernatant mümkün olduğunca kapalı aspire. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g 5 ml çözelti A ve protoplastlar santrifüj ile yıkanır. Süpernatantı </li><li> Pasteur pipeti veya cut-off P1000 ucunu kullanarak, çözelti A uygun bir hacim protoplast süspanse edin. </li></ol> 2. Yaprak protoplast FACS </p&gt; <ol><li> Hemen sıralama önce, birlikte topaklanma protoplast önlemek için bir (non-cut) P1000 ucu kullanarak protoplast tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 50 mikron filcon filtresi (BD Biosciences) ile bir sıralama tüp protoplast aktarın ve hücre sıralayıcı meme tıkanmasını önlemek için uygun sulandırmak. Protoplast 20 psi (kılıf) ve 21-21,5 psi (örnek), 39.2 kHz frekansta bir basınç ve &lt;4000 (bu ayarlar BD Akın hücre sıralayıcı üzerinde optimal bir olay hızında 100 mikron nozul kullanılarak sıralanır Diğer hücre sıralama makinelerinde (BD Biosciences). Optimizasyon bu ayarları için ayarlamalar) gerekebilir. </li><li> GFP pozitif protoplast bir 488 nm argon lazer kullanarak ve 580/30 bandpass (turuncu) vs 530/40 bandpass (yeşil) çıkışı komplo tanımlanır. GFP pozitif protoplast yüksek 580 popu içinde 530 düşük / düşük 580 nüfus ve ölü / ölmekte protoplast ve enkaz olmayan GFP protoplast sahip, yüksek 530/low 580 nüfus olacaklasyon (Şekil 2). <ol><li> RNA ekstre olacak olan protoplast ayırma zaman, protoplast bir indirgeyici madde ihtiva eden bir lizis tamponu en az 4 hacimde (örneğin, β-merkaptoetanol) doğrudan sıralanması. Buna ek olarak, tek bir örnek sıralama zamanı 20-30 dk, ve herhangi bir zamanda işlenmiş 2-3 numune maksimum sınırlı olmalıdır. </li><li> Kriteri protoplast görselleştirilmesi için, protoplast çözelti en az 8 birimleri A ve daha sonra konsantre protoplastlar için santrifüjleme ile toplanmış doğrudan sıralanması. </li></ol></li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokol, floresan aktive hücre tasnif (Şekil 1) için kullanılan Arabidopsis yaprağı, protoplast dan elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. RNase ve transkripsiyonel inhibitörlerinin varlığında Protoplast kuşak hücreleri f önlerrom bir transkripsiyonel yanıt montaj. Bu otofloresans önemli düzeyde birçok ölü ve ölmekte protoplast, doğuran bir sonucu var. Bu yöntem ile hazırlanan protoplast sıralama zaman sıralama için kullanılan 580 nm vs 530 nm floresan grafikleri birkaç farklı toplumlarda görmek için bu nedenle çok yaygındır. Birlikte bu protokolde kullanılan cinslere ayırma kapıları ile bu örnekler Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Protoplast çözüm A 8 cilt halinde sıralanır ve zenginleştirme doğrulamak için görselleştirme için toplanan. Şekil 2G bekçi hücreleri GFP ifade TP382 hattı kullanarak bu bir örnek gösteriyor olabilir. Önce ve amplifikasyon sonrası, bu yöntem kullanılarak elde edilen verimleri örnekleri arasında Tablo 1 &#39;de gösterilmektedir. Elde edilen miktarlar Ovation Pico WTA Sistem (500 pg-50 ng) ve bu nedenle s kullanılarak amplifikasyon için yeterlidirqPCR biri tarafından ubsequent analizi (Şekil 4), yeni nesil dizileme veya mikroarray. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> Şekil 1. Deney için genel iş akışı. 1) Hasat Arabidopsis satırı ifade eden bir GFP gelen ilgi bırakır. 2) Hızlı ~ 1 mm genişliğinde şeritler halinde kesilir ve hemen protoplasting Çözelti ve vakum sızmak içine bu transfer. 3) 3-4 saat süreyle inkübe edin. 4) 70 mikron elekten yavaşça süzülen protoplast çözümü, santrifüjle alt tüpleri ve pelet protoplast yuvarlak aktarmak. 5) Derhal sıralama önce, 50 mikron ile tekrar süspansiyon protoplast ve sıralama tüp transfer filtresi. 6) Sıralama GFP pozitif ve negatif GFP canlı protoplast. 