Name: Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Öğrenin kondrositleri agaroz hidrojellerde dinamik mekanik basınç yüklemesiyle uygulamayı. Bu yöntem kollajen ve proteoglikan sentezi üzerindeki etkileri değerlendirerek kıkırdak metabolizmasını incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. İlköğretim Artiküler Kondositler İzolasyonu Hayvan eklemlerin eklem yüzeyleri Hasat 10-15 tam kalınlıkta kıkırdak dilimleri (yerel Elazığ elde iskelet yapısı olgun ineklerin metakarpal-falangeal eklem gibi). <ol><li> 37 °, 2 saat boyunca Ham F-12 (w / v)% 0.5 proteaz, 20 ml içinde bir 100 mm Petri kabı ile inkübe ° C. il kıkırdak dilimleri Ham F-12, kültür ortamı içinde üç kez çalkalayın,% 0.15 collagenase, 20 ml ile bir gece boyunca inkübe 37 Ham&#39;ın F-12 ° C&#39;de kültür ortamı içinde bir </li><li> Temiz bir tabak içine 200 mesh elek filtre yoluyla hücre süspansiyonu filtre. Ham F-12, 5 ml ile yıkanır ve filtre çanak ekleyin. 50 ml&#39;lik bir konik tüpe hücre süspansiyonu aktarın. Ham F-12 10 ml Petri kabı yıkayın ve konik boru ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 6-8 dakika için 600-800 RCF tüp santrifüjleyin. </li><li> Inci rahatsız etmemek sağlanması, süpernatant aspireE hücre pelet ve Ham F-12 kültür ortamı 40 ml yeniden askıya. </li><li> 6-8 dakika için 600-800 RCF tüp santrifüjleyin. </li><li> 3 kez toplam adımları 1.4 ve 1.5 iki kez daha tekrarlayın. Önce üçüncü kez santrifüj için, ajitasyon yoluyla pelet tekrar süspansiyon ve hücre sayımı için 500 ul kısım edinin. </li><li> Bir hemasitometre ve ters ışık mikroskobu ile Tripan mavi dışlama yöntemi kullanılarak 9 canlı hücreleri saymak. </li><li> Süpernatan aspire ve arzu edilen tohumlama yoğunluk ikiye katlamak için Ham&#39;ın F-12 ortamı bir hacim içinde pelet yeniden askıya (örneğin, 20 x 10 x 10 10 6 hücre / kapsülleme sonra, ml bir nihai konsantrasyon için 6 hücre / ml). </li></ol> 2. Kondrosit-agaroz Hidrojel Kapsülleme <ol><li> Isı 0.8 g otoklavlanmış Tip VII agaroz çözülmüş ° C &#39;ye kadar 120 için ayarlanmış bir sıcak plaka üzerinde steril 1x PBS (pH 7.4), 20 ml. Bir kez çözüldü ° C daha yüksek sıcaklıklar 60 ısı düşürmek will hücre canlılığını etkileyebilir. </li><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde, iyice agaroz (bir son% 2 agaroz hidrojel için örneğin% 4 agaroz süspansiyon) bir çift istenen konsantrasyonuna sahip hücre süspansiyonu eşit hacimde ilave edilir. Onlar hücre canlılığı etkilemez ve yorulma ömrü inşa edebilirsiniz gibi büyük baloncuklar oluşturma kaçının. </li><li> Dikkatlice kısım 10, 60 mm çaplı Petri kabı içine kondrosit-agaroz karışımı ml, büyük baloncuklar oluşturma kaçınarak. </li><li> Jel kadar oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. </li><li> Birçok kondrosit-agaroz hidrojel örnekleri olarak 4 mm biyopsi yumruk kullanarak (genellikle 20-30) gerektiği gibi edinin. </li><li> Bir mikrometre kullanarak temsili numuneler fiziksel boyutları (çap ve yükseklik) ölçün ve kaydedin. Oluşumlar örnek yükseklik farkı% 2 den daha büyük olan bir bölgede elde edilen herhangi bir numune atmak, boyuna yaklaşık 5 mm olmalıdır. </li><li> Taze bir 60 mm Petri kabı ve takviyesi için örnekler aktarıntam kültür ortamı 10 mL (20 mM HEPES, 100 ug / ml askorbik asit, ve 2 x antibiyotik / antimikotik ile Ham&#39;ın F-12 ortamı içinde kültür örneğin,% 20 fetal inek serumu) ile. </li></ol> 3. Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik uyarılması ve radyoaktif <ol><li> Sıkıştırma teçhizat metalik bileşenler otoklavlayınız. % 70 etanol (gece boyunca) ve UV ışığı (en az 15 dakika boyunca) ile plastik bileşenler sterilize edin. </li><li> 24 kuyu kültür plaka kuyu içinde yer 12 steril plastik tutma halkaları (yapı çapından daha büyük iç çapa sahip) (n = 6, örnekleri ve kontroller), üzerine düşen forseps kullanarak yapıları tutmak için. </li><li> Forseps kullanarak, dikkatli bir emniyet halkası her biri emniyet, Petri çanak 24-plaka için kondrosit-agaroz hidrojeller aktarın. </li><li> Tam kültür ortamı 400 ul (örneğin% 20, 20 mM Hepes, 100 ug / ml askorbik asit ile Ham&#39;ın F-12 ortamı içinde kültür FBS, ve aktarmaSıra her bir örnek için) antibiyotik / antimikotik 2x. </li><li> Sterilize sıkıştırma kulesi (Şekil 1) takın ve vida seti merdaneler sabitleyin. 