7) protoplast şimdi ya görsel analiz veya qPCR, yeni nesil dizileme veya mikroarray gibi teknikler kullanılarak yapılabilir. Şekil 2. Bu çalışmada kullanılan KC464, KC274 ve TP382 hatları. Adaxial epidermiste GFP gösteren bir KC464 yaprak A) enine kesit. B) protoplast KC464 yapraklarından elde edilen. Vaskülatürde GFP tanımı gösteren bir KC274 yaprak C) enine kesit. D KC274 yapraklarından elde edilen) protoplast. E) TP382 yaprak koruma hücrelerde GFP tanımı göstermektedir. F) protoplast TP382 yapraklarından elde edilen. TP382 yapraklarından elde edilen protoplastlar yüksek 530/low 580 popülasyonundan protoplast içeren GFP gösteren yaprak hücrelerin kompleks arka koruma hücre ifade GFP FACS ile elde zenginleştirme G) Örnek. AF: Konfokal mikroskop görüntüleri, G: Floresans mikroskop görüntüsü. Görüntülerdeki Ölçek çubukları 50 mm&#39;dir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> Şekil 3. 580/30 nm (turuncu) vs 530/40 nm (yeşil) bant geçiren filtreler (BD Akın hücre sıralayıcı) çıktısı tipik FACS edinimi nokta araziler. Gösterilen ayırma kapıları tipik olarak eleme sırasında kullanılan olanlardır. Bir düşük 530/low 580 nüfus gösteren inhibitörleri yokluğunda protoplasted Col-4 yaprak elde protoplast, A) Dot arsa. Nedeniyle inhibitörleri tarafından gerilme ve boyama için 580 floresan bir değişim gösteren inhibitörlerinin varlığında protoplasted ağırlıkça Col-4 yaprak elde protoplast, B) Dot arsa. Yüksek 530/low 580 popülasyonlarında popülasyonlarının içeren GFP gösteren inhibitörlerinin varlığında protoplasted sırasıyla KC74, KC464 ve TP382 hatları, gelen yaprak edilen protoplast dan CE) Dot araziler. GFP (yüksek 530/low 580) toplumlarda olayların yüzdeleri verilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> Şekil 4,. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi temsil eden kapı popülasyon fraksiyonu olarak GFP tanımı. Çoğaltır iki biyolojik sonra yapıldı GFP-özgü primerler (Tablo 2) ile Ovation Pico WTA sistemi ve qPCR kullanılarak amplifiye, her fraksiyonda tipi için elde edilmiştir. Gösterilen değerler yüksek (kırmızı), düşük (yeşil) ve ortalama bağıl değerlerdir. Yüksek 580 nüfusu ikiye bölünmüş durumda idi, düşük 530/low 580 ve tek bir biyolojik çoğaltmak yalnızca tek bir değer gösterilir böylece kullanıldığı için yüksek 530/low 580,. ACT2 (At3g18780) tüm örnekler için standart olarak kullanılmıştır. Yaprak: Tüm yaprak. Unsorted: Unsorted protoplast. GFP1: Yüksek 530/low 580 ve Rest1: düşük 530/low 580, GFP2: Yüksek 530/high 580 ve Rest2: Şekil 3 ve insert açıklanan düşük 530/high 580,. Sonuçlar bir doğrulama o vardırkriteri fraksiyonları (örneğin Şekil 2G) GFP hücre içeriğinin f optik değerlendirmeler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> Yaprakların sayısı </td><td> Hücre sayısı </td><td> Verim RNA (Ng) </td><td> Verim RNA (Güçlendirilmiş; ng) </td></tr><tr><td> Tüm yaprak A Tüm yaprak B </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td> Unsorted protoplast A Unsorted protoplast B </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152 *** 3321 *** </td></tr><tr><td> GFP1 A Rest1 A </td><td> 15 </td><td> 6039 (0.39% *) 55389 (6.40% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B Rest1 B </td><td> 15 </td><td> 10783 (% 0.63 *) 57.040 (7.49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 Rest2 </td><td> 15 </td><td> 18337 (% 1.49 *) 62.405 (% 73.49 *) </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Numuneler FACS ile toplandı ve canlı GFP-ifade eden protoplast ihtiva eden oranını belirlemek için qPCR ile analiz edilmiştir. Ayrıca Ovation Pico WTA Sistemi (NuGen) ile amplifikasyon önce ve sonra ng toplam RNA&#39;dan verim bu tabloya dahil edilmiştir. GFP1, GFP2, Rest1 ve Rest2 fraksiyonlar, Şekil 4&#39;te elemanı gösterilmiştir. Toplam hücre tür çalışma hücrelerinin * yüzdesi fraksiyonu içinde hücrelerin sayısı yanında parantez içinde verilmektedir. Bu yüzdeler arasında ilişki bulunmamaktadırFACS sıralama &#39;Rest&#39; kesirler için çalışır gibi her bir örnek için birbirlerine daha önce alınan istirahat hücreleri daha fazla sayıda nedeniyle GFP kesirler için daha durdu. Üreticinin protokole göre amplifikasyon reaksiyonları için girdi olarak kullanılan ** 50 ng. <table border="1"><tbody><tr><td> Astar boya </td><td> Sıra </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> Tablo 2. QPCR astar.

<ol><li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves%3A+A+Critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li>
<li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).</li>
<li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li>
<li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
<li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li>
<li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li>
<li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it%27s+potential+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6(2008).</li>
<li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz protoplast nesil ve FACS kullanan sonraki hücre sıralama için yapraklarda GFP ifade Arabidopsis bitkilerin kullanımına izin veren bir yöntem tarif var. Bu yöntem, qPCR veya mikroarray ya tarafından amplifikasyon ve bu yüzden bir sonraki analiz için kullanılacak olan RNA, yeterli miktarlarda elde edilir. Kriteri fraksiyonlar son derece olarak qPCR (Şekil 2) ile gösterilen GFP-içeren hücreler için zenginleştirilmiştir. Yaprak şeritler inhibitörü içeren protoplast solüsyonu ile infiltre vakum olmuştur kadar canlı protoplast yüksek verimi elde etmek için bu prosedürün ilk adımları sırasında hızla çalışmak önemlidir. Buna ek olarak, 1 mm yaprak şerit üretirken, bu aşırı hasar ve bu nedenle daha düşük bir protoplast verim neden olarak, yapraklar yerine &quot;kesme&quot; püre ya da bunların dilim veya kesim için çok önemlidir. Yöntemi arasındaki kritik fark burada ve diğer publishe tarifd yöntem RNase inhibitörleri ve transkripsiyonel inhibitörlerinin kullanımı. Çoğu yöntemleri protoplast daha kolay elde edilebilir hangi Arabidopsis kökleri için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, mezofil hariç, yaprakları ile çalışma zaman, protoplast üretim süresini artırmak için gereklidir. Bu nedenle, protoplast kuşak tedavinin kendisi (veriler gösterilmemiştir) bir sonucu olarak gen ekspresyonu değişikliklere karşı korumak için bu inhibitörleri dahil etmek önemlidir. Ancak, inhibitörlerin varlığı bu stresinden karşı hangi ile plastisite kaybına neden olarak protoplast daha savunmasız yapmak olasıdır kapalı genlerin veya geçiş yoluyla, bir transkripsiyon yanıt monte için bir yetersizlik yol açar prosedürü protoplasting. Biz, GFP-ifade eden Arabidopsis hatları bir dizi ile başarılı bir şekilde burada tarif edilen yöntem kullanılmıştır. Önemlisi, biz GFP hatları ya kuvvetli GFP ifade ile bu yöntemi kullanmışçekirdek, ya da çok daha zayıf bir non-localized/diffuse sitosolik bir şekilde, burada kullanılan KC464 ve KC274 hatları ile bir durumdur. Hatları Her iki tip yöntem ile uyumlu olan ve GFP-ifade eden protoplast arasında yüksek oranda zenginleştirilmiş fraksiyon için (Şekil 2 ve 3) elde edildi. Fluorofor ölü / ölüm hücreleri otofloresans canlı hücreleri seçmek için yeteneğimizi korumak amacıyla önemli ölçüde farklı olduğu floresans seçilmelidir rağmen metod, diğer floroforlar adapte olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Selülaz R-10 </td><td> Melford </td><td> C8001 </td></tr><tr><td> Selülaz RS </td><td> Melford </td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td> Melford </td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7397 </td></tr><tr><td> Aktinomisin D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70 mikron hücre süzgecinden </td><td> Balıkçı </td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50 mikron filcon kâse tipi filtreler </td><td> BD Biosciences </td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