24 oyuklu kültür plakasına sıkıştırma teçhizat takın. </li><li> Merdane-hidrojel kontakt (sıfır gerilme durumu) kurmak için ayar vidalarını gevşetin ve tekrar sabitleyin. </li><li> Bir Mach-1 Mikromekanik Test Sistemi içine monte sıkıştırma kulesi yükleyin. Ayar vidası ile yer bulma pin ve kilidi ile dikey sahneye Güvenli kulesi. Aralık jig çıkarın. </li><li> Frekansı (örneğin 1 Hz) ve süresi veya devir sayısı (60 dk örneğin zaman aralıklarında kadar), istenen genlik (örneklerin orijinal yüksekliği esas örneğin% 10 gerinim genliği) dinamik basınç yükleme uygulayın. </li><li> Mekanik stimülasyon tamamlanmasıyla, aralık jig yerini bulma pin seti vidasını gevşetin ve Mach-1 Mikromekanik Test Sistemi sıkıştırma teçhizat ve kültür plakasını çıkarın. </li&gt; <li> Radiolabel hücre-hidrojeli arzu edilen izotop (kondrosit-özgü kolajen sentezi ve [35S]-kükürt proteoglikan sentezi için örneğin, [3 H]-prolin protein etiket) 5 μCi ile ortam ile takviye yapıları. </li><li> 37. az 24 saat süre ile radyo işaretlenmiş yapıların inkübe ° C,% 5 2 10 CO. </li><li> Radyoaktif işaretli hidrojel yapıları hasat etmek ve herhangi bir adi izotop kaldırmak için 1 x PBS (pH 7.4) içinde 3 kez yıkayın. Papain (20 mM amonyum asetat içinde 40 mg / ml, 65 mM 1 ethyldiaminetetraacetic asit ve 2 mM ditiotreitol ° C&#39;de 72 saat süre ile) kullanılarak Digest örnekleri. </li><li> PicoGreen boya deneyi 11 ve anonim izotop aktivite, 12,13 hemen aşağıdaki papain sindirim sayma β-sıvı sintilasyon ile, DNA içeriği normalize kullanarak DNA içeriği Testi özet. </li></ol> Not: radyoaktif maddelerin alım ve atıkları (atık izotoplar ve ürüntemas radyoaktif maddeler haline gelmiş olabilir) (ve / veya hükümet) politikalarını ve radyoaktif maddelerin güvenli kullanımı ve imhası için prosedürler ilgili kurumsal izlemeniz gerekir. 4. Temsilcisi Sonuçlar Sığır artiküler kondrosit-agaroz hidrojellerin yapıları (10 x 10 6 hücre / ml kapsüllü hücreleri ile% 2 agaroz) mekanik 20 ila 60 dakika (veya 1,200 3,600 devir için 1 Hz frekansında% 10 basınç gerilme bir genlikte uyarıldı ) ve radyoizotop kuruluş tarafından DNA içeriği ve ekstrasellüler matriks sentezini için tahlil. DNA sentezinin ve hücre dışı matriks doza bağımlı bir şekilde etkilenmiştir. Uyarım 60 dakika (Şekil 2) hiçbir etki göstermiştir, oysa DNA içeriği, uyarım 20 ya da 30 dakika (p &lt;0.01) bir sonucu olarak önemli bir% 35 azalma sergiledi. Kıkırdak-özgü kollajen ve proteoglikan sentezi ([3H]-prolin ve tarafından belirlenirSırasıyla, [35S]-kükürt birleşme), gözlenebilir bir etki sergileyen uyarım 60 dk (Şekil 3) ile birlikte uyarım 20 ya da 30 dakika (p &lt;0.01) cevap olarak yaklaşık% 60 arasında önemli bir artış göstermiştir. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> . Kondrosit-agaroz yapıları teşvik etmek için özel olarak oluşturulmuş bir dinamik kompresyon kulesi Şekil 1 şematik Sol:. Montajlı kulesi Sağ:. Bireysel bileşenleri gösteren görünüm patlamış. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Kondrosit-agaroz DNA içeriğinin Şekil 2. Değişiklikler mekanik olarak 20-60 dakika için 1 Hz,% 10 kompresif gerginlik genlik (ortalama ± SEM, n = 6/group ortalama) altında uyarılan hidrojellerin. Kondrosit-agaroz ekstrasellüler matriks sentezi (kolajen ve proteoglikanlar) Şekil 3. Değişiklikler mekanik 20 ila 60 dakika (± SEM, n = 6/group demek) için 1 Hz&#39;de% 10 basınç gerilme genliği altında uyarılmış hidrojellerin.