hücre Özgül analizi<em&gt; arabidopsis</em&gt; floresans aktif hücre ayırma kullanma leaves

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Yaprak primordium&#39;un başlangıcından sonra, biyomas birikim esas olarak hücre çoğalması ve yaprak 1 genişleme tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, Arabidopsis yaprağı çok farklı hücre tipleri ve çeşitli yapılar oluşan bir kompleks bir organdır. Aynı zamanda, büyüyen yaprak genişleyen durdurmak ve yaşlanması 1. geçmesi için ilk olmanın sapı en uzak hücreler, farklı gelişim aşamalarında hücreler içerir. Yaprağın içinde farklı hücreler bu nedenle bölünmesi uzayarak veya ayırıyoruz; aktif stresli veya ölü ve / veya herhangi bir zamanda kendi hücresel tip alt setleri uyaranlara yanıt. Bu yaprak zorlu genomik araştırma yapar: örneğin farklı hücresel yanıt bölgeler veya hücre tiplerinde faaliyet genetik ağların bütün yaprakları, sinyallerinden ifade verileri analiz ederken şaşırmış olacak, üretilen yanlış bir profil elde edilir. Bu adres için, several yöntemler hücre spesifik gen ifadesi çalışmalar imkan veren tarif edilmiştir. Bu lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) 2 veya protoplast nesil ve sonraki floresan aktive hücre sıralama (FACS) 3,4, nükleer yağış 5 ve polysomes 6 immünopresipitasyon için son açıklanan INTACT sistemi için kullanılan GFP ifade bitkileri bulunmaktadır. FACS başarılı bir şekilde kök ucu hücre kimlik ve mesafe 3,7 genlerin büyük bir sayısını ifade profilleri üzerinde önemli bir etkisi olduğunu gösteren da dahil olmak üzere bir dizi çalışma için kullanıldı. GFP hatlarının FACS da kök azot yanıtları ve lateral kök gelişimi 8, tuz stresine kök 10 9 oksin dağıtımı sırasında hücre spesifik transkripsiyonel düzenleme göstermek ve Arabidopsis sürgün apikal meristem 11 bir gen ekspresyonu harita oluşturmak için kullanılır olmuştur. RağmenFACS önce otofloresans 12,13 dayalı Arabidopsis yaprak elde protoplast sıralamak için kullanılır olmuştur, yapraklarda GFP ifade Arabidopsis hatlarında FACS kadar kullanımı 4 çok sınırlı olmuştur. Aşağıdaki protokol biz protoplast nesil rejiminin etkilerini en aza FACS uyumlu Arabidopsis Yaprak protoplast elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz vasküler doku 14 ve TP382 Arabidopsis doğrultusunda, ifade GFP çift GFP ifade adaxial epidermisin 14 KC274 doğrultusunda, ifade GFP bir nükleer lokalizasyon sinyal bağlantılı yapıtaşıdır KC464 Arabidopsis hattı kullanarak yöntem gösterilmektedir bekçi hücreleri (veriler gösterilmemiştir; Şekil 2). Şu anda, ihtiyarlık çeşitli evrelerinde her iki hücre tipi geliştirme ve stres esnasında spesifik ifade, hem de heterojen hücre popülasyonları incelemek için bu yöntemi kullanarak.