<ol><li>Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+remodeling+in+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+articular+cartilage+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of articular cartilage in health and disease.</a> Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).</li>
<li>Neu, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+of+functional+biotribology+and+regenerative+medicine+in+synovial+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).</li>
<li>Demarteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+cartilage+constructs+engineered+from+expanded+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+compressive+stimulation+improves+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).</li>
<li>Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+chondrocyte-seeded+fibrin+gels%3A+effects+on+matrix+accumulation+and+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).</li>
<li>Buschmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte%2Fagarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).</li>
<li>Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+alters+proteoglycan+deposition+and+matrix+deformation+around+individual+cells+in+cartilage+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants.</a> Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cartilage+matrix+by+mammalian+chondrocytes+in+vitro.+I.+Isolation%2C+culture+characteristics%2C+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology.</a> The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).</li>
<li>Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+chondrocytes+embedded+in+3D+constructs%3A+in+vitro+methods+for+assessment+of+morphological+and+metabolic+response+to+compressive+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain.</a> Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).</li>
<li>McGowan, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+quantification+of+DNA+in+human+articular+and+septal+cartilage+using+PicoGreen+and+Hoechst+33258%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).</li>
<li>Fan, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intermittent+static+biaxial+tensile+strains+on+tissue+engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage.</a> Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).</li>
<li>Kaupp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+vibrations+increase+the+proliferation+of+articular+chondrocytes+in+high-density+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%3A+Journal+of+Engineering+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+shear+deformation+improves+the+quality+of+cartilaginous+tissue+formed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+application+of+cyclic+loading+can+accelerate+matrix+deposition+and+enhance+the+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).</li>
<li>Kisiday, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dynamic+compressive+loading+on+chondrocyte+biosynthesis+in+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds.</a> Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).</li>
<li>Chowdhury, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+chondrocyte+metabolism+in+agarose+constructs+subjected+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Hücre-seeded agaroz hidrojeller için kontrollü mekanik uyaranlara uygulamak için açıklanan yönteme kondrosit metabolizması üzerinde dinamik basınç kuvvetlerinin etkileri içine doğrudan soruşturma için izin verir. Istinat halkalar ile birlikte özel test teçhizat kullanımı örnek devrilme potansiyel sorunları önlemek için yapıları için yanal kısıtlaması sağlanır. Setleri ekipleri tarafından güvenli ölü ağırlıklı yükleme plakaları kullanımı örnek yüksekliği potansiyel farklılıklara rağmen yapıları ile doğrudan temas s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif veya ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz A </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbat </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiyotikler / antimikotik </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada Ltd </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripan mavisi </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> Reichert Bright-Line Hemasitometre </td><td> Hausser Bilimsel </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Papaya lateks Papain </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> Amonyum Asetat </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyldiaminetetraacetic Asit </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-ditiyotretol </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük Erime Noktası Agaroz, Tip VII </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Mesh Ekran (200) Filtre </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> Mach-1 Mikromekanik Tester </td><td> Biomomentum A.Ş. </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> Sıkıştırma Yükleniyor Jig </td><td> Sipariş üzerine yapılmış </td><td></td><td> Benzer ürün Biomomentum A.Ş. tarafından temin edilebilir </td></tr><tr><td> Falcon 24 Şey Kültür Plakalı </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β-sıvı sintilasyon sayacı </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] prolin </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] Kükürt </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

kondrosit-agaroz hidrojeller mekanik stimülasyonu

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Mekanik hakaret veya osteoartrit gibi hastalıklar, tarafından bozulmuş hasar olduğunda Eklem kıkırdağı sınırlı bir tamir kapasitesi muzdarip. Bu eksikliği gidermek için, çeşitli tıbbi müdahaleler geliştirilmiştir. Böyle bir yöntem doku mühendisliği kıkırdak hasarlı bölgeye yeniden su yüzüne olduğunu, ancak mühendislik dokusu genellikle uzun vadeli beka sorgulayan, yerli kıkırdak biyokimyasal özellikleri ve dayanıklılık yoksun. Bu implant materyali korumak için çevre doku dayanarak, küçük odak hasarlarının onarımı için kıkırdak doku mühendisliği uygulaması sınırlar. Gelişmiş doku özelliklerini geliştirmek için, mekanik uyarı kıkırdak ekstraselüler matriksin sentezini gibi mühendislik dokusunun çıkan mekanik özelliklerini arttırmak için kullanılan bir popüler bir yöntemdir. Mekanik stimülasyon dokuya güçleri geçerlidir in vivo bu deneyimli benzer oluşturur. Bumekanik ortamı, kısmen doğal doku 1,2 geliştirme ve bakım düzenler fikrine dayanmaktadır. Kıkırdak doku mühendisliği mekanik stimülasyon en sık uygulanan biçimi 1 Hz 1,3 bir frekansta yaklaşık% 5-20 fizyolojik suşları dinamik sıkıştırma. Çeşitli çalışmalarda, dinamik sıkıştırma etkilerini araştırmış ve sonuçta geliştirilen doku 4-8 fonksiyonel özelliklerini etkileyen, kondrosit metabolizması ve biyosentezi üzerinde olumlu bir etkisi olduğu gösterilmiştir. Bu yazıda, mekanik dinamik basınç altında kondrosit-agaroz hidrojel yapıları canlandırmak ve biyokimyasal ve radyoizotop testleri aracılığıyla biyosentezi değişiklikleri analiz yöntemini göstermek. Bu yöntem aynı zamanda kolayca mekanik uyarılara bir sonucu olarak hücresel tepki olarak herhangi bir potansiyel olarak bağlı değişikliklerin değerlendirilmesi için modifiye edilebilir.