Üretmek için bir yöntem<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Belirli hücre popülasyonlarının çalışmaları için izin floresan aktive hücre sıralama (FACS) ile uyumlu yaprak protoplast. Bu yöntem, herhangi bir uyumlu<em&gt; Arabidopsis</emHücrelerinin bir alt kümesi olarak GFP ifade&gt; satırı.

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

Yaprak primordiumunun oluşumundan sonra, biyokütle birikimi temel olarak yapraklardaki hücre proliferasyonu ve genişlemesi tarafından kontrol edilir1. Ancak, ...

Bu prosedürün genel amacı, bir yapraktan hücre tipine özgü protoplast popülasyonu izole etmektir. Bu işlem, öncelikle yaprakta belirli hücre tiplerinde GFP eksprese eden bitkilerin yetiştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise yaprakların hasat edilmesi ve enzimatik sindirim kullanılarak protoplastların üretilmesidir.Ardından, protoplastlar floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama veya FACS kullanılarak filtrelenir ve ayrıştırılır. Son adım, ayıklamanın doğruluğunun floresan mikroskopi kullanılarak onaylanmasıdır. Nihayetinde, ayrıştırılan protoplastlar hücre tipine özgü gen ekspresyonu analizi, proteomik analiz veya metabolik profilleme için kullanılabilir.Floresan aktivasyonlu hücre ayıklama yöntemi daha önce kökler için başarıyla kullanılmıştır, ancak burada yaprak hücrelerinin izole edilmesi için kullanılmıştır. Bu yöntemden önce GFP ile işaretleme yapılması, klorofil floresanından kaynaklanan girişim nedeniyle sınırlı kalmıştır. Hücre ayıklama sırasında meydana gelebilecek kapsamlı fizyolojik değişiklikleri minimize etmek için hızlı ancak dikkatli örnek hazırlığı kritik olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterimi büyük önem taşımaktadır.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, hücre ayırıcıyı nasıl kuracaklarını veya doğru ayrıştırmayı nasıl onaylayacaklarını bilmedikleri için zorluk yaşayacaklardır. Bu yöntem, bitki sistem biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yaprak gibi karmaşık çok hücreli organlarda gen düzenleme ağlarını tanımlamanın önündeki sorun, farklı hücre tiplerinin farklı gen gruplarını eksprese etmesidir.Bu genetik bilgi, tüm yaprağın hasat analizinde kaybolur. Prosedür gösterilmektedir. Laboratuvarımızdaki bu çalışma için teknik destek sağlayan Ellison As ve Sanjeev Kuma da bana eşlik edecekler. İlk olarak, dokuz santimetrelik yuvarlak bir Petri kabını, proto plaklama enzimleri ile transkripsiyonel ve RNA inhibitörlerini içeren 20 mililitre çözelti A ile doldurun.Ardından, burada gösterilen örnek gibi tek bir yapraktan fazlasını içeren örnekler için istenen yaprak materyalini hasat edin. Yaprakları en fazla 15 yapraklık bir yığın halinde düzenleyin. Daha sonra, yaprakları bir milimetre genişliğinde şeritler halinde kesmek için bir jilet kullanın.Yaprak şeritlerini düz cımbız kullanarak hemen Petri kabına aktarın, şeritleri nazikçe ayırın ve ardından numuneleri her seferinde beş dakika olmak üzere iki kez vakumlu infiltrasyona tabi tutun. Ardından, Petri kabını oda sıcaklığında 90 RPM'e ayarlanmış orbital sallayıcıya yerleştirin ve protoplast numunelerini üç ila dört saat boyunca bekletin. İnkübasyon sırasında, yarım saatlik aralıklarla cımbız kullanarak yaprak şeritlerini birbirinden ayırın.Sindirimin ardından, protoplast çözeltisini 70 mikronluk bir hücre süzgeci aracılığıyla 50 mililitrelik bir tüpe nazikçe süzün. Yaprak şeritlerini uzaklaştırmak için şeritler süzgeçte tutulacak, protoplastlar ise süzgeçten geçecektir.Şimdi, yaprak şeritlerini nazikçe durulamak için dört mililitre solüsyon A kullanın ve yıkama sıvısını 50 mililitrelik tüpte toplayın. Ardından protoplast süspansiyonunu yuvarlak tabanlı tüplere aktarın ve protoplastları oda sıcaklığında, 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Pellete zarar vermemeye dikkat ederek, süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını nazikçe aspire edin ve ardından protoplastları aynı santrifüj koşulları altında beş mililitre solüsyon A ile yıkayın.Son olarak, üstte yüzen katmanı uzaklaştırdıktan sonra, sıralama işleminden hemen önce PROTOPLASTLARI uygun hacimdeki çözelti A içinde yeniden süspande etmek için ucu kesilmiş bir P 1000 pipet ucu kullanın. Protoplast çözeltisindeki topaklanmaları dağıtmak için ucu kesilmemiş bir P 1000 pipet ucu kullanın. Protoplastları 50 mikronluk bir fillon filtre aracılığıyla bir toplama tüpüne filtreleyerek hücreleri daha fazla ayrıştırın.Ardından, hücre kaynağı nozulunun tıkanmasını önlemek için hücre solüsyonunu uygun şekilde seyreltin. Optimal hücre kaynağı koşulları belirlendikten sonra, 580 30 bant geçiren filtreden gelen çıktıyı 