Kondrositler tarafından kıkırdak ekstraselüler matriks biyosentezi mekanik uyaranlara uygulama etkilenebilir. Bu yöntem, 3D yapıları ve kondrosit metabolizması bağlı değişikliklerin değerlendirilmesi kapsüllü kondrositler dinamik basınç suşların uygulama tekniği anlatılmaktadır.

Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu

Eklem kıkırdağı, mekanik travma ile hasar gördüğünde veya osteoartrit gibi hastalıklar nedeniyle degrade olduğunda sınırlı bir onarım kapasitesine sahiptir. Bunu gidermek için...

Bu prosedürün genel amacı, hücre ekilmiş hidrojellere dinamik mekanik kompresif yükleme uygulamaktır. Bunu gerçekleştirmek için, kıkırdak dilimlerinin diseksiyonu ve enzimatik sindirimi yoluyla primer hücreler elde edilir. İzole edilen hücreler %2'lik bir agros hidrojeli içine kapsüllenir ve biyopsi pançı kullanılarak hücre ekilmiş konstrüktler oluşturulur.Numuneler daha sonra basma yükleme düzeneğine yerleştirilir ve bir mach one mikro mekanik stimülatöre yüklenir. Kolajen ve proteoglikan sentezini değerlendirmek için hücre ekilmiş konstrüktlere dinamik basma yüklemesi uygulanır. Konstrüktler, inkübasyon sonrası inklüzyonun ardından radyolojik olarak işaretlenir.İzotoplar, elde edilen verilerin sintilasyon sayımıyla belirlenmesi ve DNA'ya normalize edilmesiyle nicelendirilir. İçerik, mekanik stimülasyonun ardından hücre dışı matris sentezindeki değişiklikleri göstermektedir. Bu yöntem, karşı saha yanıtı ve mekanik stimülasyon hakkında bilgi sağlayabilir.Bu yöntem ayrıca kök hücreler, diğer bağ dokuları veya mekanoreseptör hücreler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Burada kullanılan iskeletsel olarak olgunlaşmış sığırlardan alınan metakarpofalangeal eklemler, steril bir diseksiyon alanında çalışan yerel bir mezbahadan temin edilmiştir. Laminar akışlı kabinde, kıkırdak dilimlerini %0,5 proteaz içeren 20 ml hams, F 12 içeren 100 mm çapında bir Petri kabına yerleştirin ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.İnkübasyon vakumunun ardından, proteaz solüsyonunu aspire edin ve hams. F 12 kültür ortamı ekleyerek dilimleri nazikçe çalkalayıp ardından aspire ederek durulayın. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın; üçüncü yıkamadan sonra kültür ortamını vakumla aspire edin.%0,15 kollajenaz A içeren 20 mililitre hams F 12 ekleyin ve kapları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücre süspansiyonunu temiz bir Petri kabına 200 mesh ekran filtresinden geçirerek pipetleyin; filtreyi yıkamak için beş mililitre daha hams F 12 pipetleyin ve süzüntüyü aynı kapta toplayın. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Petri kabını 10 mililitre hams F 12 ile yıkayın. Ardından yıkama solüsyonunu konik tüpe ekleyin. Tüpü oda sıcaklığında, 600 ila 800 RCF'de altı ila sekiz dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işlemi tamamlandığında, hücre peletini dağıtmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin. Peleti 40 milliliters kültür ortamında yeniden süspanse edin. Tüpü 600 ila 800 RCF'de altı ila sekiz dakika boyunca santrifüjleyin.Üçüncü santrifüjden önce aspirasyon, resüspansiyon ve santrifüj işlemini toplam üç kez olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın. Palatı ajitasyonla resüspande edin ve hücre sayımı için 500 µL'lik bir alikot alın. Üçüncü santrifüj sırasında, alikottaki canlı hücreleri trypan blue dışlama yöntemiyle saymak için bir hemositometre ve ters ışık mikroskobu kullanın.Hücre sayısı belirlenip üçüncü santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, süpernatantı aspire edin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Peleti, istenen ekim yoğunluğunun iki katı hacmindeki kültür ortamı içinde süspanse edin. Burada kondrositler, mililitre başına 20 × 10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edilir.Prosedürün bir sonraki adımı, izole edilmiş primer eklem kondrositlerini bir aros hidrojeli içine hapsetmektir; bir beher içinde 0,8 gram aros'u 20 mililitre steril PBS içerisinde süspande edin. Aros çözünür çözünmez beheri 120 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin.Isıyı 50 mililitrelik konik bir tüp içerisinde 60 °C'ye düşürün. Hücre süspansiyonunun eşit hacmini, ısıtılmış agro çözeltisinin istenen konsantrasyonunun iki katı ile birleştirin. Burada, son %2 Agro hidrojeli elde etmek için beş mililitre hücre süspansiyonuna beş mililitre %4 agro süspansiyonu eklenir; hücre canlılığını etkileyebilecek büyük hava kabarcıkları oluşmasını önleyerek pipetleme yoluyla iyice karıştırın.Ardından, kondrosit agar karışımının 10 mililitresini dikkatlice 60 milimetre çapında bir Petri kabına aktarın. Bu aşamada tekrar büyük hava kabarcıkları oluşmamasına özen gösterin. Kabı kapağıyla kapatın.Ardından karışımı oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Karışım katılaştıktan sonra, mümkün olduğunca çok kondrosit agros hidrojel örneği elde etmek için dört milimetrelik bir biyopsi punch'ı kullanın. Bu miktar genellikle 20 ila 30 arasındadır.Örnekleri, bir mikrometre ölçer kullanarak temiz bir Petri kabına yerleştirin ve her bir örneğin çapını ve yüksekliğini kaydedin. İdeal olarak, konstrükt yaklaşık beş milimetre yüksekliğinde olmalıdır; örnek yüksekliğinin %2'den fazla olduğu bölgeden elde edilen tüm örnekleri atın. Örnekleri, 10 milimetre komple besiyeri içeren taze 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Protokolün bu bölümünde, hücre yerleştirilmiş konstrüktler dinamik kompresyon ile mekanik olarak stimüle edilecektir.Bu işlem, konstrükt yükleme PLA'larını bir sahte mikro mekanik sisteme mekanik olarak bağlayan ve konstrüktlere uygulanan kompresyon miktarını kontrol eden, özel tasarlanmış bir kompresyon düzeneği kullanılarak gerçekleştirilecektir. Prosedürün en zor kısmı, numunelerin kompresyon düzeneğine yerleştirilmesidir. Dinamik kompresif yüklemenin uygun şekilde uygulandığından emin olmak için düzenekteki plakaların doğru şekilde ayarlanması önemlidir.Kullanmadan önce, kompresyon düzeneğinin metalik bileşenlerini bir otoklavda sterilize edin. Plastik bileşenleri gece boyunca %70 etanol ve en az 15 dakika UV ışığı ile sterilize edin. Kondrosit aros hidrojel yapıların devrilmesini önlemek için.12 adet steril plastik tutucu halkayı bir pens yardımıyla 24 kuyucuklu kültür plağının kuyucuklarına yerleştirin. Tutucu halkaların iç çapları, konstrükt çaplarından daha büyük olmalıdır. Pens kullanırken dikkatli olun.Kondro aros hidrojellerini Petri kabından 24 kuyucuklu plakaya aktarın ve her birini bir tutucu halka ile sabitleyin. Her örneğe 400 microliters tam besiyeri ekleyin. Ardından sterilize edilmiş kompresyon düzeneğini kurun ve set vidalarını kullanarak PLA'ları sabitleyin.Hidrojel temas salınımını oluşturmak için sıkıştırma düzeneğini 24 kuyucuklu kültür plakasına sabitleyin ve tekrar sıkılaştırın. Set vidaları yapı deformasyonu, bu yüksüz referans durumuna veya sıfır gerinim durumuna uygulanacaktır. Montajı