530 40 bant geçiren filtre ile karşılaştırarak, 488 nanometre Argonne lazeri ile GFP pozitif protoplastları tanımlayın. GFP pozitif protoplastların, yüksek 530, düşük 580 popülasyonunda görüneceğini unutmayın.Düşük 530, düşük 580 popülasyonundaki GFP içermeyen protoplastlar ile birlikte, ölü ve ölmekte olan protoplastlar ve döküntüler, sıralanmış protoplastların floresan mikroskobuyla görüntülenmesi için yüksek 580 popülasyonunda görülür; sıralama sonrası protoplastları doğrudan en az sekiz hacim Çözelti A içerisine sıralayın, ardından protoplastları santrifüjle yoğunlaştırın. Protoplastlar sekiz hacim Çözelti A içerisine sıralanabilir ve zenginleştirmenin doğrulanması için floresan mikroskobunda görüntüleme amacıyla toplanabilir. Bu ilk görüntü, bekçi hücrelerinde GFP ekspres eden TP 382 hücre hattının zenginleştirilmesine dair bir örneği göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak amplifikasyon öncesi ve sonrası elde edilen verim örnekleri bu tabloda özetlenmiştir.500 picogram ile 50 nanogram arasında elde edilen miktarlar, ovation PICO WTA sistemi ile amplifikasyon ve ardından kantitatif PCR, yeni nesil dizileme veya mikroarray ile analiz için yeterlidir. Bu sonraki görüntü serisi, az önce açıklanan yöntemle izole edilen ve ayrıştırılan çeşitli protoplast hücre hatlarını göstermektedir. Bu ilk protoplastlar KC 2 74'ten türetilmiştir; KC 2 74'ün yapraklarından alınan bir enine kesittir.Yaprak, GFP'nin vasküler sistemde eksprese olduğunu göstermektedir. Bu protoplastlar KC 4 64 yapraklarından izole edilmiştir ve bir KC 4 64 yaprağının enine kesiti, GFP ekspresyonunun A dal epidermisinden tespit edildiğini göstermektedir. Son olarak, bu protoplastlar TP 3 82 yapraklarından türetilmiştir.Burada GFP, bekçi hücrelerinde eksprese edilmektedir. 580 ± 30 nanometreye karşı 530 ± 40 nanometre bant geçiren filtrelerden elde edilen çıktıyı gösteren tipik FACS kazanım nokta grafikleri sunulmuştur. Gösterilen ayıklama kapıları, ayıklama sırasında tipik olarak kullanılanlardır.İnhibitörlerin yokluğunda protoplastlara dönüştürülmüş coal four yaprağından türetilen protoplastların bu ilk nokta grafiği, tek bir düşük 530, düşük 580 popülasyonu göstermektedir. Buna karşın, inhibitörlerin varlığında protoplastlara dönüştürülmüş vahşi tip coal four yaprağından türetilen protoplastlara ait bu nokta grafiği, inhibitörlerin neden olduğu stres ve renklenmeye bağlı olarak 580 floresansında meydana gelen kaymayı göstermektedir. Bu nokta grafikleri sırasıyla KC seven four, KC 4 64 ve TP 3 82 hatlarından türetilen yaprak protoplastlarına aittir.Bu örnekler ayrıca, GFP'nin yüksek 530 düşük 580 popülasyonlarında yer aldığını gösteren inhibitörlerin varlığında ön işleme tabi tutulmuştur. Bu temsilî kantitatif PCR deneyi için öncelikle her fraksiyon tipi için örnekler elde edilmiştir. Örnekler daha sonra ovation PICO WTA sistemi ve kantitatif PCR kullanılarak amplifiye edilmiştir.GFP'ye özgü primerler kullanılarak işlem gerçekleştirildi. Gösterilen değerlerden en yüksekleri kırmızı ile, en düşükleri ise yeşil ile belirtilmiştir; actin two referans geni kullanılarak elde edilen ortalama veya tekil değerler yatay sarı çubuklarla gösterilmiştir. Sonuçlar, ayrıştırılmış fraksiyonlardaki GFP hücre içeriğinin optik değerlendirmelerinin yeniden doğrulanmasıdır.Yüksek 530 düşük 580 popülasyonu, ölçülebilen en yüksek GFP ekspresyon seviyelerini sergilemiştir. Yüksek 530 yüksek 580 popülasyonu yaklaşık 1000 kat daha düşük GFP ekspresyonu sergilerken; düşük 530 düşük 580 ve düşük 530 yüksek 580 popülasyonları, kontrol tüm yaprak ve ayrıştırılmamış protoplast popülasyonlarınkilerle karşılaştırılabilir düzeyde düşük GFP ekspresyon seviyeleri göstermiştir. Bu teknikten uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülürse bitkiden ayrıştırılmış hücre popülasyonuna kadar olan süreç dört ila beş saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, ayrıştırma doğruluğunu korumak adına hücre ayırıcının sürekli izlenmesi ve gerektiğinde yeniden kalibre edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedür bulundu. Farklı hücre tiplerindeki gen ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak ve farklılıklarını belirlemek için mikro-dizi analizi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik geliştirildiğine göre, artık farklı gelişim aşamalarındaki spesifik yaprak hücre tiplerinde gen ekspresyonunu analiz ediyoruz ve bunu agronomi projesinde üretilen tüm yaprağa ait verilerle karşılaştıracağız.Bu videoyu izledikten sonra, floresanla aktive edilen hücre ayırma yöntemi kullanılarak yaprakların tekil hücre tiplerinin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