tamamlanmış sıkıştırma düzeneğini, konumlandırma pimi ile birlikte bir Mach one mikro mekanik test sistemine yerleştirin.Düzeneneği dikey sahneye sabitleyin ve ardından bir set vidası kullanarak yerine kilitleyin. Ara mesafe aparatını çıkarın. Frekansı 1 Hz, genliği 350 µm ve döngü sayısını 1.200 olarak ayarlamak için Mach One yazılım arayüzünü kullanın.Bu işlem, numunelerin orijinal yüksekliğine bağlı olarak %10 gerinim genliğinde dinamik basma yüklemesi uygular. Mekanik stimülasyonu başlatmak için başlat düğmesine basın, böylece mach one aktüatörü çalışacaktır. Kültür plakasına bağlanan yükleme cihazı, altı numuneyi eş zamanlı olarak stimüle eden, yukarı ve aşağı hareket eden altı girintiye sahiptir.Uyarılmamış kontrol örnekleri de aynı kültür plakasındadır, ancak girintileri olan kuyucuklara yerleştirilmezler. Çalışma tamamlandığında, makine bip sesi çıkaracak ve aktüatör yüksüz referans durumuna dönecektir. Mekanik stimülasyon tamamlandıktan sonra, ara mesafe aparatını yerine yerleştirin.Sabitleme pini set vidasını gevşetin ve kompresyon düzeneği ile kültür plağını radyolabelleme işleminin yanındaki test sisteminden çıkarın; kondrosit spesifik kolajen sentezi için 5 µCi Tritium Prolene protein etiketi ve proteoglikan sentezi için S 35 kükürtü her bir hücre hidrojel konstrükt pipetine ekleyin, radyolabelenmiş konstrüktleri radyolabelenmiş hidrojel konstrüktleri hasat etmek için 37 °C'de, %5 CO2 ortamında 24 saat inkübe edin. Her bir hidrojel konstrüktü PBS içine daldırarak pens yardımıyla üç kez yıkayın. Bağlanmamış izotopları uzaklaştırmak için yıkanmış konstrüktü 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.Ardından, 1,5 mililitrelik tüplere 500 µL pape çözeltisi ekleyin. Tüpleri bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve 65 °C'de 72 saat boyunca sindirilmeye bırakın. Sindirim işlemi tamamlandığında, örnek nispeten berrak görünmelidir.Papel sindirimi hemen ardından, pico green D analiziyle DNA içeriğini belirlemek için her örnekten 100 µL'lik alikotlar alın. Ardından, beta sıvı sintilasyon sayımı ile yerleşmiş izotop aktivitesini belirlemek için her örnekten 100 µL'lik bir alikot alın. Elde edilen izotop aktivitesi, analiz için DNA içeriğine göre normalize edilmelidir.Mililitrede 10⁶ hücre kapsüllenecek şekilde %2 aros ile hazırlanan sığır eklem kondrositi aros hidrojel konstrüktleri; 1 Hz frekansta, %10 kompresyon gerinimi genliğinde 20 ila 60 dakika veya 1.200 ila 3.600 döngü boyunca mekanik olarak stimüle edilmiştir. Ardından, radyoizotop inkorporasyonu ile DNA içeriği ve hücre dışı matris sentezi analiz edilmiştir.Burada görülebileceği üzere, DNA ve hücre dışı matris sentezi doz bağımlı bir şekilde etkilenmiştir. DNA içeriği, 20 veya 30 dakikalık stimülasyon sonucunda 0,01'den küçük p değeri ile anlamlı düzeyde %35 azalma göstermiştir; 60 dakikalık stimülasyonun ise herhangi bir etkisi görülmemiştir. Kıkırdağa özgü kolajen ve proteoglikan sentezi sırasıyla trityum, prolin ve S 35 kükürt inklüzyonu ile belirlenmiştir.Bunlar, 20 veya 30 dakikalık stimülasyona yanıt olarak 0,01'den küçük bir p değeri ile yaklaşık %60 oranında önemli artışlar göstermiştir; 60 dakikalık stimülasyon ise gözlemlenebilir bir etki göstermemiştir. Bu videoyu izledikten sonra, dinamik baskı kullanarak hidrojel kültürlerinin mekanik olarak nasıl stimüle edileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalı ve bu protokolü benzer uygulamalarda kullanmak üzere uyarlayabilmelisiniz.

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sinovyal sıvıda yüksek düzeyde insan eklem kondrosit kültür 3D sistemi açıklanmıştır. Sinovyal sıvı eklem kıkırdağı için en doğal mikroçevresinin yansıtır ve kolayca elde ve saklanabilir. Bu sistem, böylece kıkırdak rejenerasyon eğitim ve artrit tedavisi için tarama terapötikler için kullanılabilir.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Biz eklem kıkırdağı kusur içine önce nakli için bir kıkırdak biokompozit için tek eksenli veya çift eksenli mekanik zorlanma uygulayabilirsiniz yeni bir mekanik yüklenme biyoreaktör tasarlanmıştır.

Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

Bir bioprinter bir kurban kalıp dayalı desenli hidrojeller oluşturmak için kullanıldı. Poloksamer kalıp ikinci bir hidrojel ile dolduruldu ve daha sonra üçüncü bir hidrojel ile doldurulmuş boşluklar bırakarak elüt edilmiştir. Bu yöntem Biyopolimerlerin karmaşık mimarileri oluşturmak için hızlı sağım ve poloksamerin iyi baskı kullanır.

Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Kıkırdak onarımı, karşılanmamış bir tıbbi zorluğu temsil eder ve insan eklem kıkırdağını tasarlamak için hücre temelli yaklaşımlar umut verici bir çözümdür. Burada, insan eklem kondrositlerinin genişlemesi ve olgunlaşması için ideal bir araç olarak üç boyutlu (3D) biyomimetik hidrojelleri tanımlıyoruz.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

poli (N-izopropil akrilamid) -graft-kondroitin sülfat oluşan enjekte edilebilir doku mühendisliği iskelesi (PNIPAAm-g-CS) içeren aljinat mikro hazırlandı. Özellikleri ve in vitro biyouyumluluk şişme yapışma mukavemeti, bu çalışmada incelenmiştir. Burada geliştirilen karakterizasyon teknikleri diğer thermogelling sistemleri için geçerli olabilir.

Doku Mühendisliği Aljinat mikropartiküllerin ile Thermogelling Poli (N-izopropil) -graft-kondroitin Sülfat Kompozitlerin Sentezi

Mekanik stres, kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını indükleyebilir ve bozulmuş kıkırdağın onarımı için potansiyel bir terapötik yaklaşım sağlar. Merkezkaç gravitesi (CG) kullanarak adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) kondrojenik farklılaşmasını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. SOX9'un CG kaynaklı yukarı regülasyonu, kondrojenik fenotiplerin gelişmesine neden olur.

Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Bu makalede, kondrosit sıkıştırma için pnömatik olarak mikroakışkan bir cihaz imal etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı yöntemler sağlanmıştır.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.

Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Öğrenin kondrositleri agaroz hidrojellerde dinamik mekanik basınç yüklemesiyle uygulamayı. Bu yöntem kollajen ve proteoglikan sentezi üzerindeki etkileri değerlendirerek kıkırdak metabolizmasını incelemeye yardımcı olur.

Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu

Daha fazla video keşfet