cell-specific-analysis-arabidopsis-leaves-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki materyali belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılan bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu teknik, özellikle hücre tipleri, hücresel bölünmeler ve Floresans Aktif Hücre Sıralama floresan proteinleri ifade transgenik işaretleyici hatları kullanmaktadır. Ayrıca, büyüme kurulumu kolaylaştıran tedavisi burada...

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Biz perfluorodecalin infiltratif montaj aracı olarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu görüntüleme derinliğini artırmak için basit bir yöntem.

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Burada, bitki büyüme davranış ve özellikle fenotipleri tekrarlanabilir bir şekilde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Değişken ve aynı zaman istikrarlı ışık koşulları sağlamak için nasıl gösterir. Uygun analizleri yeterli örnek numaraları ve geçerli istatistiksel değerlendirme bağlıdır.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Floresan canlı görüntüleme Arabidopsis thaliana yaprakların uzun bir zaman aralığı içinde gerçekleştirmek için basit ve çok yönlü bir yöntemi bildirin. Biz bir transgenik Arabidopsis bitki bitki bağışıklık yanıtı kronolojik zamanmekansal anlayış kazanıyor için bir örnek olarak bir bağışıklık ile ilgili düzenleyici denetimi altındaki bir floresan muhabir gen ifade kullanın.

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

Öğrenin Arabidopsis yapraklarından floresan aktive hücre ayırma ile GFP eksprese eden hücre türüne özgü protoplast izolasyonu. Bu yöntem, bitki sistem biyolojisinde gen ifadesi analizi için sağlam bir yaklaşım sunar.

Hücre Özgül Analizi

Daha fazla video keşfet